技术领域
本发明属于蛹虫草栽培技术领域，具体地，涉及一种蛹虫草子囊 孢子的收集和保存方法。
背景技术
蛹虫草Cordycepsmilitaris（L．exFr）Link，又名北冬虫夏草、 北虫草，寄生在鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫蛹体上。生长在低海 拔的平原地域，主要分布在东北、华北、西北等地。现代研究表明， 蛹虫草含有虫草素（3’-脱氧腺苷）、虫草酸（D-甘露醇）、腺苷、虫 草多糖、麦角甾醇、超氧化物歧化酶（SOD）、硒（Se）等化学成分。 具有提高人体免疫功能、抗癌、抗菌、抗疲劳、抗衰老、抗惊厥、耐 缺氧、镇静、壮阳固肾等作用。同时还具有减肥、瘦身、美容等功效。
近年来，很多研究都表明，人工栽培的蛹虫草化学成分及药理作 用与冬虫夏草相似，但价格却远远低于冬虫夏草，因此，蛹虫草的开 发应用具有极大的潜在市场。人工培养蛹虫草要得到子实体，关键是 该蛹虫草菌株要有形成子实体的能力，不同菌株所具备的遗传背景是 不一样的，所以它们具备形成的子实体的能力有差异。然而，在实际 生产中，即使是优势蛹虫草菌株，随着菌种传代、转接次数的增加或 保藏时间的延长，菌种资源极易退化。
孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培 养成菌种的方法。这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且 自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。目 前的孢子分离法主要有：（一）单孢分离法：是每次或每支试管只取 一个担孢子，让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。单孢分离生产 上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。（二）多孢分离 法是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得 食用菌纯菌种的一种方法。具体操作方法，有以下几种：1.种菇孢子 弹射法：选择适应性强的八九分成熟的种菇，菌柄用无菌水冲洗数遍 后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌 室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培 养皿上面；上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘 上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。形成一层 粉末状孢子印。用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿 上划线接种。待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌 落进行试管培养。还可用孢子采集器收集孢子。按上述程序，轻轻掀 开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿 正中央。随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。并在纱布上倒少 许升汞或无菌水。移入20℃左右恒温箱培养。2.褶上涂抹法：选择 成熟的种菇，用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体 尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。3.钩悬法：取成熟菌盖的 几片菌褶或一小块耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳），用无菌不锈钢 丝（或铁丝、棉线等其他悬挂材料）悬挂于三角瓶内的培养基的上方， 勿使接触到培养基或四周瓶壁。置适宜温度下培养、转接即可。4. 贴附法：将成熟的菌褶或耳片取一小块，用溶化的琼脂培养基或阿拉 伯胶、浆糊等贴附在配管斜面培养基正上方的试管壁上。经6～12小 时的培养，待孢子落在斜面上，立即把孢子连同部分琼脂培养基移植 到新的试管中培养即可。孢子分离得到的母种、进一步提纯复壮， 当母种定植一周左右，菌丝布满斜面时，选择菌丝健壮、生长旺盛无 老化、无感染杂茵的母种试管，进而转管扩大。孢子分离得到的母种， 必须通过出菇试验，鉴定为优质菌种后，才可供生产使用。上述方法 存在两个不足：第一，操作复杂。第二，只能收集成熟的被弹射出的 孢子，而成熟的却没被弹射出的成熟孢子却不能收集到。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛹虫草子囊孢子的收集和保存方法，以 克服上述不足。
为了实现本发明目的，本发明的一种蛹虫草子囊孢子的收集方 法，其包括如下步骤：
1）将沙子放入能封口的多孢分离收集容器中，灭菌、干燥；
2）蛹虫草子囊果发育成熟的子实体放入步骤1）中的多孢分离收 集容器中；
3）振荡多孢分离收集容器，收集含有弹射出的成熟的子囊孢子 和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子。
其中，所述步骤1）沙子为中性干燥沙子，其通过如下方法获得：
a）将河沙过60目筛，弃去大颗粒及杂质；
b）再用80目过筛，弃去细沙，收集未过筛的沙子；
c）去除沙子中的铁质；
d）用10%-20%的盐酸浸泡沙子24h后，倒去盐酸，用水洗泡至 中性，烘干沙子。
进一步地，步骤c）中可使用吸铁石除去沙子中的铁质。
本发明使用的多孢分离收集容器，可以为任意形状的可密封的玻 璃容器或金属容器。
其中，步骤1）所述的沙子放入能封口的多孢分离收集容器中的 放置方法是将等质量的沙子与蒸馏水混合后，按体积比1:3-10置于多 孢分离收集容器中。
其中，步骤1）所述的灭菌是121℃，湿热灭菌30min。
其中，步骤1）所述的干燥是80℃干燥24-48h。
上述灭菌和干燥的步骤中，多孢分离收集容器均严格封口进行灭 菌和干燥。
其中，步骤2）蛹虫草子囊果发育成熟的子实体优选1-2cm子囊果 丰富的子实体头部，放入步骤1）中的多孢分离收集容器中，室温放 置10-30天，至子实体完全干燥。
其中，步骤2）所述的子实体放入多孢分离收集容器中，放入的 子实体条数与容器中沙子的个数质量比为1条：2.5-5g。
在本发明提供的蛹虫草子囊孢子收集方法的步骤2）中，室温放 置10-30天，直至子实体完全干燥。在这期间，一部分成熟的子囊果 会自然弹射子囊孢子到细沙上，有部分成熟的子囊果尚未弹射子囊孢 子就干燥了，还有一部分未完全成熟的子囊果没有进入弹射时期，子 囊孢子仍然保留在干燥的子囊果内。
其中，步骤3）所述的振荡是将多孢分离收集容器以80-200r/min 转速振荡24-48h。
本发明提供的一种蛹虫草子囊孢子的收集方法还包括将干燥的 子实体取出。
本发明还提供一种蛹虫草子囊孢子的保存方法，将上述方法获得 的含有弹射出的成熟的子囊孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙 子置于干燥无菌容器中密封保藏。
进一步地，本发明保存蛹虫草子囊孢子的保藏条件为室温避光或 0-6℃冷藏。
本发明提供了蛹虫草子囊孢子收集方法在蛹虫草育种中的应用。
本发明利用细沙的摩擦作用，当干燥的成熟的子囊果和未成熟的 子囊果受到到细沙的摩擦作用从而破碎并释放其中的子囊孢子，落入 沙子载体中。通过收集肉眼可视的沙子，从而收集到肉眼不可见的蛹 虫草子囊孢子，因此本方法不仅能够收集到弹出的子囊孢子，还能收 集到未弹出的子囊孢子，子囊孢子的收集率达到100%，提高了子囊 孢子的收集效率。而现有技术中采用弹射方法收集的子囊孢子只是子 囊果成熟后弹射出的部分子囊孢子，子囊孢子数量不到子实体子囊果 中所有子囊孢子总量的1%。本发明进一步将干燥的子实体取出，将 子囊孢子活化或保存备用，最终实现了蛹虫草子囊孢子的分离、收集 和保藏的目的。本发明提供的蛹虫草子囊孢子收集方法操作简单，节 省人力物力，同时提高了子囊孢子的收集率，提供的蛹虫草子囊孢子 保存方法能在2-4年内有效保持子囊孢子的生物活性，保持了原始亲 本的遗传性状，为选育新菌种提供有效方法，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的 限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。
实施例1蛹虫草子实体的培养
1、菌种：采用自主筛选获得的菌株编号为HX-64蛹虫草菌株（购自 北京市农林科学院生物中心）。
2、液体摇瓶用培养基（1L）：去皮土豆300g（煮汁）、葡萄糖10g、 蛋白胨2g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁1g、水1000ml，pH7.2。
3、子实体生产营养液：黄豆2%、葡萄糖1%、奶粉5%、磷酸二氢 钾0.5%、硫酸镁0.05%、维生素B110mg/1000ml的比例配成营养液， 调整pH在5.6～7.2。
4、采用PP料制成的培养盒（高10cm，上底直径12cm，下底直径 8cm）。每盒大米40g和子实体生产营养液56g分装混合，灭菌接种。
5、菌丝培养管理
培养室适宜温度为18～25℃，湿度为70～85％，避光培养8天。 菌丝布满表面后开始通风培养。
6、子实体培养
在按种后待菌丝布满整个培养容器并深扎到容器底，开始见光， 但避免太阳光直射。若培养室光线太暗，可补充日光灯照。菌丝见光 后，在培养料表面或四周见有桔黄色色素形成，并出现米粒状的桔黄 色菌蕾，菌蕾伸长后即成为子实体。子实体培育阶段，温度应为20～ 23℃，超过25℃生长缓慢，湿度应提高到80～85%。超过27℃菌丝 萎缩不能出菌束。在子实体培养后期，逐渐加大室内空气的流通和交 换，培养室培养阶段若发现污染应立即清除。
7、采收：采后后平均鲜重达到28.7克/培养盒。
实施例2蛹虫草子囊孢子的收集和保存（1）
（1）多孢载体吸附沙的准备：
将河沙用60目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉 细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用10%盐酸浸泡，24小时后 倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干。
（2）多孢收集容器的灭菌及干燥处理：
取处理好的多孢载体吸附沙约25g与等量蒸馏水混合后放入 250mL三角瓶中，然后整体121℃湿热灭菌30min。灭菌后放入干燥箱 中80℃干燥24小时直至完全干燥。
（3）多孢分离亲本子实体的选择：
选取实施例1中的正在栽培瓶中生长后期的没有受到污染的，子 实体生长周期短、条形整齐，粗细均匀、颜色橘红、子囊果发育成熟 的栽培瓶经过瓶表面消毒后放入超净工作台。
（4）多孢的收集：
选取子囊果发育成熟的子实体经过无菌操作将子囊果丰富的头 部用剪刀切取1cm，放入灭菌干燥过的多孢分离收集瓶中，每瓶收集 5条。
室温放置10天，直至子实体完全干燥。在这期间，一部分成熟的 子囊果会自然弹射子囊孢子到细沙上，有部分成熟的子囊果尚未弹射 子囊孢子就干燥了，还有一部分未完全成熟的子囊果没有进入弹射时 期，子囊孢子仍然保留在干燥的子囊果内。
静止干燥结束后,将多孢分离收集瓶放入摇床，以80r/min的转速 进行震荡24小时。
由于细沙的摩擦作用，干燥的成熟的子囊果和未成熟的子囊果收 到细沙的摩擦作用从而破碎进而释放其中的子囊孢子。然后将干燥的 子实体部分取出，收集含有弹射出的成熟的子囊孢子和未弹射出的成 熟的子囊孢子的沙子。最终实现了蛹虫草子囊孢子的分离、收集的目 的。本实施例可收集到子实体上子囊果内的全部子囊孢子，收集率为 100%。
（5）多孢的保存
小试管用160℃2小时干热灭菌，将收集的含有弹射出成熟的子囊 孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子分装于小试管中，然后用固 体石蜡封口，防止水分进入，室温避光保存2年。
实施例3蛹虫草子囊孢子的收集和保存（2）
（1）多孢载体吸附沙的准备：
将河沙用60目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉 细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用15%盐酸浸泡，24小时后 倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干。
（2）多孢收集容器的灭菌及干燥处理：
取处理好的多孢载体吸附沙约50g与等量蒸馏水混合后放入250 mL三角瓶中，然后整体121℃湿热灭菌30min。灭菌后放入干燥箱中 80℃干燥48小时直至完全干燥。
（3）多孢分离亲本子实体的选择：
选取实施例1中正在栽培瓶中生长后期的没有受到污染的，子实 体生长周期短、条形整齐，粗细均匀、颜色橘红、子囊果发育成熟的 栽培瓶经过瓶表面消毒后放入超净工作台。
（4）多孢的收集：
选取子囊果发育成熟的子实体经过无菌操作将子囊果丰富的头 部用剪刀切取2cm，放入灭菌干燥过的多孢分离收集瓶中，每瓶大约 收集10条。
室温放置30天，直至子实体完全干燥。在这期间，一部分成熟的 子囊果会自然弹射子囊孢子到细沙上，有部分成熟的子囊果尚未弹射 子囊孢子就干燥了，还有一部分未完全成熟的子囊果没有进入弹射时 期，子囊孢子仍然保留在干燥的子囊果内。
静止干燥结束后,将多孢分离收集瓶放入摇床，以200r/min的转速 进行震荡48小时。
由于细沙的摩擦作用，干燥的成熟的子囊果和未成熟的子囊果收 到细沙的摩擦作用从而破碎进而释放其中的子囊孢子。然后将干燥的 子实体部分取出，收集含有弹射出的成熟的子囊孢子和未弹射出的成 熟的子囊孢子的沙子。最终实现了蛹虫草子囊孢子的分离、收集的目 的。本实施例可收集到子实体上子囊果内的全部子囊孢子，收集率为 100%。
（5）多孢的保存
小试管用160℃2小时干热灭菌，将收集的含有弹射出成熟的子 囊孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子分装于小试管中，然后用 固体石蜡封口，防止水分进入，保藏条件为0℃冷藏4年。
实施例4蛹虫草子囊孢子的收集（3）
（1）多孢载体吸附沙的准备：
将河沙用60目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉 细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用20%盐酸浸泡，24小时后 倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干。
（2）多孢收集容器的灭菌及干燥处理：
取处理好的多孢载体吸附沙约50g与等量蒸馏水混合后放入500 mL三角瓶中，然后整体121℃湿热灭菌30min。灭菌后放入干燥箱中 80℃干燥38小时直至完全干燥。
（3）多孢分离亲本子实体的选择：
选取实施例1中正在栽培瓶中生长后期的没有受到污染的，子实 体生长周期短、条形整齐，粗细均匀、颜色橘红、子囊果发育成熟的 栽培瓶经过瓶表面消毒后放入超净工作台。
（4）多孢的收集：
选取子囊果发育成熟的子实体经过无菌操作将子囊果丰富的头 部用剪刀切取2cm，放入灭菌干燥过的多孢分离收集瓶中，每瓶大约 收集8条。
室温放置25天，直至子实体完全干燥。在这期间，一部分成熟的 子囊果会自然弹射子囊孢子到细沙上，有部分成熟的子囊果尚未弹射 子囊孢子就干燥了，还有一部分未完全成熟的子囊果没有进入弹射时 期，子囊孢子仍然保留在干燥的子囊果内。
静止干燥结束后,将多孢分离收集瓶放入摇床，以150r/min的转速 进行震荡40小时。
由于细沙的摩擦作用，干燥的成熟的子囊果和未成熟的子囊果收 到细沙的摩擦作用从而破碎进而释放其中的子囊孢子。然后将干燥的 子实体部分取出，收集含有弹射出的成熟的子囊孢子和未弹射出的成 熟的子囊孢子的沙子。最终实现了蛹虫草子囊孢子的分离、收集的目 的。本实施例可收集到子实体上子囊果内的全部子囊孢子，收集率达 到100%。
（5）多孢的保存
小试管用160℃2小时干热灭菌，将收集的含有弹射出成熟的子囊 孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子分装于小试管中，然后用固 体石蜡封口，防止水分进入，保藏条件为6℃冷藏3年。
实施例5收集保存的蛹虫草子囊孢子的活化和培养
分别取实施例2-4收集和保存的蛹虫草子囊孢子，在无菌条件下 打开多孢保藏管，取部分沙粒于PDA斜面培养基上，长出菌落后再转 接一次。或取沙粒于适宜的液体培养基（1L液态培养基的配方为去皮 土豆300g（煮汁）、葡萄糖10g、蛋白胨2g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁 1g、水1000ml）中，增殖培养后直接做出菇实验或再转接斜面。
实施例2-4保存的蛹虫草子囊孢子活化后，按照实施例1记载的方 法进行蛹虫草子实体的培养。培养结果发现，实施例2-4保存的蛹虫 草子囊孢子均能培养得到子实体，采后后平均鲜重分别达到28.7、 28.9、28.8克/培养盒，子实体的产量和生物性状与实施例1培养得到 的子实体均无显著差异，说明本发明收集和保存蛹虫草子囊孢子的方 法能够保留亲本遗传性状。本实施例结果说明：上述实施例2-4中的 收集的蛹虫草子囊孢子在室温或普通冰箱条件下菌种保存2-4年仍具 有生物活性，且子实体产量和生物转化率无显著差异，基本保留了原 始亲本的遗传性状。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。