技术领域
本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域。具体地，本发明涉及食品或 饲料中水牛成分的实时荧光PCR检测方法和试剂盒。
背景技术
作为一类高级营养食品，水牛奶制品日渐成人们消费的“新宠”，被誉为 “奶中之王”。水牛奶、水牛奶酪、水牛奶保健产品和婴儿食品系列产品是高 附加值的奶制品，产品价值和营养价值均高于普通牛奶制品数倍。作为商业上 极有价值的成分，水牛奶的糖含量、乳蛋白与酪蛋白含量比黄牛奶高，且富含 矿物质和微量元素，营养价值高，水牛乳乳香浓稠，风味浓郁、口感饱满，是 老少皆宜的营养佳品。水牛奶是地方特色产品。意大利水牛奶业生产水平高， 产品种类多，市场大，Mozzarella奶酪世界闻名，深受欧美市场的欢迎。水牛 奶酪远销英、法、美等国家和地区，主要在高档餐馆和美食店销售，价值极昂 贵。在中国，以广西水牛头数最多，其后依次是云南，广东，贵州，湖北，四 川，湖南，江西和安徽。水牛奶加工的产品为姜撞奶、双皮奶等。因为水牛奶 产量不高，并且价格较贵，所以目前在水牛奶及制品中掺入普通牛奶的现象很 普遍。
目前关于乳制品掺假的检测方法有电泳、色谱、免疫化学、DNA技术等， 以DNA为基础的PCR等方法通过对DNA扩增进行乳品种的分析，灵敏、特 异、简便、快速、稳定性好。但是，目前还没有检测效果良好的特异性检测水 牛成分的试剂和方法。
发明内容
本发明的目的在于提供食品或饲料中水牛成分的实时荧光PCR检测方法 和试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种鉴定水牛成分的方法，所述方法包括：
以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引 物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含水牛成分。
在一个优选例中，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物以及SEQ ID NO：3所示的Taqman探针进行实时荧光PCR检测。
在另一优选例中，所述的待测样品是食品或饲料。
在另一优选例中，所述方法的检测灵敏度为10-3ng/μL DNA。
在本发明的另一方面，提供一种引物，所述引物是引物对，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
在本发明的另一方面，提供一种Taqman探针，其特征在于，所述的探针 序列如SEQ ID NO：3所示。
在本发明的另一方面，提供所述的引物和/或所述的Taqman探针的用途， 用于从待测样品中鉴定水牛成分。
在本发明的另一方面，提供一种鉴定水牛成分的试剂盒，其中包括所述的 引物和/或所述的Taqman探针。
在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：含有水牛成分的检测标准品。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂， Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定水牛成分的方法的使用说 明书。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
附图说明
图1、水牛成分的物种特异性实时荧光PCR检测图。扩增曲线从左到右分 别是：摩拉水牛、尼里-拉菲水牛、摩拉水牛与广西水牛一代杂交水牛、摩拉水 牛与广西水牛低代杂交水牛、摩拉水牛与广西水牛高代杂交水牛的牛奶样品的 DNA。
图2、水牛DNA配比的实时荧光PCR检测灵敏度图。扩增曲线从左到右 分别是：10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL水牛牛奶样 品的DNA。
图3、水牛奶重量比的实时荧光PCR检测灵敏度图。扩增曲线从左到右分 别是(W/W)：10％水牛奶；1％水牛奶；0.1％水牛奶；0.01％水牛奶提取的DNA。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种可特异性鉴定水牛 成分的引物，所述引物针对含有水牛成分的DNA可发生特异性扩增(获得阳性 结果)，而对没有水牛成分的DNA不发生特异性扩增(获得阴性结果)。为了简 化PCR扩增方法，本发明人还设计了配合所述引物的、用于进行实时荧光PCR 的Taqman探针。采用所述的引物配合Taqman探针，可良好地应用于鉴定水 牛成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。
目前开发有效的鉴定各种动物奶产品成分的方法的难点在于这些成分通 常在外观、品质上非常相近，导致人们难分真伪。即使采用一些基因或蛋白水 平上的技术，也由于一些动物品种在亲缘关系上较近，难以找到符合标准的、 检测准确性高、实用性强的检测靶标。为此，本发明人经过深入的研究和大量 的筛选，找到了合适的检测靶标，基于此开发了实时荧光PCR检测水牛成分的 方法。
如本文所用，所述的“水牛成分”是指特异性来自于水牛的成分，例如水 牛的奶、水牛肉等。
如本文所用，所述的“食品”包含了饮料。
本发明人通过对引物的筛选，获得一类可特异性鉴定水牛成分的引物，其 对于水牛的DNA发生特异性扩增，而对没有水牛成分的DNA不发生特异性扩 增。
因此，本发明提供一种引物，所述的引物具SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2 所示的核苷酸序列。
本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化 学发光物质进行标记。
本发明还提供一种探针，所述的探针具SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列； 较佳地，所述的探针是Taqman MGB探针，从而便于实时荧光检测。
利用本发明的引物及探针，只需进行实时荧光PCR反应，并通过判断相应 的PCR产物的有无，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有水牛成分，而 且所需的样品量很少。
基于本发明所提供的适用于鉴定水牛成分的特异性引物及探针，本发明还 提供了一种鉴定水牛成分的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板， 以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩 增，则表明待测样品中包含水牛成分。
聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是 体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进 行。
作为本发明的优选方式，利用所述引物，采用Taqman MGB实时荧光PCR 方法来进行水牛成分的鉴定。TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其 核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于 探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。TaqMan 探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和 TaqMan MGB探针。TaqMan MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团 (Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。 同时探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团。
获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采 取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试 剂盒是本领域技术人员熟知的。
本发明还涉及一种用于鉴定水牛成分的试剂盒，所述试剂盒中含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物；更佳地，所述的试剂盒中还含有SEQ ID NO： 3所示的探针。
此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定水牛成分的试剂，如(但不限于)：
(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP， DNA聚合酶等；或
(B)各种提取DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、 氯仿、异戊醇、NaCl等；或
(C)提取DNA的试剂盒。
此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定水牛成分的使用说明书和/或标准操作 程序。
本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测水牛成分的目的。
本发明的主要优点在于：
(1)首次揭示一种可特异性鉴定水牛成分的引物，所述的引物特异性良好， 对于水牛来源的成分(如水牛奶)能够实现特异性扩增，而对于水牛以外的其它 通常用作仿制水牛成分的物质则不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的 再现性、结果稳定可靠。
(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检 测水牛成分，从待测样品中快速准确地区分真假水牛成分，并且所需样品量少， 操作简单。
(3)较佳地，本发明应用Taqman MGB实时荧光PCR技术，可快速实现食 品中水牛源性成分的准确鉴定。
(4)本发明的方法的推广应用对保障产品的质量，保护消费者知情权和选 择权，维护正常的经济秩序等提供了技术支持。为食品的市场监督部门和检验 检疫部门提供了技术支持。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版 社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则 百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
I.材料与方法
1.1 样品收集、试验材料、试剂与仪器
来自摩拉水牛、尼里-拉菲水牛、摩拉水牛与广西水牛的一代杂交水牛、摩 拉水牛与广西水牛低代杂交水牛、摩拉水牛与广西水牛高代杂交水牛等的纯水 牛奶由广西水牛研究所提供。荷斯坦牛产牛奶、吉林产牛肉(黄牛肉)、河南产 牛肉(黄牛肉)、青岛产牛肉(黄牛肉)、上海市场牛肉(黄牛肉)、青海牦牛肉等购 自上海市农贸市场或超市。澳大利亚牛(黄牛)肉骨粉由上海海关口岸提供。水 牛肉由江西市场购买。
马肉、驴肉、山羊肉、绵羊肉、骆驼肉、猫肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、 鹌鹑肉、鳊鱼肉、鲳鱼肉、鲐鱼肉、大菱鲆肉、小鼠肉等动物成分购自上海市 农贸市场或超市。
大米、玉米、黄豆、黄米、绿豆、荞麦、红薯、马铃薯、腰果、白云豆、 杏仁、水蜜桃、芒果、石榴、海带、芹菜等植物成分购自上海市农贸市场或超 市。
进口水牛产品：6批艾伯丝牌水浸莫泽瑞拉干酪(Ambrosi Mozzarella Cheese；意大利产，批号L1194、L1179、L0911、L1319、L1320、L11333)、1 批马苏里拉水牛奶酪(意大利产)、1批琦雷萨牌水牛马苏里拉奶酪(意大利 CIRESA SNC DI CIRESA V.E.A.产)、2批水牛奶马苏里拉奶酪(意大利产，批号 LF1200B，LF1341B)、2份奇抡托牌马苏里拉水牛奶酪(意大利产，批号L299， L327)，3份国产水牛奶(品牌分别是摩拉菲尔水牛奶、摩拉菲尔水牛木瓜奶、 原味水牛奶)购自上海市农贸市场或超市。用于实例检测的水牛肉样品购自广 西、江西和浙江市场。
用于检测灵敏度配制的普通牛奶为德国进口多美鲜全脂牛奶，购自上海超 市。
1.2 方法
1.2.1 样品制备
使用冷冻研磨机(SPEX 6850)将上述样品中的固体样品磨成粉末状。用于 物种特异性检测。
1.2.2 DNA提取
使用天根动物基因组提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司；目录号： DP323)提取动物样本DNA、天根植物基因组提取试剂盒(购自天根生化科技 有限公司；目录号：DP305)提取植物样本DNA，提取方法详见试剂盒操作说 明书。用核酸蛋白浓度测定仪(Eppendorf公司)测定DNA溶液的浓度。DNA溶 液置于-20℃保存备用。
1.2.3 实时荧光PCR检测、引物及探针
经过广泛的试验和比对，本发明人最终确定利用ATPase 8基因保守序列作 为水牛成分鉴别的靶序列，设计引物及探针，引物与探针序列为：
上游引物：5’-TTCATTGAYCTCCCTGCTCC-3’(SEQ ID NO：1)；
下游引物：5’-GGAATAGGCCGGTGAGGATT-3’(SEQ ID NO：2)；
探针：5’FAM-ACTTTGGCTCTCTCC-MGB 3’(SEQ ID NO：3)。
实时荧光PCR检测采用ABITaqMan Universal PCR Master Mix酶预混液 (Part Number4304437)。总体积为25μL，含2×Real Time PCR Buffer，100nmol/L 引物，100nmol/L探针，50～100ng DNA模板量。
PCR扩增条件：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s；60℃，60s，共 40个循环。使用ABI7300实时荧光PCR仪进行定性检测。
1.2.4 18S rRNA基因PCR扩增与检测
使用18S rRNA基因扩增真核生物内源基因，以确保所提取的DNA适合于 PCR扩增。检测所用18S rRNA基因引物序列为：
5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO：4)；和
5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’(SEQ ID NO：5)。
PCR反应体系为：1×PCR缓冲液，2.5mmol/L Mg2+，1U Taq酶，200μmol/L dNTPs，引物100nmol/L，模板50-100ng，反应体积为25μL。
PCR扩增条件为：94℃，3min；94℃，20s，54℃，40s，72℃，40s，40个 循环。
II.实施例
实施例1、真核生物特异引物18S rRNA引物的检测结果
用真核生物18S rRNA特异引物扩增本实验提取的所有DNA溶液，所有DNA 溶液均能出现137bp的特异扩增条带。结果表明，所有抽提的DNA溶液均适合于 PCR测试。
实施例2、水牛成分的实时荧光PCR特异性检测
使用水牛成分检测引物和探针对供试的45种动植物材料DNA样品进行检 测。其中摩拉水牛、尼里-拉菲水牛、摩拉水牛与广西水牛一代杂交水牛、摩拉 水牛与广西水牛低代杂交水牛、摩拉水牛与广西水牛高代杂水牛的牛奶样品的 检测结果出现明显的扩增曲线，而在其它39个物种DNA样品中均无明显扩增， 如图1。检测结果的总结见表1。
表1、水牛成分特异性检测结果
上述结果说明，本发明的检测方法具有物种特异性。
实施例3、水牛成分的实时荧光PCR检测灵敏度
用普通牛奶(德国进口的多美鲜全脂牛奶，购自上海超市)DNA溶液10 倍系列稀释水牛DNA溶液。使用实时荧光PCR检测引物和探针对10ng/μL、 1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL和0.0001ng/μL水牛牛奶样品DNA 溶液进行实时荧光PCR测试。实验重复6次。
在6次检测中，10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL 水牛DNA溶液中均出现扩增曲线，而0.0001ng/μL水牛牛奶样品DNA未出现 扩增曲线，如图2。
实验表明，在DNA浓度的水平上，本发明的方法的检测灵敏度为0.001 ng/μL水牛牛奶样品DNA。
用普通牛奶(德国进口的多美鲜全脂牛奶，购自上海超市)10倍系列混合 配制不同含量的水牛奶样品，分别获得10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％和 0.0001％水牛奶含量(W/W)的样品，提取各样品的DNA。使用实时荧光PCR检 测引物和探针对DNA进行检测。在12次检测中，10％、1％、0.1％、0.01％水 牛奶样品提取的DNA均出现扩增曲线，而0.001％和0.0001％水牛奶样品提取 的DNA未出现扩增曲线，如图3。
上述结果表明，在重量百分比水平上，该方法的检测灵敏度为0.01％水牛 奶(W/W)。
实施例4、食品中水牛成分检测的应用
采用上述的实时荧光PCR方法，对市场上、进出口贸易途径收集的水牛 和普通黄牛、牦牛等样品进行检测。
结果，在12份进口水牛奶样品(6批艾伯丝牌水浸莫泽瑞拉干酪、1批马 苏里拉水牛奶酪、1批琦雷萨牌水牛马苏里拉奶酪、2份奇抡托牌马苏里拉水 牛奶酪、2批水牛奶马苏里拉奶酪)和3份国产水牛奶样品，PCR扩增阳性，即 含有水牛成分。在3份水牛肉样品中检出水牛成分。在普通牛奶5份、普通牛 奶酪5份、黄油2份、新鲜牛肉(黄牛肉)6份、牛肉干2份、牦牛肉干2份、饼 干、果酱、饮料等其他食品(食品标签未标注水牛成分)50份等均未呈现PCR 扩增阳性，即未检出水牛成分。在10份牛肉骨粉、20份其他饲料中未检出水 牛成分。根据上述部分样品的来源进一步查实的结果与本发明的方法的检测结 果相符。
上述结果可见，本发明找到了水牛特异性的引物，可以良好地区分水牛成 分与普通黄牛成分、牦牛成分等，也可以良好地区分水牛成分与其它各种食品、 饲料成分。且，本发明的引物针对的是在各种来源的水牛基因组中均保守的区 域，其能够检测各种不同来源的水牛。
结论
本发明利用特异性的引物和探针进行食品和饲料中水牛成分实时荧光 PCR检测，方法具有特异性。该方法DNA浓度灵敏度为0.001ng/μL，重量灵 敏度为0.01％。经实验证明，该方法操作简单快速，能准确检测出食品和饲料 中的水牛成分，且为定性定量检测乳制品中的其他组分提供了技术平台。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。