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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610127648.4 (22)申请日 2016.03.08 (71)申请人 大连大学 地址 116622 辽宁省大连市金州新区学府 大街10号 (72)发明人 张静莹 (74)专利代理机构 大连八方知识产权代理有限 公司 21226 代理人 卫茂才 (51)Int.Cl. C12N 5/074(2010.01) A61L 27/38(2006.01) A61L 27/46(2006.01) A61L 27/54(2006.01) (54)发明名称 牙髓干细胞、 制备方法及。
2、其相关骨组织工程 材料 (57)摘要 本发明属于医药生物领域， 具体涉及一种牙 髓干细胞、 制备方法及其相关骨组织工程材料。 牙髓干细胞的制备方法如下： 取牙髓组织， 剪碎 后加入组织消化液， 37， 200rpm消化10-20min， 无血清培养基终止消化， 吹打离散细胞团块获得 单个离散的细胞， 2000rpm离心5min， 弃上清， 无 血清培养基清洗两次， 再加入无血清培养基重悬 细胞并调整细胞密度至1103个/ml， 于37、 湿 度为95的二氧化碳培养箱中培养， 当细胞生长 至80-90融合时， 用分离消化液消化细胞后 用无血清培养基传代培养。 权利要求书1页 说明书4页 CN 1。
3、05754934 A 2016.07.13 CN 105754934 A 1.一种牙髓干细胞的制备方法， 具体步骤如下： 取牙髓组织， 剪碎后加入组织消化液， 37， 200rpm消化10-20min， 无血清培养基终止 消化， 吹打离散细胞团块获得单个离散的细胞， 2000rpm离心5min， 弃上清， 无血清培养基清 洗两次， 再加入无血清培养基重悬细胞并调整细胞密度至1103个/ml， 于37、 湿度为 95的二氧化碳培养箱中培养， 当细胞生长至80-90融合时， 用分离消化液消化细胞后 用无血清培养基传代培养。 2.根据权利要求1所述的牙髓干细胞的制备方法， 其特征在于， 所述组织消化。
4、液为含 1g/L胰酶和0.5g/L木瓜蛋白酶的D-Hanks液， pH值为7.4， 所述组织消化液与牙髓组织的体 积重量比为1016ml： 1g。 3.根据权利要求1所述的牙髓干细胞的制备方法， 其特征在于， 所述分离消化液为含 1g/L胰酶的D-Hanks液， pH值为7.4。 4.根据权利要求1所述的牙髓干细胞的制备方法， 其特征在于， 所述无血清培养基为含 IGF1-10ug/L， 神经肽Y1-20ng/L， 异荭草素1-20ug/L， 连翘苷1-20ug/L和地塞米松1-20mM 的MEM培养基。 5.根据权利要求4所述的牙髓干细胞的制备方法， 其特征在于， 所述无血清培养基为含 IG。
5、F5ug/L， 神经肽Y15ng/L， 异荭草素5ug/L， 连翘苷8ug/L和地塞米松5mM的MEM培养基。 6.一种权利要求1-5所述的牙髓干细胞的制备方法制备的牙髓干细胞， 所述牙髓干细 胞几乎不表达造血系统所特有的标记物CD31和CD34； 而对间充质干细胞所特有的表面标记 物CD90及CD105具有较高的表达率。 7.一种负载权利要求1-5任一项所述牙髓干细胞的复合骨支架材料的制备方法， 具体 步骤如下： 1） 制备牙髓干细胞悬液； 2） 将骨支架材料浸入牙髓干细胞悬液中， 即得复合骨支架材料。 8.根据权利要求7所述的制备方法， 其特征在于， 所述骨支架材料的制备方法为： 将壳 聚。
6、糖溶于2%的醋酸溶液中， 搅拌至壳聚糖完全溶解， 过滤得重量2%壳聚糖的溶液； 然后向溶 液中添加羟基磷灰石和 -磷酸三钙的水悬浮液， 充分搅拌24h， 陈化1天， 过滤得沉淀， 通过 热压成型机在70和12MPa的条件下压制5min使其成型， 即得骨支架材料， 进一步地， 所述 壳聚糖、 羟基磷灰石和 -磷酸三钙的重量比为50： 15： 35。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105754934 A 2 牙髓干细胞、 制备方法及其相关骨组织工程材料 技术领域 0001 本发明属于医药生物领域， 具体涉及一种牙髓干细胞、 制备方法及其相关骨组织 工程材料。 背景技术 0002 由于各种原因导。
7、致的牙体缺损和牙齿缺失已成为危害口腔乃至人体健康的主要 疾病， 其发病率逐年增加。 目前主要是借助于各种牙科材料充填来应对牙齿缺损疾病， 虽然 在一定程度上能阻止病变的继续发展， 但却不能解决根本问题。 对于牙齿缺失尽管解决途 径很多， 但最有效和最根本的办法还是牙齿生物性再生。 0003 随着组织再生医学的快速发展， 为牙体缺损和牙齿缺失的有效治疗带来了希望。 目前已有许多研究利用牙源性上皮和牙源性间充质的相互作用再生出了牙齿组织。 常用的 牙源性间充质包括牙乳头细胞和牙髓组织细胞。 由于牙乳头细胞在临床上难以获得， 因此， 目前用于牙体及牙齿再生的种子细胞首选是牙髓组织来源的细胞， 其中最。
8、重要的是牙髓干 细胞。 0004 2000年首次发现了牙髓干细胞， Gronthos等发现在离体的乳牙和智齿中都存在 牙髓干细胞。 这是一类具有高增殖能力、 高度自我更新能力、 多项分化能力的细胞。 已有研 究利用该细胞成功地构建牙髓、 牙本质以及牙齿组织。 牙髓干细胞(dentalpulpstem cell， DPSC)与其他组织来源的干细胞在生物学特性上有很多相似之处。 Gronthos等对牙 髓干细胞的克隆形成率进行了研究， 与骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcell， BMSC)比较后发现： 牙齿来源的DPSC的克隆形成率明显高于骨髓来源的BMSC， 这就表明 DPS。
9、C具有较BMSC更高的增生能力和自我更新能力。 且牙髓干细胞在成脂、 成软骨和成神经 诱导方面均有研究证实牙髓干细胞具有多向分化的潜能， 为其在体内植入牙髓干细胞使受 损或衰退的组织、 器官改善或恢复功能提供了理论依据。 发明内容 0005 本发明的一个目的是提供一种牙髓干细胞的制备方法， 具体步骤如下： 取牙髓组织， 剪碎后加入组织消化液， 37， 200rpm消化10-20min， 无血清培养基终止 消化， 吹打离散细胞团块获得单个离散的细胞， 2000rpm离心5min， 弃上清， 无血清培养基清 洗两次， 再加入无血清培养基重悬细胞并调整细胞密度至1103个/ml， 于37、 湿度为 。
10、95的二氧化碳培养箱中培养， 当细胞生长至80-90融合时， 用分离消化液消化细胞后 用无血清培养基传代培养。 0006 在本发明的一个实施方案中， 所述组织消化液为含1g/L胰酶和0.5g/L木瓜蛋白酶 的D-Hanks液， pH值为7.4。 所述组织消化液与牙髓组织的体积重量比为1016ml： 1g。 所述 分离消化液为含1g/L胰酶的D-Hanks液， pH值为7.4。 0007 在本发明的另一个实施方案中， 所述无血清培养基为含IGF1-10ug/L， 神经肽Y 1-20ng/L， 异荭草素1-20ug/L， 连翘苷1-20ug/L和地塞米松1-20mM的MEM培养基。 在进一步 说明。
11、书 1/4 页 3 CN 105754934 A 3 地实施方案中， 所述无血清培养基为含IGF5ug/L， 神经肽Y15ng/L， 异荭草素5ug/L， 连翘 苷8ug/L和地塞米松5mM的MEM培养基。 0008 本发明的另一个目的是提供上述制备方法制备的牙髓干细胞， 所述牙髓干细胞几 乎不表达造血系统所特有的标记物CD31和CD34； 而对间充质干细胞所特有的表面标记物 CD90及CD105具有较高的表达率。 0009 本发明的目的之三是提供负载上述牙髓干细胞的复合骨支架材料的制备方法， 具 体步骤如下： 1） 制备牙髓干细胞悬液； 2） 将骨支架材料浸入牙髓干细胞悬液中， 即得复合骨支。
12、架材料。 0010 在本发明的一个实施方案中， 所述骨支架材料的制备方法为： 将壳聚糖溶于2%的 醋酸溶液中， 搅拌至壳聚糖完全溶解， 过滤得重量2%壳聚糖的溶液； 然后向溶液中添加羟基 磷灰石和 -磷酸三钙的水悬浮液， 充分搅拌24h， 陈化1天， 过滤得沉淀， 通过热压成型机在 70和12MPa的条件下压制5min使其成型， 即得骨支架材料。 进一步地， 所述壳聚糖、 羟基磷 灰石和 -磷酸三钙的重量比为50： 15： 35。 0011 在本发明的另一个实施方案中， 所述牙髓干细胞悬液的制备方法为： 取牙髓组织， 剪碎后加入组织消化液， 37， 200rpm消化10-20min， 无血清培。
13、养基终止消化， 吹打离散细 胞团块获得单个离散的细胞， 2000rpm离心5min， 弃上清， 无血清培养基清洗两次， 再加入无 血清培养基重悬细胞并调整细胞密度至1103个/ml， 于37、 湿度为95的二氧化碳培养 箱中培养， 当细胞生长至80-90融合时， 用分离消化液消化细胞后用无血清培养基传代 培养， 培养至第3代时收集牙髓干细胞， 用无血清培养基配置成1105个/ml的牙髓干细胞 悬液。 在进一步地实施方案中， 所述无血清培养基为含IGF5ug/L， 神经肽Y15ng/L， 异荭草 素5ug/L， 连翘苷8ug/L和地塞米松5mM的MEM培养基。 所述组织消化液为含1g/L胰酶和0。
14、.5g/ L木瓜蛋白酶的D-Hanks液， pH值为7.4。 所述组织消化液与牙髓组织的体积重量比为10 16ml： 1g。 所述分离消化液为含1g/L胰酶的D-Hanks液， pH值为7.4。 具体实施方式 0012 下面将进一步的详细说明本发明。 需要指出的是， 以下说明仅仅是对本发明要求 保护的技术方案的举例说明， 并非对这些技术方案的任何限制。 本发明的保护范围以所附 权利要求书记载的内容为准。 0013 实施例1牙髓干细胞培养 用无菌镊子夹取牙髓组织， 切除根尖部1mm的牙髓组织； 用眼科弯剪将牙髓组织剪成 1mm3， 置于50mL离心管中， 加入13ml的组织消化液 （含1g/L胰。
15、酶和0.5g/L木瓜蛋白酶的D- Hanks液， pH值为7.4） ， 封口后充分混合均匀， 转移至恒温空气摇床中， 37、 200rpm消化 15min； 加入等体积的无血清培养基反复吹打离散细胞团块， 通过70 m的细胞筛网过滤， 2000rpm离心3min； 利用PBS清洗12次， 沉淀用无血清培养基 （含IGF5ug/L， 神经肽Y 15ng/L， 异荭草素5ug/L， 连翘苷8ug/L和地塞米松5mM的MEM培养基， 下同） 重悬， 以1103 个/ml接种培养皿中， 混匀细胞悬液， 放于37、 湿度为95的二氧化碳培养箱中培养； 24h 后换液去除未贴壁细胞， 然后每3天换液1次，。
16、 当细胞生长至8090汇合时， 分离消化液 （含1g/L胰酶的D-Hanks液， pH值为7.4） 消化细胞， 进行传代培养。 说明书 2/4 页 4 CN 105754934 A 4 0014 实施例2 按照实施例1的培养方法， 在P1代时， 采用台盼蓝染色进行细胞活力和浓度测定， 具体 为用0.1%胰酶消化液收集培养皿中的牙髓干细胞 （每个培养皿中原始铺入10000个牙髓干 细胞） ， PBS清洗， 然后用0.4%的台盼蓝溶液进行染色， 计算各培养皿中活细胞个数 （平行试 验三次） ， 并通过流式细胞仪检测标记物CD31、 CD34、 CD90及CD105。 0015 结果如下： 对比例1。
17、的培养方法同实施例1， 区别仅在于对比例1的组织消化液为含1.5g/L胰酶的 D-Hanks液， pH值为7.4； 对比例2的培养方法同实施例1， 区别仅在于对比例2的组织消化液为含1.5g/LI型胶 原酶的D-Hanks液， pH值为7.4； 对比例3的培养方法同实施例1， 区别仅在于对比例3的无血清培养基为含IGF5ug/L， 神经肽Y15ng/L和地塞米松5mM的MEM培养基 对比例4的培养方法同实施例1， 区别仅在于对比例4的无血清培养基为含IGF5ug/L， 神经肽Y15ng/L， 异荭草素13ug/L和地塞米松5mM的MEM培养基 对比例5的培养方法同实施例1， 区别仅在于对比例5。
18、的无血清培养基为含IGF5ug/L， 神经肽Y15ng/L， 连翘苷13ug/L和地塞米松5mM的MEM培养基 对比例6的培养方法同实施例1， 区别仅在于对比例5的无血清培养基为中国专利 CN201510095430说明书实施例1中公开的无血清培养基： SITE100*(sigma)10ml、 抗坏血酸 300mM、 PDGF5ug、 氢化可的松5ug、 EGF3ng、 b-FGF、 3ng、 PTH100ng、 地塞米松10mM、 IMDM余 量 经流式细胞仪检测， 各组干细胞均表现出牙髓干细胞的标记物特征， CD31和CD34的表 达率低于0.5%； CD90及CD105的表达率均高于98。
19、%。 0016 实施例3成骨分化能力鉴定 分别取P3代生长良好接近汇合的实施例1获得的牙髓干细胞， 用胰酶消化后用无血清 培养基 （实施例1） 制成细胞悬液后计数。 调整细胞密度为1105/mL， 2mL/孔置入6孔板中。 待细胞长至80融合时， 弃去培养液， 换为成骨诱导培养基 （DMEM培养液， 甘油磷酸钠， 维生 素C和地塞米松） 。 连续诱导， 每3天更换一次诱导液， 在第28天停止诱导， 收集细胞， 裂解提 说明书 3/4 页 5 CN 105754934 A 5 取蛋白测定碱性磷酸酶， 吸取培养基测定骨钙素 （按照市售试剂盒的方法测定， 每组测定5 个样本） 。 0017 结果如下。
20、： 实施例4负载牙髓干细胞的骨支架材料制备 将50g壳聚糖溶于2%的醋酸溶液中， 搅拌至壳聚糖完全溶解， 过滤得重量2%壳聚糖的溶 液； 然后向溶液中滴加到含15g羟基磷灰石和35g -磷酸三钙的水悬浮液中， 充分搅拌24h， 陈化1天， 过滤得沉淀， 通过热压成型机在70和12MPa的条件下压制5min使其成型， 即得骨 支架材料。 0018 将骨支架材料放入含1106/ml牙髓干细胞的无血清培养基悬液中 （实施例1P3代 细胞） ， 静置24h， 然后将骨支架材料转移至6孔培养皿中用无血清培养基 （实施例1） 进行培 养， 每隔3天换液一次， 培养2周后， 胰酶消化骨支架材料上的细胞， 台。
21、盼蓝染色检测细胞活 性， 结果表明， 牙髓干细胞在骨支架材料上生长良好 （细胞活性率为99%） ， 并且出人意料的 是， 在没有成骨诱导剂的条件下， 骨支架上的牙髓干细胞表现出明显的成骨分化特性 （茜素 红染色发现明显的钙结节， 碱性磷酸酶含量为10113U/g； 培养基中骨钙素含量为0.15 0.03） 。 0019 本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案， 其中一个或更多个技 术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合， 这些经组合而得到 的技术方案也在本申请保护范围内， 就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开 内容中具体记载一样。 说明书 4/4 页 6 CN 105754934 A 6 。