梭状芽孢杆菌属微生物毒素的解毒剂 【技术领域】
本发明涉及梭状芽孢杆菌属微生物毒素的解毒剂。更详细地说，本申请发明涉及含有梭状芽孢杆菌属微生物毒素的中和剂和含有此中和剂的药物或者饮食品。
背景技术
茶作为一种在全世界广受欢迎的饮料，自古以来就被认为具有各种各样的药效。近年来随着追求健康的潮流的来临，其功效更加倍受瞩目，在化学、医药等领域也掀起了一股研究热潮。
茶，有绿茶、乌龙茶、红茶等许多种，但总的来说，所有的茶叶都是由一种叫Camellia sinensis(L)O.Kuntze的山茶科山茶属多年生常绿树而来的，只是由于加工方法的不同而叫法不同而已。
茶叶中含有许多成分，如蛋白质、游离氨基酸、咖啡因、生物碱类、多酚类、碳水化合物、有机酸类、脂肪、叶绿素和类胡萝卜素等色素、维生素类等各种有机物，以及水溶性、不溶性的无机成分等。这些成分因为茶叶的加工方法的不同会发生很大的变化，而且经热水提取出来的成分以及散发的香气中含有的成分还有很多种。
茶中含有一种多酚类成分——儿茶酸类以及使其氧化的多酚氧化酶等酶类，在茶叶的加工过程中，如果首先加热，就会使酶的活性消失，得到的就是绿茶。反之，由于酶的作用，儿茶酸类充分氧化，得到的就是红茶。
绿茶被称为非发酵茶，就是先将茶叶用水蒸汽或锅中翻炒的方法进行加热，使多酚氧化酶等酶类失去活性，然后干燥而得。绿茶中所含主要成分为茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸类、棓酸表棓儿茶酯、棓酸表儿茶酯、表棓儿茶酚、表儿茶酸等儿茶酸类、咖啡因、蔗糖、葡萄糖、果糖等糖类、还有使茶叶呈现绿色的叶绿素等，这些成分的含量不同，茶的色、香、味的浓淡也就相应变化。还有，构成绿茶香气的成分包括二甲基硫醚、苯乙醇、苄醇、β-紫罗兰酮、橙花叔醇、4-乙烯基苯酚、吡嗪类、吡咯类等多种化合物。
而红茶被称为发酵茶，将茶叶铺开、在低温下使水分蒸发，提高酶的活性，使叶片柔软，将儿茶酸等成分挤压出，然后晾晒在空气中，促进其氧化，得到的就是红茶。表儿茶酸、表棓儿茶酚等儿茶酸类化合物被多酚氧化酶氧化而形成的茶黄素，或者再进一步氧化聚合而形成的茶玉红精，还有氧化聚合进一步进行生成的高分子量的氧化聚合物等，这些色素成分就形成红茶特有的红褐色。
另外，虽然生茶叶中仅含有极少量的醇类，但经过加工，由里那醇、香茅醇、水杨酸甲酯、紫罗兰酮系列化合物、内酯、糖和氨基酸而生成的香气成分、反式-2-乙烯醛等明显增多。
其他还有绿茶经二次加工而得的煎茶和黑茶、以半发酵茶闻名的乌龙茶、各种植物混合而得的等等多种多样的茶，各种茶所含成分、热水冲泡而出的成分、香气成分都不尽相同，其功效受到了广泛关注，研究很热门。
其中，儿茶酸、单宁和单宁酸等多酚类物质最近被科学证明具有抗氧化作用、抗菌作用、抑制胆固醇和血脂升高、抑制血压上升、抑制血糖升高、以及抗肿瘤作用等各种功效，人们正在研究开发含有儿茶酸和单宁的健康食品、饮料、医药品、除臭剂、抗菌剂等各种商品。
但是，人们对儿茶酸和单宁以外的许许多多成分还知之甚少，特别是在抗菌性方面，是茶中何种成分对哪种微生物或毒素起作用还不了解。因此，现在实际上人们还仅限于知道绿茶的抗菌性能最高，还不明确对特定的细菌显示出中和效果的成分。
现已知道在人体中的各种有害微生物中，肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)和破伤风菌(Clostridium tetani)均为广泛分布于土壤中的厌氧菌，为梭状芽孢杆菌属微生物，其产生的毒素分子量与其大致相等，非常类似。这些梭状芽孢杆菌属微生物的毒素作用于运动神经骨骼肌系统，可使其麻痹，致死率极高，因此要注意避免感染。
肉毒梭状芽孢杆菌可以形成特别耐热和耐消毒药的孢子，在食品等中，在3～～40℃、pH4.5以上的环境中，在无氧、有水分和营养的条件下生长，产生毒素。虽然细菌的潜伏期为12～～36个小时，但是其产生的毒素具有强烈的神经毒性，人体一旦吸收，就有无力和眩晕感，表现出恶心呕吐的胃肠道疾病症状，然后出现头痛、视力模糊、喝东西困难和走路困难等神经障碍，严重的情况下还会引起呼吸困难导致死亡。
在日本，尤以咸鱼饭团引起的事件多，而最近由进口瓶装食品、罐头、火腿和香肠等引起的事件也时有发生，对出现症状的治疗采用给予肉毒梭状芽孢杆菌抗毒素的方法。
而破伤风菌为革兰氏阳性厌氧菌，不仅土壤中和水中，在人体肠道内也常有存在，但如果通过交通事故引起的受伤、竹子、木片和锈钉等引起的扎伤等受污染的外伤进入人体，就会产生毒素，释放到血液中。破伤风菌的潜伏期一般为1～2周，一旦产生毒素，就会开始出现牙关紧闭和痉笑等神经麻痹症状，接着引起全身肌肉痉挛和僵硬，造成呼吸困难而死亡。一旦发病，70～80％肯定死亡。所以是一种致死率非常高的毒素。
预防破伤风，预防接种是最有效的方法，已被推广实行。目前也接种混合疫苗，但成年人一般接种破伤风类毒素。但是，不仅需要再次接种，而且再次接种的5年以后被感染地情况下，一定要接受破伤风类毒素皮下注射接种。所以总的来说接受接种的人不多。
因此，即使被这种梭状芽孢杆菌属微生物感染，现实生活中是在出现了毒素引起的症状后才会被发现，于是医生就要进行紧急处理，而患者就会处于非常危险的状态。
还有，尤其是在食品加工行业，食物中毒是最令人担心的，目前也在进行各种杀菌、消毒方法的研究和实施。但正如前文所述，肉毒梭状芽孢杆菌只在经过长时间高温处理后毒性才会消失，而实际上，某些食品不可能进行这样的处理，尤其是作为储藏食品生产的瓶装食品和罐头食品等，它们的厌氧性环境是最受肉毒梭状芽孢杆菌欢迎的，所以预防起来非常困难。
虽然各种各样的解毒剂或消毒剂正在研究开发中，但问题是，对这类毒素作用强而有效性又高的解毒剂或消毒剂，其中大部分对人体也十分有害。尤其是近年来因为过敏等方面的问题，社会上越来越多的人厌恶食品添加剂，喜欢少放添加剂或不含添加剂的食品。
如何安全、简单、有效地中和或除去梭状芽孢杆菌属微生物和由此微生物产生的具有强烈毒性的神经毒素，人们目前还一无所知。
于是，本申请发明的课题是鉴于以上情况，力求提供一种解决以往技术上的问题、以茶叶提取成分为有效成分、使用安全简便、梭状芽孢杆菌属微生物所产生毒素的解毒剂。
发明的公开
本发明就解决以往技术存在的问题，提供以下发明。
即，第1，本申请发明提供梭状芽孢杆菌属微生物毒素解毒剂，其特征在于至少含有茶玉红精作为有效成分。
第2，本申请发明提供如上述第1发明所述的梭状芽孢杆菌属微生物毒素解毒剂，其特征在于茶玉红精是茶叶褐色色素成分中的至少一种。
第3，本申请发明提供如上述第1、2发明所述的梭状芽孢杆菌属微生物毒素解毒剂，其中茶玉红精是茶叶的水或热水提取物。第4，其中茶玉红精是茶叶经水或开水提取后的醇提取物。
为此，第5项发明提供梭状芽孢杆菌属微生物毒素解毒剂，其中上述第1～第4项发明中的茶玉红精是如下式[1]所示茶黄素的氧化聚合物中的至少一种物质：
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(式中R表示氢原子或3，4，5-三羟苯甲酰基)
另外，第6项发明是上述任一项的梭状芽孢杆菌属微生物毒素解毒剂，是在上述第5项发明中，茶玉红精是在具有用化学结构式[2]
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(式中R’表示3，4，5-三羟苯甲酰基)表示的茶黄素的氧化聚合物中，具有以下结构式[3]
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(式中R’表示3，4，5-三羟苯甲酰基)表示的结构的化合物中的至少一种物质。
第7，本发明提供含有上述任一项的梭状芽孢杆菌属微生物毒素解毒剂的医药品。第8，本发明也提供以上述任一项梭状芽孢杆菌属微生物毒素解毒剂作为添加剂的饮料食品。
附图的简要说明
图1表示遭肉毒梭状芽孢杆菌侵袭的运动神经骨骼肌系统受到电刺激后的反应。其中，IT表示神经干受到电刺激后产生的肌肉收缩，DT表示直接给予骨骼肌电刺激时产生的肌肉收缩，a表示加入了肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素(1.5nM、BoNT/A1mg/ml溶液15ml加入20ml试管中浓度成1.5nM)，b表示加入了肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素和茶玉红精的混合物(BoNT/A1mg/ml溶液15ml)，c表示只加入了茶玉红精(提取液10ml)。
图2表示试管内加有破伤风毒素的运动神经骨骼肌系统神经干受到电刺激后的反应。其中，a表示加入了破伤风毒素(4mg/ml、TeT×1mg/ml溶液330ml加入20ml试管，浓度成4mg/ml)，b表示加入了破伤风毒素和茶玉红精的混合物(TeT×1mg/ml溶液330ml)以及茶玉红精(提取液10ml)，c表示只加入了茶玉红精(提取液10ml)。
发明的最佳实施方案
发明人着眼于红茶可以有效降低肉毒梭状芽孢杆菌的神经毒性这一事实，潜心研究，终于发现茶叶中含有的褐色色素成分茶玉红精具有解除梭状芽孢杆菌属菌类所产生毒素的作用，在此发现上进一步研究终于完成了本发明。
茶叶中如前所述具有非常多种类的成分，本发明中的梭状芽孢杆菌属微生物毒素解毒剂，其有效成分包括茶玉红精。此处的有效成分茶玉红精，是红茶等的褐色色素成分之一。而且，是前面提到的化合物[1]茶黄素的氧化聚合产物之一。
茶黄素和茶玉红精都是茶叶中儿茶酸类在多酚氧化酶的作用下被氧化而成的产物，而茶玉红精应该是由氧化形成的聚合物。茶玉红精的结构虽然还未能完全明确，但Katiyar等人提出(Katiyar，S.K.和Mukhtar，H.，Carcinogenesis 18，1911-16(1997))，它具有以下结构式[3]表示的结构。
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(式中R表示3，4，5-三羟苯甲酰基。)其中，3，4，5-三羟苯甲酰基就是用以下结构式[4]表示的取代基。
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本发明涉及含有如上所述的茶玉红精作为有效成分的梭状芽孢杆菌属微生物毒素解毒剂，具体举例来说就是茶叶、即含有褐色色素成分的红茶等茶叶的水或热开水提取物。其中，优选茶叶加工时经提高酶的活性、使儿茶酸类氧化而得到的发酵茶中的提取物。而作为发酵茶，特别优选红茶。另外，本发明涉及的梭状芽孢杆菌属微生物毒素解毒剂也可以由煎茶等非发酵茶二次加工而得的茶叶中提取。
用水或热水提取，例如可以在常温(10-30℃左右)或热水(30℃以上直到沸腾开水)下进行。用60℃以上的热水提取效率更高。
提取出的水相必要的话也可以先用酯类等有机溶剂洗，然后再用醇提取。
更具体地来说，本发明中，如后述实施例所示，用水或热水提取以后用醇提取，更优选丁醇、异丙醇、异丁醇、己醇等醇类，其中例如丁醇提取物是适于本发明的解毒剂。
本发明涉及的梭状芽孢杆菌属微生物毒素的解毒剂对所有的梭状芽孢杆菌属微生物都有效，其中尤其是对肉毒梭状芽孢杆菌和破伤风菌产生的神经毒素的解毒效果好。另外，本发明中所说的“中和(解毒)”，意思是抑制、减少并进而消除梭状芽孢杆菌属微生物毒素所产生的不良作用。
本发明涉及的梭状芽孢杆菌属微生物毒素的解毒剂，可以使受梭状芽孢杆菌污染产生毒素的食品中的梭状芽孢杆菌属微生物毒素变得无毒，可以对受梭状芽孢杆菌感染产生微生物毒素的创伤部位实施涂抹、喷雾、或擦拭等方法，接触到创伤部位，作为以清洗剂或消毒剂为代表的药品而使用。
还有，本发明涉及的梭状芽孢杆菌属微生物毒素的解毒剂，可以在食品生产过程中添加，由此来预防梭状芽孢杆菌属微生物毒素引起的食物中毒。作为这类食品可以是罐头食品、瓶装食品、火腿、香肠、鱼糕、咸鱼饭团、蜂蜜等，当然也不限于此。而且可以在食品整个加工过程、加工、包装等所有工序中进行添加。
本发明涉及的梭状芽孢杆菌属微生物毒素的解毒剂中所含茶玉红精是由茶叶中提取出来的天然色素成分，所以本发明的解毒剂对人体和环境无害，安全性高，很适合用于医药品和食品添加剂。
以下按根据附图举出实施例，对本发明的实施方案进一步详细说明。当然，本发明的应用并不限于以下实施例，在各个细节可以有多种多样的可能性。
实施例<准备1>茶玉红精的分离提取
在红茶茶叶12g中加入90ml热水(沸水)，放置2分钟，然后用Whatman2号滤膜过滤。得到的提取液40ml中加入40ml氯仿，剧烈搅拌3分钟后水层和有机层分离。水层40ml中加入乙酸乙酯40ml，再剧烈搅拌3分钟，水层和有机层再次分离。在水层40ml中加入1-丁醇，再次剧烈搅拌3分钟。单回收有机层(1-丁醇层)，用旋转蒸发器干燥固化，得到提取物(茶玉红精＝TRB)。将得到的茶玉红精溶于3ml水中，就得到了TRB溶液。<准备2>运动神经骨骼肌系统的存活标本的制作和骨骼肌收缩的确认
制作运动神经骨骼肌系统的存活标本，确认一旦在试管内对其神经干实施电刺激就会产生骨骼肌的收缩反应，以及对骨骼肌直接实施电刺激骨骼肌发生同样的收缩反应。<实施例1>茶玉红精对肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素的解毒效果(1)
在加有做好的运动神经骨骼肌系统依然存活标本的试管内分别单独加入肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素(BoNT)、加入BoNT和TRB的混合物、单独加入TRB。
图1表示运动神经骨骼肌系统受到电刺激的反应。(IT：对神经干进行电刺激时的肌肉收缩；DT：对骨骼肌直接给予电刺激时的肌肉收缩)
结果显示对骨骼肌直接给予电刺激时，骨骼肌的收缩反应没有被BoNT阻断，但对神经干给予电刺激时，骨骼肌的收缩反应被阻止了。(图1a)
而对BoNT和TRB的混合物来说，即使给予神经干电刺激，骨骼肌的收缩反应也未被阻断(图1b)
而在只有TRB的情况下，可见骨骼肌的收缩未受影响。
由此可见，茶玉红精会中和肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素的毒性，而且，在只有茶玉红精的情况下，运动神经骨骼肌系统的肌肉收缩未受影响。<实施例2>茶玉红精对破伤风毒素的解毒效果
和实施例1同样，在运动神经骨骼肌系统的依然存活标本中分别加入破伤风毒素(TeTx)、TeTx和TRB、仅有TRB，比较运动神经骨骼肌系统对电刺激的反应。
图2表示运动神经骨骼肌系统对电刺激的反应。
对神经干实施电刺激时，肌肉收缩由于加了TeTx被阻断了(图2a)，而在加了TeTx和TRB的情况下肌肉收缩和正常情况一样进行(图2b)。而在只加了TRB的情况下，肌肉收缩也未被阻断(图2c)。
由此可见，茶玉红精对破伤风毒素也有解毒效果。<实施例3、4>和<对照例1-4>茶叶提取成分对肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素的解毒效果
和实例1、2一样，在BoNT中分别加入红茶(实施例3)和煎茶(实施例4)的沸水提取物的情况下，和只有BoNT的情况下，比较运动神经骨骼肌系统受到电刺激时的肌肉收缩反应。
另外，用同样的方法，在BoNT中分别加入绿茶(对照例1)、单宁酸(对照例2)、儿茶酸(对照例3)以及茶黄素(比较例4)，观察运动神经骨骼肌系统受到电刺激时的肌肉收缩反应。
表1表示各成分对肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素的解毒效果
表1：茶叶提取成分对BoNT的解毒效果
提取成分 效果
实施例 1，2 3 4 茶玉红精 红茶 煎茶 + + +
对照例 1 2 3 4 绿茶 单宁酸 儿茶酸 茶黄素 - - - -
+：有解毒效果
-：无解毒效果
在加入红茶、煎茶、茶玉红精的情况下，可以看到对BoNT有解毒效果，而在加入绿茶、单宁酸、儿茶酸、茶黄素的情况下，未见对BoNT有解毒效果。其中，加入红茶的情况下对BoNT的解毒效果特别高。由此可见，红茶提取物对肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素有很好的解毒效果，而且有解毒效果的红茶和煎茶的提取物中含有茶玉红精，它是褐色色素成分中的至少一种物质，由此可知就是茶玉红精对肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素有解毒效果。<实施例5>茶玉红精对肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素的解毒效果(2)
将溶于0.05M乙酸盐-0.2M氯化钠缓冲液(pH6.0)、浓度为1mg/ml的肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素各种样品100μl(＝100μg)按每只小鼠1个单位容量经口给药。同时，与此相对，将混合好的TRB(上述的提取液)按与毒素溶液等量(1倍量)、2倍量、4倍量，单独经口给药，以及与BoNT混合(混合比：1倍量、2倍量、4倍量)经口给药。结果如表2所示。
表2：经口给药BoNT以及TRB的小鼠存活率
添加物 存活数/实验个体数
TRB(1) TRB(2) TRB(4) BoNT/A(1) BoNT/B(1) BoNT/E(1) BoNT/A(1)+TRB(1) BoNT/A(1)+TRB(2) BoNT/A(1)+TRB(4) BoNT/B(1)+TRB(4) BoNT/E(1)+TRB(4) 8/8 8/8 12/12 0/8 0/8 0/8 0/8 3/8 8/8 8/8 8/8
BoNT：100μg/100μl/个体
TRB(n)：茶玉红精n倍量
BoNT：肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素/A，/B，/E：A、B、E型经口给药BoNT(A型、B型、E型)的小鼠全部死亡。而将BoNT(A型、B型、E型)和TRB(4倍量)混合后对小鼠经口给药，小鼠100％存活。
给予了1倍量BoNT(A型)和TRB的小鼠全部死亡，给以了2倍量TRB和BoNT混合物的小鼠3/8存活，由此可知，实验提取出的TRB的4倍量的确可以发挥出对BoNT的解毒效果。
另外，单独给以TRB的个体全部存活，由此可见在此范围内的服用量TRB是没有毒性的。工业实用性
正如上述具体说明的，本发明提供了可以使以肉毒梭状芽孢杆菌和破伤风菌为代表的梭状芽孢杆菌属微生物毒素失去毒性、对生物体和环境的安全性高、使用简单方便的梭状芽孢杆菌属微生物毒素解毒剂。