《一种亮丙瑞林的合成法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种亮丙瑞林的合成法.pdf（13页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510741266.6 (22)申请日 2015.11.05 C07K 7/23(2006.01) C07K 1/06(2006.01) C07K 1/04(2006.01) C07K 1/02(2006.01) (71)申请人 江苏诺泰生物制药股份有限公司 地址 222000 江苏省连云港市连云港经济技 术开发区临浦路 28 号 (72)发明人 王蔡典 刘标 谷海涛 徐峰 孙美禄 李家瑾 (74)专利代理机构 连云港润知专利代理事务所 32255 代理人 刘喜莲 (54) 发明名称 一种亮丙瑞林的合成法 (57) 摘要 本发明是一。
2、种亮丙瑞林的合成方法 ： 该方 法采用液相合成二肽中间体再用于固相合成 得全保护九肽肽树脂， 将全保护九肽从树脂上 切割下来在液相中接乙胺得到全保护亮丙瑞 林， 经裂解得到亮丙瑞林粗品 ； 其具体步骤如 下 ： 在缩合剂作用下， 缩合得到 Fmoc-Leu-OSU 脂 ； 与 H-Arg(pbf)-OH 在 碱 作 用 下 反 应 得 到 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH ； 在碱作用下反应得到 Fmoc-Pro-CTC Resin ； 脱去 Fmoc， 在缩合剂作用 下， 依次偶联氨基酸得到全保护九肽肽树脂 ； 使 用切割试剂切割全保护九肽肽树脂得到全保护九 肽 ； 全保护九肽与乙胺。
3、盐酸盐在缩合剂作用下得 到亮丙瑞林全保护肽， 经裂解得到亮丙瑞林粗品。 本发明方法显著地提高了亮丙瑞林的收率与纯 度， 无需氨解， 反应简单可控， 适用于工业生产。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书8页 附图2页 CN 105330726 A 2016.02.17 CN 105330726 A 1/2 页 2 1.一种亮丙瑞林的合成方法， 其特征在于 ： 该方法采用液相合成二肽中间体再用于固 相合成得全保护九肽肽树脂， 将全保护九肽从树脂上切割下来在液相中接乙胺得到全保护 亮丙瑞林， 经裂解得到亮丙瑞林粗品 ； 其具体步。
4、骤如下 ： （1） 在缩合剂作用下， 由 Fmoc-Leu-OH 和 HOSU 缩合得到 Fmoc-Leu-OSU 脂 ； （2） Fmoc-Leu-OSU 脂与 H-Arg(pbf)-OH 在碱作用下反应得到 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH ； （3） Fmoc-Pro-OH 与 CTC Resin 在碱作用下反应得到 Fmoc-Pro-CTC Resin ； （4） 脱 去 Fmoc， 在 缩 合 剂 作 用 下， 依 次 偶 联 下 列 氨 基 酸 ： Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH,Fmoc-D-Leu-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tB。
5、u)-OH,Fmoc-Trp (Boc)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Pyr-OH， 得到全保护九肽肽树脂 ； （5） 使用切割试剂切割全保护九肽肽树脂得到全保护九肽 ； （6） 全保护九肽与乙胺盐酸盐在缩合剂作用下得到亮丙瑞林全保护肽， 经裂解得到亮 丙瑞林粗品。 2.根据权利要求1所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中所述的缩 合剂选自 DCC， DIC， EDCHCl 中任意一种。 3.根据权利要求1所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中所述的碱 选自 DIEA， NMM， Py， DMAP， NaOH， NaHCO3， N。
6、a2CO3中任意一种。 4.根据权利要求 1 所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其特征在于 ： 步骤 （3）中 CTC Resin 替代度为 0.5-2.0mmol/g。 5.根据权利要求 4 所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其特征在于 ： 步骤 （3）中 CTC Resin 替代度为 1.0-1.5mmol/g。 6.根据权利要求1所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其特征在于 ： 步骤 （3） 中所述的碱 选自 DIEA， NMM， Py， DMAP 中任意一种。 7.根据权利要求1所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其特征在于 ： 步骤 （4） 的具体操作 如下 ： 4.1 采用 DBLK 使所述。
7、 Fmoc-Pro-CTC Resin 脱除 Fmoc 保护基， 得到 H-Pro-CTC Resin， 所述 DBLK 为 PIP/DMF=1/4 的溶液 ； 4.2 在缩合剂系统存在下 H-Pro-CTC Resin 和 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH 偶联得到 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-Pro-CTC Resin ； 4.3 重复步骤 4.1 和 4.2 得到全保护九肽肽树脂。 8.根据权利要求1或7所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其特征在于 ： 步骤 （4） 中所述 偶联使用缩合剂和反应溶剂， 所述缩合剂选自 DIC/HOBt， HBTU， HCTU， TBTU， 。
8、PyBOP 其中之一 与 HOBt、 DIEA、 NMM 其中之一组合， 或者 HATU、 PyAOP 其中之一与 HOAt、 DIEA、 NMM 其中之一 组合 ； 所述反应溶剂选自 DMF、 DCM、 NMP、 DMSO 或它们之间的任意组合。 9.根 据 权 利 要 求 1 所 述 的 一 种 亮 丙 瑞 林 的 合 成 方 法， 其 特 征 在 于 ： 所 投 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH的用量为所投CTC Resin总摩尔数的1.2-6倍， 优选为1.5-2.5 ； 偶 联时间为室温条件下 40-180 分钟， 优选为 60-90 分钟。 10.根据权利要求 1 所述的一。
9、种亮丙瑞林的合成方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （5） 和 （6） 的具体方法如下 ： 使用全保护九肽肽树脂重量 （g） 10 倍体积 (mL) 的 1-2%TFA/DCM 或者 权 利 要 求 书 CN 105330726 A 2 2/2 页 3 20%TFE/DCM 室温下切割肽树脂得到全保护九肽 ： 将全保护九肽、 乙胺盐酸盐溶于有机溶剂 中， 降温至5以下， 加入偶联剂， 室温反应 ； 其中有机溶剂选自DMF、 THF ； 偶联剂选自HBTU、 HCTU、 TBTU、 PyBOP 其中之一与 HOBt、 DIEA、 NMM 其中之一组合， 或者 HATU、 PyAOP 其中之一 与 。
10、HOAt、 DIEA、 NMM 其中之一组合 ； 配制偶联剂的溶液采用的溶剂选自 DMF、 THF ； 反应的时 间为室温条件下30-300分钟， 优选室温条件下30-60分钟 ； 反应完毕后， 通过常规后处理得 到亮丙瑞林粗品 ； 一个具体的后处理方法是 ： 将反应液倒入 8 倍体积的饱和碳酸氢钠溶液 中析晶， 所得固体水洗涤4次， 烘干， 得亮丙瑞林全保护九肽 ； 全保护九肽加入8倍体积的裂 解液中裂解 2h 后， 加入 6 倍体积的冰乙醚中析晶， 所得固体乙醚研洗离心 3 次， 真空减压干 燥， 得亮丙瑞林粗品。 权 利 要 求 书 CN 105330726 A 3 1/8 页 4 一种。
11、亮丙瑞林的合成法 技术领域 0001 本发明属于多肽药物制备方法技术领域， 特别涉及亮丙瑞林的固液合成方法。 背景技术 0002 亮丙瑞林外文名或通用名为 Leuprorelin， 具有以下结构 ： L-焦谷氨酰-L-组氨酰-L-色氨酰-L-丝氨酰-L-酪胺酰-D-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精 氨酰 -L- 脯氨酰乙胺 亮丙瑞林是促黄体生成释放激素 （LHRH） 的高活性衍生物， 在首次给药后能立即产生一 过性的垂体 - 性腺系统兴奋作用 （急性作用） ， 然后抑制垂体生成和释放促性腺激素。它还 能进一步抑制卵巢和睾丸对促性腺激素的反应， 从而降低雌二醇和睾丸酮的生成 （慢性作 用） 。所以能有。
12、效地抑制垂体 - 性腺系统的功能。亮丙瑞林广泛用于治疗早熟、 子宫内膜异 位症、 子宫肌瘤或绝经前乳腺癌等女性患者和前列腺癌等男性患者。 0003 美国公开专利文献 US4690916 中有合成亮丙瑞林的报道。使用 Merrifield 树脂， 采用 Boc 法固相合成全保护九肽片段， 在低温下用乙胺氨解树脂， 再经 HF 脱除侧链保护基 得到目的产物。该法氨解收率低， 极易造成肽链的消旋。专利 CN101538315A 和 CN1865280A 采用 Fmoc 固相法合成全保护九肽， 再液相接乙胺修饰。该法无法完全避免二酮哌嗪副反 应， 放大生产时， 二酮哌嗪副反应造成肽链脱落， 显著降低收。
13、率。 0004 因此研发一种收率高、 反应简单可控， 适于工业化生产的亮丙瑞林新的合成方法 具有重要意义。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是对对现有技术的不足， 提供一种亮丙瑞林的固液相 结合合成方法， 该方法显著的提高了亮丙瑞林的收率与纯度， 无需氨解， 反应简单可控， 适 用于工业生产。 0006 本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。 本发明是一种亮丙 瑞林的合成方法， 其特点是 ： 该方法采用液相合成二肽中间体再用于固相合成得全保护九 肽肽树脂， 将全保护九肽从树脂上切割下来在液相中接乙胺得到全保护亮丙瑞林， 经裂解 说 明 书 CN 105330726 。
14、A 4 2/8 页 5 得到亮丙瑞林粗品 ； 其具体步骤如下 ： （1） 在缩合剂作用下， 由 Fmoc-Leu-OH 和 HOSU 缩合得到 Fmoc-Leu-OSU 脂 ； （2） Fmoc-Leu-OSU 脂与 H-Arg(pbf)-OH 在碱作用下反应得到 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH ； （3） Fmoc-Pro-OH 与 CTC Resin 在碱作用下反应得到 Fmoc-Pro-CTC Resin ； （4） 脱去 Fmoc， 在缩合剂作用下， 依次偶联下列氨基酸： Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH,Fmoc-D-Leu- OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
15、,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Pyr-OH， 得 到 全保护九肽肽树脂 ； （5） 使用切割试剂切割全保护九肽肽树脂得到全保护九肽 ； （6） 全保护九肽与乙胺盐酸盐在缩合剂作用下得到亮丙瑞林全保护肽， 经裂解得到亮 丙瑞林粗品。 0007 本发明所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其进一步优选的技术方案是 ： 步骤 （1） 中所述的缩合剂选自 DCC， DIC， EDCHCl 中任意一种。 0008 本发明所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其进一步优选的技术方案是 ： 步骤 （2） 中所述的碱选自 DIEA， NMM， Py。
16、， DMAP， NaOH， NaHCO3， Na2CO3 中任意一种。 0009 本发明所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其进一步优选的技术方案是 ： 步骤 （3） 中 CTC Resin 替代度为 0.5-2.0mmol/g。 0010 本发明所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其进一步优选的技术方案是 ： 步骤 （3） 中 CTC Resin 替代度为 1.0-1.5mmol/g。 0011 本发明所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其进一步优选的技术方案是 ：（3） 中所 述的碱选自 DIEA， NMM， Py， DMAP 中任意一种。 0012 本发明所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其进一步优选。
17、的技术方案是 ：（4） 的具 体操作如下 ： 4.1 采用 DBLK 使所述 Fmoc-Pro-CTC Resin 脱除 Fmoc 保护基， 得到 H-Pro-CTC Resin， 所述 DBLK 为 PIP/DMF=1/4 的溶液 ； 4.2 在缩合剂系统存在下 H-Pro-CTC Resin 和 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH 偶联得到 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-Pro-CTC Resin ； 4.3 重复步骤 4.1 和 4.2 得到全保护九肽肽树脂。 0013 本发明所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其进一步优选的技术方案是 ： 步骤 （4） 中所述偶联使用缩合剂和反。
18、应溶剂， 所述缩合剂选自 DIC/HOBt， HBTU， HCTU， TBTU， PyBOP 其 中之一与 HOBt、 DIEA、 NMM 其中之一组合， 或者 HATU、 PyAOP 其中之一与 HOAt、 DIEA、 NMM 其 中之一组合 ； 所述反应溶剂选自 DMF、 DCM、 NMP、 DMSO 或它们之间的任意组合。 0014 本发明所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其进一步优选的技术方案是 ： 所投 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH的用量为所投CTC Resin总摩尔数的1.2-6倍， 优选为1.5-2.5 ； 偶 联时间为室温条件下 40-180 分钟， 优选为 60-9。
19、0 分钟。 0015 本发明所述的一种亮丙瑞林的合成方法， 其进一步优选的技术方案是 ： 所述步骤 （5） 和 （6） 的具体方法如下 ： 使用全保护九肽肽树脂重量 （g） 10 倍体积 (mL) 的 1-2%TFA/DCM 或者 20%TFE/DCM 室温下切割肽树脂得到全保护九肽 ： 将全保护九肽、 乙胺盐酸盐溶于有机 溶剂中， 降温至 5以下， 加入偶联剂， 室温反应 ； 其中有机溶剂选自 DMF、 THF ； 偶联剂选自 说 明 书 CN 105330726 A 5 3/8 页 6 HBTU、 HCTU、 TBTU、 PyBOP 其中之一与 HOBt、 DIEA、 NMM 其中之一组合。
20、， 或者 HATU、 PyAOP 其中 之一与 HOAt、 DIEA、 NMM 其中之一组合 ； 配制偶联剂的溶液采用的溶剂选自 DMF、 THF ； 反应 的时间为室温条件下30-300分钟， 优选室温条件下30-60分钟 ； 反应完毕后， 通过常规后处 理得到亮丙瑞林粗品 ； 一个具体的后处理方法是 ： 将反应液倒入 8 倍体积的饱和碳酸氢钠 溶液中析晶， 所得固体水洗涤4次， 烘干， 得亮丙瑞林全保护九肽 ； 全保护九肽加入8倍体积 的裂解液中裂解 2h 后， 加入 6 倍体积的冰乙醚中析晶， 所得固体乙醚研洗离心 3 次， 真空减 压干燥， 得亮丙瑞林粗品。 0016 本发明提供的合成。
21、方法中， 所用到的原料、 试剂及中间体均可由市场够得。 本发 明涉及的英文缩写所对应的中文名称见下表： 说 明 书 CN 105330726 A 6 4/8 页 7 与现有技术相比， 本发明方法采用液相合成二肽中间体再用于固相合成得全保护九肽 肽树脂， 说 明 书 CN 105330726 A 7 5/8 页 8 将全保护九肽从树脂上切割下来在液相中接乙胺得到全保护亮丙瑞林， 经裂解得到亮 丙瑞林粗品。该方法显著地提高了亮丙瑞林的收率与纯度， 无需氨解， 反应简单可控， 适用 于工业生产。 附图说明 0017 图 1 为本发明合成产品的 MS 图 ； 图 2 为本发明合成产品的 HPLC 图。。
22、 具体实施方式 0018 下面结合实施例， 进一步阐述本发明 ： 实施例 1， 一种亮丙瑞林的合成方法 ： 该方法采用液相合成二肽中间体再用于固相合 成得全保护九肽肽树脂， 将全保护九肽从树脂上切割下来在液相中接乙胺得到全保护亮丙 瑞林， 经裂解得到亮丙瑞林粗品 ； 其具体步骤如下 ： （1） 在缩合剂作用下， 由 Fmoc-Leu-OH 和 HOSU 缩合得到 Fmoc-Leu-OSU 脂 ； （2） Fmoc-Leu-OSU 脂与 H-Arg(pbf)-OH 在碱作用下反应得到 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH ； （3） Fmoc-Pro-OH 与 CTC Resin 在碱作用下。
23、反应得到 Fmoc-Pro-CTC Resin ； （4） 脱去 Fmoc， 在缩合剂作用下， 依次偶联下列氨基酸： Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH,Fmoc-D-Leu- OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Pyr-OH， 得 到 全保护九肽肽树脂 ； （5） 使用切割试剂切割全保护九肽肽树脂得到全保护九肽 ； （6） 全保护九肽与乙胺盐酸盐在缩合剂作用下得到亮丙瑞林全保护肽， 经裂解得到亮 丙瑞林粗品。 0019 实施例 2， 实施例 1 所述的一种亮丙瑞林的合成方法中 ： 。
24、步骤 （1） 中所述的缩合剂 选自 DCC， DIC， EDCHCl 中任意一种。 0020 实施例 3， 实施例 1 或 2 所述的一种亮丙瑞林的合成方法中 ： 步骤 （2） 中所述的碱 选自 DIEA， NMM， Py， DMAP， NaOH， NaHCO3， Na2CO3 中任意一种。 0021 实施例 4， 实施例 1 所述的一种亮丙瑞林的合成方法中 ： 步骤 （3） 中 CTC Resin 替 代度为 0.5-2.0mmol/g。 0022 实施例 5， 实施例 1 所述的一种亮丙瑞林的合成方法中 ： 步骤 （3） 中 CTC Resin 替 代度为 1.0-1.5mmol/g。 0。
25、023 实施例 6， 实施例 1 所述的一种亮丙瑞林的合成方法中 ： 步骤 （3） 中 CTC Resin 替 代度为 1.2mmol/g。 0024 实施例 7， 实施例 1 6 任何一种所述的一种亮丙瑞林的合成方法中 ： 步骤 （3） 中 所述的碱选自 DIEA， NMM， Py， DMAP 中任意一种。 0025 实施例 8， 实施例 1 7 任何一种所述的一种亮丙瑞林的合成方法中 ： 步骤 （4） 的 具体操作如下 ： 4.1 采用 DBLK 使所述 Fmoc-Pro-CTC Resin 脱除 Fmoc 保护基， 得到 H-Pro-CTC Resin， 所述 DBLK 为 PIP/DM。
26、F=1/4 的溶液 ； 说 明 书 CN 105330726 A 8 6/8 页 9 4.2 在缩合剂系统存在下 H-Pro-CTC Resin 和 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH 偶联得到 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-Pro-CTC Resin ； 4.3 重复步骤 4.1 和 4.2 得到全保护九肽肽树脂。 0026 实施例 9， 实施例 1 8 任何一种所述的一种亮丙瑞林的合成方法中 ： 步骤 （4） 中 所述偶联使用缩合剂和反应溶剂， 所述缩合剂选自 DIC/HOBt， HBTU， HCTU， TBTU， PyBOP 其中 之一与 HOBt、 DIEA、 NMM 其中。
27、之一组合， 或者 HATU、 PyAOP 其中之一与 HOAt、 DIEA、 NMM 其中 之一组合 ； 所述反应溶剂选自 DMF、 DCM、 NMP、 DMSO 或它们之间的任意组合。 0027 实施例 10， 实施例 1 9 任何一种所述的一种亮丙瑞林的合成方法中 ： 所投 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH 的用量为所投 CTC Resin 总摩尔数的 1.2-6 倍 ； 偶联时间为室温条 件下 40-180 分钟。 0028 实施例 11， 实施例 1 9 任何一种所述的一种亮丙瑞林的合成方法中 ： 所投 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH 的用量为所投 CTC Resin。
28、 总摩尔数的 1.5-2.5 倍 ； 偶联时间为室温 条件下 60-90 分钟。 0029 实施例 12， 实施例 1 9 任何一种所述的一种亮丙瑞林的合成方法中 ： 所投 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH 的用量为所投 CTC Resin 总摩尔数的 2 倍 ； 偶联时间为室温条件下 75 分钟。 0030 实施例 13， 实施例 1 12 任何一种所述的一种亮丙瑞林的合成方法中 ： 所述步骤 （5） 和 （6） 的具体方法如下 ： 使用全保护九肽肽树脂重量 （g） 10 倍体积 (mL) 的 1-2%TFA/DCM 或者 20%TFE/DCM 室温下切割肽树脂得到全保护九肽 ： 将。
29、全保护九肽、 乙胺盐酸盐溶于有机 溶剂中， 降温至 5以下， 加入偶联剂， 室温反应 ； 其中有机溶剂选自 DMF、 THF ； 偶联剂选自 HBTU、 HCTU、 TBTU、 PyBOP 其中之一与 HOBt、 DIEA、 NMM 其中之一组合， 或者 HATU、 PyAOP 其中 之一与 HOAt、 DIEA、 NMM 其中之一组合 ； 配制偶联剂的溶液采用的溶剂选自 DMF、 THF ； 反应 的时间为室温条件下30-300分钟， 优选室温条件下30-60分钟 ； 反应完毕后， 通过常规后处 理得到亮丙瑞林粗品 ； 一个具体的后处理方法是 ： 将反应液倒入 8 倍体积的饱和碳酸氢钠 溶液。
30、中析晶， 所得固体水洗涤4次， 烘干， 得亮丙瑞林全保护九肽 ； 全保护九肽加入8倍体积 的裂解液中裂解 2h 后， 加入 6 倍体积的冰乙醚中析晶， 所得固体乙醚研洗离心 3 次， 真空减 压干燥， 得亮丙瑞林粗品。 0031 实施例 14， 一种亮丙瑞林的合成方法实验 ： 1、 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH 的制备 称取Fmoc-Leu-OH 35.35g， HOSU 12.66g置于三口烧瓶中， 加入DCM 200mL,搅拌溶解， 降温至32。 称取DCC 23.31g， 溶于100mL DCM,滴加入上述烧瓶中， 反应温度52， 反 应 3h。滤去固体， 35浓缩液体至油状。
31、， 加入 200mL 乙酸乙酯溶解。纯化水洗涤 4 次， 每次 100mL, 所得有机相加入无水硫酸钠干燥， 滤去固体所得液体 35浓缩至油状， 加入 100mL THF 溶解， 得 Fmoc-Leu-OSU 溶液冷藏待用。 0032 称取51.18g H-Arg(pbf)-OH 51.18g， 10.00g NaHCO3溶于200mL50%THF/水溶液， 1N NaOH(aq) 调整溶液 pH 至 8-8.5， 降温至 5。滴加 Fmoc-Leu-OSU 溶液， 1N NaOH(aq) 保 持溶液pH 8-8.5， 102反应3h。 反应结束后滤除固体， 加入200mL乙酸乙酯萃取， 水相。
32、再 用 100mL 乙酸乙酯萃取一次， 弃水相合并有机相。有机相 200mL 水洗涤一次， 1N HCl 200mL 洗涤一次， 每次200mL水洗涤至pH值3.5-4.5。 加入无水硫酸钠干燥， 滤去固体所得液体浓 说 明 书 CN 105330726 A 9 7/8 页 10 缩至干。得固体 66.75g， 收率 87.6%。 0033 2、 Fmoc-Pro-CTC Resin 的制备 取 CTC Resin(1.2mmol/g) 50.00g 置于多肽反应器中， 加入 DCM 400mL 氮气吹拂搅拌 30 分钟， 使树脂充分溶胀后抽干 DCM。称取 Fmoc-Pro-OH 60.75。
33、g, 加入 DMF 3400mL 搅拌溶 解， 加入 DIEA 94.5mL， 冰浴 15 分钟后加入多肽反应器中， 氮气吹拂搅拌反应 2 小时后抽干 反应液， DMF 洗涤 3 次， 每次 400mL， 1 分钟。加入封闭试剂 （无水甲醇 /DIEA/DCM=1/2/17( 体 积比 )） 封闭两次每次 400mL， 10 分钟。DCM 洗涤 4 次， 每次 400mL， 10 分钟。取出树脂， 烘 干。得 Fmoc-Pro-CTC Resin 82.35g。取代度为 0.73mmol/g。 0034 3、 肽树脂的制备 取 Fmoc-Pro-CTC Resin 13.70g(10mmol)。
34、 置于多肽反应器中， 加入 DCM 100mL 氮 气吹拂搅拌 30 分钟， 使树脂充分溶胀后抽干 DCM。加入 DBLK 80mL 脱 Fmoc 保护 2 次， 5+15 分钟， 每次 80mL。DMF 洗涤 5 次， 每次 80mL， 1 分钟。称取 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH 22.86g(30mmol),HOBt 4.86g(36mmol), 加入 DMF 80mL 搅拌溶解， 冰浴 5 分钟， 加入 DIC 5.6mL(36mmol)， 冰浴活化15分钟后加入多肽反应器中， 氮气吹拂搅拌反应2小时后抽干反 应液， DMF 洗涤 3 次， 每次 100mL， 1 分钟。按。
35、此方法依次接入 Fmoc-D-Leu-OH,Fmoc-Tyr(tB u)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Pyr-OH。 得到全保护九肽 肽树脂 27.8g。 0035 4、 肽树脂的制备 取 Fmoc-Pro-CTC Resin 13.70g(10mmol) 置于多肽反应器中， 加入 DCM 100mL 氮 气吹拂搅拌 30 分钟， 使树脂充分溶胀后抽干 DCM。加入 DBLK 80mL 脱 Fmoc 保护 2 次， 5+15 分钟， 每次 80mL。DMF 洗涤 5 次， 每次 80mL， 1 分钟。称取 Fmoc。
36、-Leu-Arg(pbf)-OH 22.86g(30mmol),HBTU 10.24g(27mmol)， HOBt 4.05g(30mmol), 加入 DMF 80mL 搅拌溶解， 冰浴5分钟， 加入DIEA 7.8mL(45mmol)， 冰浴活化15分钟后加入多肽反应器中， 氮气吹拂搅 拌反应 2 小时后抽干反应液， DMF 洗涤 3 次， 每次 100mL， 1 分钟。按此方法依次接入 Fmoc- D-Leu-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,P yr-OH。得到全保护九肽肽树脂 2。
37、5.3g。 0036 5、 肽树脂的制备 取 Fmoc-Pro-CTC Resin 13.70g(10mmol) 置于多肽反应器中， 加入 DCM 100mL 氮 气吹拂搅拌 30 分钟， 使树脂充分溶胀后抽干 DCM。加入 DBLK 80mL 脱 Fmoc 保护 2 次， 5+15 分钟， 每次 80mL。DMF 洗涤 5 次， 每次 80mL， 1 分钟。称取 Fmoc-Leu-Arg(pbf)-OH 22.86g(30mmol),HCTU 11.17g(27mmol)， HOBt 4.05g(30mmol), 加入 DMF 80mL 搅拌溶解， 冰浴5分钟， 加入NMM 10.0mL(9。
38、0mmol)， 冰浴活化15分钟后加入多肽反应器中， 氮气吹拂搅 拌反应 2 小时后抽干反应液， DMF 洗涤 3 次， 每次 100mL， 1 分钟。按此方法依次接入 Fmoc- D-Leu-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,P yr-OH。得到全保护九肽肽树脂 26.7g。 0037 6、 切割 取制得全保护九肽肽树脂 26.7g， 加入 215mL 1%TFA/DCM 溶液中室温搅拌裂解 2.0 小 时。滤去树脂， 加入无水碳酸钾 5g 干燥 8 小时。过滤， 浓缩滤液， 将滤液倒。
39、入 1290mL 的正 己烷中。过滤， 将所得固体烘干， 得全保护九肽 11.2g， 收率 59.3%。 说 明 书 CN 105330726 A 10 8/8 页 11 0038 7 切割 取上述 “3” 所得全保护九肽肽树脂 27.8g， 加入 215mL 20%TFE/DCM 溶液中室温搅拌裂 解 1.5 小时。滤除树脂， 再加入 215mL 20%TFE/DCM 溶液中室温搅拌裂解 1.5 小时后滤去树 脂， 合并滤液， 浓缩， 将滤液倒入 6 倍体积的正己烷中。过滤， 将所得固体烘干， 得全保护九 肽 14.6g。收率 77.3%。 0039 8 亮丙瑞林全保护肽的合成 取上述 “6。
40、” 所得全保护九肽 11.2g (5.9mmol)， HOSu 0.75g(6.49mmol), 溶于 50mL DCM， 降温至 5。取 DCC 1.34g(6.49mmol), 溶于 10mL DCM， 滴入上述已降温溶液中 5反 应 3 小时。取乙胺盐酸盐 0.72g(8.85mmol),DIEA 1.5 mL 溶于 50 mL DCM, 降温至 10。 滴加上述反应液， 10反应 1h。过滤， 滤液浓缩至油状， 加入乙酸乙酯 50 mL 溶解。纯化水 50mL 充分震荡洗涤， 过滤， 滤液静置弃水相。有机相饱和食盐水洗涤 4 次， 每次 50mL ； 纯化 水洗涤 4 次每次 50mL。
41、。所得有机相无水硫酸钠干燥 8 小时， 过滤， 浓缩滤液至干， 得亮丙瑞 林全保护肽 10.6g, 收率 93.3%。 0040 9、 亮丙瑞林全保护肽的合成 取 上 述 “7”所 得 全 保 护 九 肽 14.6g (7.6mmol)， HBTU 4.32g(11.4mmol),HOBT 1.54g(11.4mmol) 乙胺盐酸盐 0.93g(11.4mmol), 溶于 50mL DMF。滴加 DIEA 6.0 mL 室温 反应 1 小时。将反应液倒入 400 mL 饱和碳酸氢钠溶液中析晶， 所得固体纯化水冲洗 4 次， 干燥。得亮丙瑞林全保护肽 14.2g, 收率 95.7%， 总收率 7。
42、4.0%。 0041 10 、 裂解 配制 TFA: 苯甲硫醚 :EDT: 苯甲醚 =90:5:3:2( 体积比 ) 的裂解液 85 mL 冰浴至 5。 取上述 “6” 所得亮丙瑞林全保护肽 10.6g 加入上述裂解液中， 室温裂解 2h， 加入 510mL 冰乙 醚中析晶。离心， 所得固体乙醚研洗离心 3 次， 真空减压干燥。得粗肽 11.4g， HPLC 定量含 目的肽 g， 收率 77.4%， 总收率 42.8%。 0042 11、 裂解 配制 TFA:TIS:EDT: 水 =92.5:2.5:2.5:2.5( 体积比 ) 的裂解液 115 mL 冰浴至 5。取 上述 “6” 所得亮丙瑞。
43、林全保护肽 14.2g 加入上述裂解液中， 室温裂解 2h， 加入 690mL 冰乙醚 中析晶。离心， 所得固体乙醚研洗离心 3 次， 真空减压干燥。得粗肽 15.6g， HPLC 定量含目 的肽 g， 收率 84.7%， 总收率 62.7%。 0043 所得产品 MS， HPLC 见图 1和图 2。 0044 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当 改进工艺参数实现。特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是 显而易见的它们都被视为包括在本发明。 本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了 描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对本文所述的方法和应用进行 改动或适当变更与组合， 来应用和实现本发明技术。 说 明 书 CN 105330726 A 11 1/2 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 105330726 A 12 2/2 页 13 图 2 说 明 书 附 图 CN 105330726 A 13 。