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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610753634.3 (22)申请日 2016.08.29 (71)申请人 香河县龙津生物工程有限责任公司 地址 065400 河北省廊坊市香河县刘宋镇 庆功台南林场 (72)发明人 姜龙祥石苑婷吕伟杨 (74)专利代理机构 济南诚智商标专利事务所有 限公司 37105 代理人 朱彩霞 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A23K 10/18(2016.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一种以硫酸软骨素生产工业废骨。
2、泥为原料 固体发酵生产枯草芽孢杆菌的方法 (57)摘要 本发明的提供一种以硫酸软骨素生产工业 废骨泥为原料固体发酵生产枯草芽孢杆菌的方 法， 以利用动物软骨提取硫酸软骨素工艺所产生 的工业废骨泥为基质， 混合麸皮、 水作为培养基， 高温灭菌后接入枯草芽孢杆菌进行固体发酵， 发 酵物经干燥粉碎制得枯草芽孢杆菌。 利用本发明 方法能有效利用低成本下脚料废骨泥生产高附 加值枯草芽孢杆菌， 达到变废为宝目的， 且工艺 简单、 成本低廉、 易操作。 本发明首次将硫酸软骨 素生产工业废骨泥应用于发酵生产枯草芽孢杆 菌， 开辟了硫酸软骨素生产工业废骨泥的新的用 途。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 C。
3、N 106148242 A 2016.11.23 CN 106148242 A 1.一种以硫酸软骨素生产工业废骨泥为原料固体发酵生产枯草芽孢杆菌的方法， 其特 征是， 以利用动物软骨提取硫酸软骨素工艺所产生的废骨泥为基质， 混合麸皮、 水作为培养 基， 高温灭菌后接入枯草芽孢杆菌进行固体发酵， 发酵物经干燥粉碎制得枯草芽孢杆菌； 所述废骨泥、 麸皮、 水的质量比为310 1030 2080； 所述接入枯草芽孢杆菌接菌数量为51055106个/g培养基； 所述固体发酵， 条件为温度3537， 发酵4872h。 2.如权利要求1所述的以硫酸软骨素生产工业废骨泥为原料固体发酵生产枯草芽孢杆 菌的方法。
4、， 其特征是， 所用废骨泥、 麸皮、 水质量比为3 15 30。 3.如权利要求1所述的以硫酸软骨素生产工业废骨泥为原料固体发酵生产枯草芽孢杆 菌的方法， 其特征是， 所述枯草芽孢杆菌接菌数量为1106个/g培养基。 4.如权利要求1所述的以硫酸软骨素生产工业废骨泥为原料固体发酵生产枯草芽孢杆 菌的方法， 其特征是， 所述固体发酵过程分两阶段： 1-8h采用静止培养， 8h后通过无菌风控 制温度3537， 每间隔6h开启搅拌20rpm， 时间10min。 5.如权利要求1所述的以硫酸软骨素生产工业废骨泥为原料固体发酵生产枯草芽孢杆 菌的方法， 其特征是， 所述发酵物经5060干燥至含水率低于8。
5、， 粉碎过80目筛制得饲 用枯草芽孢杆菌粉体制剂。 6.一种饲料添加剂， 其特征是， 包含权利要求5所述的饲用枯草芽孢杆菌粉体制剂。 7.硫酸软骨素生产工业废骨泥在发酵生产枯草芽孢杆菌中的用途。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106148242 A 2 一种以硫酸软骨素生产工业废骨泥为原料固体发酵生产枯草 芽孢杆菌的方法 技术领域 0001 本发明属于微生物技术领域， 具体涉及一种以硫酸软骨素生产工业废骨泥为原料 固体发酵生产枯草芽孢杆菌的方法。 背景技术 0002 硫酸软骨素在软骨组织中是以蛋白多糖形式存在， 蛋白多糖中硫酸软骨素多糖链 与核心蛋白通过共价键连接(糖肽键)， 而蛋白多糖的。
6、聚集体则通过次级键(氢键和盐键)形 成。 可见从动物软骨组织中提取硫酸软骨素必须要采取合适有效方法破坏多糖链与蛋白的 共价结合， 使多糖链与蛋白有效分离， 多糖类硫酸软骨素才能高效提取。 目前国内生产厂家 常采用蛋白酶解蛋白+等电点沉淀蛋白的方法来进行蛋白解离。 该步生产工艺会产生大量 蛋白质沉淀， 属于硫酸软骨素生产废弃物， 称为废骨泥。 废骨泥营养成分丰富， 适宜微生物 繁殖， 常规室温放置23天即可发生腐败， 产生恶臭气味， 并产生大量废液， 造成极大环境 污染， 是工业生产急需解决的问题。 0003 枯草芽孢杆菌， 中华人民共和国农业部公告第2045号 饲料添加剂品种目录 (2013)。
7、 已批准其可作为有益微生物(益生素)添加到饲料中使用。 枯草芽孢杆菌种类很多， 可产生淀粉酶、 蛋白酶、 脂肪酶、 纤维素酶等酶类， 在消化道中与动物体内的消化酶类一同 发挥作用， 降解鸡、 猪饲料中一部分不能被完全消化吸收的纤维素、 蛋白质， 提高饲料利用 率， 增加养殖动物生长速度， 还可避免这些不能被养殖动物利用的蛋白质排出体外， 被微生 物分解产生有毒有害的氨气； 同时枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、 多粘菌 素、 制霉菌素、 短杆菌肽等活性物质， 这些活性物质对动物致病菌或内源性感染的条件致病 菌有明显的抑制作用， 可有效降低动物疾病发生率。 现阶段， 随着人们健康安全意识。
8、的增 强， 枯草芽孢杆菌作为绿色、 安全、 高效的益生菌饲料添加剂， 需求量逐年增加。 0004 综上所述， 一方面工业废骨泥含有大量蛋白质、 氨基酸等营养成分， 现实中面临如 何充分利用废骨泥资源的问题； 另一方面枯草芽孢杆菌需求量逐年增加， 如果将两者有机 结合起来， 研究出易于操作、 组成简单、 便捷生产、 成本低廉的废骨泥发酵生成枯草芽孢杆 菌技术将有着重要的现实意义： 既解决废弃物废骨泥环境污染， 实现废物利用， 又可以开辟 一条更便捷、 更低廉的枯草芽孢杆菌生产的道路。 而目前利用废骨泥发酵生产枯草芽孢杆 菌未见报道。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种以硫酸软骨素生产工业。
9、废骨泥为原料固体发酵生产枯 草芽孢杆菌的方法， 利用本方法能有效利用低成本下脚料废骨泥生产高附加值枯草芽孢杆 菌， 达到变废为宝目的。 0006 为实现上述目的， 本发明所采取的技术方案是： 一种以硫酸软骨素生产工业废骨 泥为原料固体发酵生产枯草芽孢杆菌的方法， 以利用动物软骨提取硫酸软骨素工艺所产生 说明书 1/5 页 3 CN 106148242 A 3 的工业废骨泥为基质， 混合麸皮、 水作为培养基， 高温灭菌后接入枯草芽孢杆菌进行固体发 酵， 发酵物经干燥粉碎制得枯草芽孢杆菌。 0007 所述废骨泥、 麸皮、 水的质量比为310 1030 2080； 0008 所述接入枯草芽孢杆菌接菌。
10、数量为51055106个/g培养基； 0009 所述固体发酵条件为温度3537， 发酵4872h； 0010 优选地， 所用废骨泥、 麸皮、 水质量比为3 15 30。 0011 优选地， 所用枯草芽孢杆菌接菌数量为1106个/g培养基。 0012 优选地， 所用固体发酵条件为3537条件下固体发酵60h。 0013 目前常用软骨素生产工艺为动物软骨经过清洗粉碎， 加酶水解并结合等电点沉淀 分离除蛋白， 滤清液采用乙醇提取获得。 分离除蛋白生产工艺会产生大量蛋白质沉淀， 属于 硫酸软骨素生产废弃物， 称为废骨泥。 废骨泥营养成分丰富， 适宜微生物繁殖， 常规室温放 置23天即可发生腐败， 产生。
11、恶臭气味， 并产生大量废液， 造成极大环境污染， 是工业生产 急需解决的问题。 本发明人经过实践研究发现该废骨泥由于含有较多的多肽、 氨基酸、 微量 元素等营养成分可以用于发酵生产枯草芽孢杆菌。 0014 本发明人用凯氏定氮法测定了该废骨泥中含氮量， 并测定酸度和主要无机盐类， 分别为： 总氮12.1、 氨基氮2.3， 、 氯化钠0.64、 骨渣3.5、 脂肪类1.3、 pH6.57.0， 结果显示硫酸软骨素生产工业废骨泥可为饲用枯草芽孢杆菌的培养提供氮 源和无机盐等营养元素， 在此基础上本发明研究发现仅需要添加麸皮作为碳源即可满足枯 草芽孢杆菌发酵生产需要， 而无需对硫酸软骨素生产废骨泥进行。
12、任何预处理， 且适用于所 有枯草芽孢杆菌菌株。 0015 本发明首次将硫酸软骨素生产工业废骨泥应用于发酵生产枯草芽孢杆菌， 开辟了 硫酸软骨素生产工业废骨泥的新的用途。 0016 此外， 本发明还提供一种饲料添加剂， 该饲料添加剂包含所述的枯草芽孢杆菌粉 体制剂。 0017 本发明具有以下有益效果： 0018 (1)本发明解决了硫酸软骨素产生的工业废骨泥污染问题。 初步统计每年全国硫 酸软骨素产生含氮工业废水高达几十万吨， 如此大量的废物， 造成环境的极大污染。 本发明 开辟了该废骨泥的全新用途， 将其用于发酵生产饲用枯草芽孢杆菌， 变废为宝， 不再产生任 何废物或废水， 绿色环保。 不仅为企。
13、业减轻负担， 而且还可以增加企业经济收益。 0019 (2)本发明工艺简单， 易操作。 本发明所用废骨泥无需经过预处理， 直接添加麸皮 即可满足枯草芽孢杆菌发酵生产需要。 整个工艺流程简单， 且工艺控制条件温和、 设备要求 较低、 投资少、 便于工业化大规模生产应用。 0020 (3)本发明方法成本低廉， 可大幅降低枯草芽孢杆菌价格。 利用动物软骨提取硫酸 软骨素过程中产生的大量工业废弃物， 其中含有较多的蛋白质、 氨基酸等营养成分， 以前都 是作为废物排放， 无经济价值。 而添加的麸皮是小麦加工面粉后得到的副产品， ， 经济价值 也不高， 便宜易得。 且原料无需经过任何处理， 整体生产成本更。
14、为低廉。 因为目前， 枯草芽孢 杆菌活菌制剂生产过程中一般用的培养基原料有： 牛肉膏、 蛋白胨、 氯化钠、 淀粉、 葡萄糖、 尿素及其他无机盐， 显然本发明方法发酵成本低廉的多。 显然本发明方法可以大幅降低枯 草芽孢杆菌价格。 说明书 2/5 页 4 CN 106148242 A 4 0021 (4)所得枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌高。 发酵后不用再添加固形物直接干燥蒸发 粉碎后即可得菌粉。 按照GB/T26428-2010 饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测 方法 检测枯草芽孢杆菌数量达到6181010个/g。 可用于动物饲料及微生物菌肥， 促进绿色生 态农业的发展， 产生良好的经济效益和社会效。
15、应。 附图说明 0022 图1为不同培养时间对枯草芽孢杆菌菌数的影响。 0023 图2为不同接菌量对枯草芽孢杆菌菌数的影响。 具体实施方式 0024 下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行 进一步的阐述， 下述说明仅是为了解释本发明， 但不以任何方式对本发明加以限制， 基于本 发明教导所作的任何变换或替换， 均属于本发明的保护范围。 0025 本发明中所使用的方法如无特殊说明， 均为本领域常规方法。 下述实施例中所用 的试验材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0026 以下实施例所用的废骨泥为以动物软骨提取硫酸软骨素工艺所产生的废液废渣 常规过。
16、滤后的得到的。 0027 实施例1： 按照废骨泥、 麸皮、 水的质量比3 20 60配制固体发酵培养基100kg， 搅拌 均匀后， 120高温灭菌20min， 按5105个/g培养基接入枯草芽孢杆菌， 3537固体发酵 48h， 发酵过程分两阶段： 1-8h采用静止培养， 8h后通过无菌风控制温度3537， 每间隔6h 开启搅拌20rpm时间10min。 发酵48h后， 收集发酵产物。 5060干燥至含水率低于8时， 粉碎过80目筛制得饲用枯草芽孢杆菌。 按照GB/T26428-2010 饲用微生物制剂中枯草芽孢 杆菌的检测 方法检测枯草芽孢杆菌数量6.01010个/g。 0028 实施例2：。
17、 按照废骨泥、 麸皮、 水的质量比8 30 80配制固体发酵培养基100kg， 搅拌 均匀后， 120高温灭菌20min， 按1106个/g培养基接入枯草芽孢杆菌， 3537固体发酵 60h。 发酵过程分两阶段： 1-8h采用静止培养， 8h后通过无菌风控制温度3537， 每间隔6h 开启搅拌20rpm时间10min。 发酵60h后， 收集发酵产物。 5060干燥至含水率低于8时， 粉碎过80目筛制得饲用枯草芽孢杆菌。 按照GB/T26428-2010 饲用微生物制剂中枯草芽孢 杆菌的检测 方法检测枯草芽孢杆菌数量1.01011个/g。 0029 实施例3： 按照废骨泥、 麸皮、 水的质量比3。
18、 10 20配制固体发酵培养基100kg， 搅拌 均匀后， 120高温灭菌20min， 按5106个/g培养基接入枯草芽孢杆菌， 3537固体发酵 72h。 发酵过程分两阶段： 1-8h采用静止培养， 8h后通过无菌风控制温度3537， 每间隔6h 开启搅拌20rpm时间10min。 发酵72h后， 收集发酵产物。 5060干燥至含水率低于8时， 粉碎过80目筛制得饲用枯草芽孢杆菌。 按照GB/T26428-2010 饲用微生物制剂中枯草芽孢 杆菌的检测 方法检测枯草芽孢杆菌数量81010个/g。 0030 实施例4： 按照废骨泥、 麸皮、 水的质量比10 25 60配制固体发酵培养基100k。
19、g， 搅 拌均匀后， 120高温灭菌20min， 按5105个/g培养基接入枯草芽孢杆菌， 3537固体发 酵66h。 发酵过程分两阶段： 1-8h采用静止培养， 8h后通过无菌风控制温度3537， 每间隔 6h开启搅拌20rpm时间10min。 发酵66h后， 收集发酵产物。 5060干燥至含水率低于8 说明书 3/5 页 5 CN 106148242 A 5 时， 粉碎过80目筛制得饲用枯草芽孢杆菌。 按照GB/T26428-2010 饲用微生物制剂中枯草 芽孢杆菌的检测 方法检测枯草芽孢杆菌数量91010个/g。 0031 实施例5： 按照废骨泥、 麸皮、 水的质量比3 15 30配制固。
20、体发酵培养基100kg， 搅拌 均匀后， 120高温灭菌20min， 按1106个/g培养基接入枯草芽孢杆菌， 3537固体发酵 60h.发酵过程分两阶段： 1-8h采用静止培养， 8h后通过无菌风控制温度3537， 每间隔6h 开启搅拌20rpm时间10min。 发酵60h后， 收集发酵产物。 5060干燥至含水率低于8时， 粉碎过80目筛制得饲用枯草芽孢杆菌。 按照GB/T26428-2010 饲用微生物制剂中枯草芽孢 杆菌的检测 方法检测枯草芽孢杆菌数量1.81011个/g。 0032 对照例6： 按照废骨泥、 麸皮、 水的质量比0 15 30配制固体发酵培养基100kg， 搅拌 均匀后。
21、， 120高温灭菌20min， 按1106个/g培养基接入枯草芽孢杆菌， 3537固体发酵 48h， 发酵过程分两阶段： 1-8h采用静止培养， 8h后通过无菌风控制温度3537， 每间隔6h 开启搅拌20rpm时间10min。 发酵48h后， 收集发酵产物。 5060干燥至含水率低于8时， 粉碎过80目筛制得饲用枯草芽孢杆菌。 按照GB/T26428-2010 饲用微生物制剂中枯草芽孢 杆菌的检测 方法检测枯草芽孢杆菌数量5108个/g。 0033 通过实施例1-5与对照例6进行比较结果显示： 仅用麸皮、 水发酵枯草芽孢杆菌， 枯 草芽孢杆菌数达到5108个/g， 添加废骨泥后， 枯草芽孢杆。
22、菌数提高到6181010个/g， 提 高了120360倍。 0034 实验例1.单因素实验法考察麸皮废骨泥比例、 料水比、 培养时间、 接菌量等因素对 发酵产枯草芽孢杆菌的影响 0035 (1)麸皮、 废骨泥作为枯草芽孢杆菌碳氮源， 碳氮比对枯草芽孢杆菌生长至关重 要， 影响菌体产量与质量。 依照本发明提供方法， 采用单因素实验设计， 将废骨泥： 麸皮比例 分别设置为2:1、 1:1、 1:3、 1:5、 1:7、 1:10、 1:15， 进行枯草芽孢杆菌培养， 实验结果见表1。 0036 表1不同废骨泥： 麸皮比例发酵获得的枯草芽孢杆菌数 0037 0038 从表1可以看出， 废骨泥： 麸皮。
23、1:11： 10时， 枯草芽孢杆菌菌数可达1010数量级 以上， 尤其废骨泥： 麸皮1:5时， 枯草芽孢杆菌菌数达到最高， 1.81011， 因此废骨泥： 麸皮 1:5时本发明方法培养芽孢杆菌最佳配比。 0039 (2)固态发酵最大特点就是无游离水， 底物含水量的变化对微生物生长代谢能力 会产生重要影响。 依照本发明提供方法， 采用单因素实验设计， 将料水比例分别设置为2:1、 说明书 4/5 页 6 CN 106148242 A 6 1.5:1、 1:1、 3:5、 1:2、 1:4、 1:6， 进行枯草芽孢杆菌培养， 实验结果见表2 0040 表2不同料水比例对枯草芽孢杆菌菌数影响 004。
24、1 0042 0043 从表2可以看出， 料水3:5时， 枯草芽孢杆菌菌数达到最高， 1.31011， 因此料水 比3:5时本发明方法培养芽孢杆菌最佳配比。 0044 (3)微生物培养中， 发酵时间是一个重要指标， 时间长达影响菌体生长， 也与生产 成本、 生产能耗直接相关。 依照本发明提供方法， 采用单因素实验设计， 将培养时间分别设 置为12h、 24h、 36h、 48h、 60h、 72h、 84h， 进行枯草芽孢杆菌培养， 实验结果见图1。 0045 从图1可以看出， 培养时间60h， 枯草芽孢杆菌菌数达到最高， 因此本发明方法培养 芽孢杆菌最适宜培养时间为60h。 0046 (4)初始接菌量多少与发酵周期相关， 依照本发明提供方法， 采用单因素实验设 计， 将接菌量分别设置为1105、 3105、 5105、 1106、 3106、 5106个/g培养基， 进行枯 草芽孢杆菌培养， 实验结果见图2 0047 从图2可以看出， 接菌量1106个/g培养基， 枯草芽孢杆菌菌数达到最高， 为本发 明方法培养芽孢杆菌最适宜接菌量。 说明书 5/5 页 7 CN 106148242 A 7 图1 图2 说明书附图 1/1 页 8 CN 106148242 A 8 。