《一株高产漆酶菌株及发酵产漆酶的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一株高产漆酶菌株及发酵产漆酶的方法.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN102080046A43申请公布日20110601CN102080046ACN102080046A21申请号201010289892322申请日20100925CCTCCNOM201023520100915C12N1/14200601C12N9/02200601C12R1/64520060171申请人江南大学地址214122江苏省无锡市蠡湖大道1800号江南大学生物工程学院72发明人廖祥儒张峰刘家扬蔡宇杰54发明名称一株高产漆酶菌株及发酵产漆酶的方法57摘要本发明提供了一株高产漆酶的密孔菌属菌株PYCNOPORUSSPSYBCL3，已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为C。
2、CTCCNOM2010235，保藏日期2010年9月15日。同时还发明了以该菌为出发菌种，经种子培养和以豆粕或硝酸钠为氮源、以麦芽糖或葡萄糖、果糖、纤维二糖等为碳源发酵生产漆酶的方法，发酵液最高酶活可达60000U/L以上。所产漆酶可广泛应用于食品、农业、工业废水处理等领域，属于生物技术领域。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页序列表1页附图2页CN102080049A1/1页21一株高产漆酶的密孔菌属菌株，命名为PYCNOPORUSSPSYBCL3，已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM2010235，保藏。
3、日期2010年09月15日。2用权利要求1所述的菌株发酵生产漆酶的方法，其特征在于用该菌为出发菌种，经种子培养和以豆粕或硝酸钠为氮源，以麦芽糖或葡萄糖、果糖、纤维二糖等为碳源发酵生产漆酶，工艺为1种子培养种子培养基以质量体积浓度计5葡萄糖，1酵母汁，05蛋白胨。接种工艺取斜面菌种一环在PDA平板上点接菌丝，30培养7天，取一平板用10ML无菌水冲洗，并打碎成均匀的孢子悬液取1ML孢子悬液接入250ML规格的三角瓶，装液量为50ML。培养条件转速200RPM，温度30，恒温培养2天，即为发酵产酶的种子。2产酶培养产酶培养基1L培养基计算豆粕或硝酸钠6G，麦芽糖或葡萄糖、果糖、纤维二糖12G，五水。
4、硫酸铜04G，磷酸二氢钾1G，磷酸氢二钠02G，七水硫酸镁05G，硫酸锰0034G初始PH自然。发酵罐规格为5L容量实际发酵产酶培养基装液量为3L。发酵参数接种量10，转速200R/MIN温度30度通气量14L/MIN培养时间58天。权利要求书CN102080046ACN102080049A1/4页3一株高产漆酶菌株及发酵产漆酶的方法技术领域0001本发明利用一株高产漆酶的菌株PYCNOPORUSSPSYBCL3及利用该菌株经种子培养和以豆粕或硝酸钠为氮源，以麦芽糖或葡萄糖、果糖、纤维二糖等为碳源发酵生产漆酶发酵生产漆酶的方法，所制备的酶能被应用于食品、农业、畜牧业、工业和环境废水处理等方面，。
5、属于生物技术领域。背景技术0002漆酶LACCASE，EC11032是一种含铜的多酚氧化酶，具有广泛的底物，不仅能催化氧化多种芳香族化合物，还能降解木质素、去除许多有毒酚类物质如苯氧基类除草剂等的毒性，还可以使多种染料脱色及去除石油工业废水的毒性，因此在造纸、环保、食品、医药卫生、生物检测、改善草坪土壤结构等领域具有较大的研究和应用价值。0003漆酶广泛分布于真菌、植物、动物、细菌和昆虫中。但用于生产漆酶的主要是担子菌亚门的白腐真菌。0004现有研究表明，漆酶在制浆、织物脱色、生物传感器、食品工业、环保等方面的应用有巨大的潜力。发明内容0005本发明筛选并提供了一株高产漆酶的野生菌株PYCNO。
6、PORUSSPSYBCL3及利用该菌株经种子培养和以豆粕或硝酸钠为氮源，以麦芽糖或葡萄糖、果糖、纤维二糖等为碳源发酵生产漆酶的方法，所制备的漆酶可广泛应用于食品、农业、畜牧业、工业和环境废水处理等方面，来替代价格昂贵的进口漆酶。0006本发明的技术方案一种高产漆酶的密孔菌属菌株，其命名为PYCNOPORUSSPSYBCL3，已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM2010235，保藏日期2010年09月15日。0007用该菌为出发菌种，经种子培养和以豆粕或硝酸钠为氮源，以麦芽糖或葡萄糖、果糖、纤维二糖等为碳源发酵生产漆酶；工艺为00081种子培养0009种子培养基以质量体积浓。
7、度计5葡萄糖，1酵母汁，05蛋白胨。接种工艺取斜面菌种一环在PDA平板上点接菌丝，30培养7天，取一平板用10ML无菌水冲洗，并打碎成均匀的孢子悬液取1ML孢子悬液接入250ML规格的三角瓶，装液量为50ML。0010培养条件转速200RPM，温度30度，恒温培养2D，即为发酵罐发酵产酶的种子。00112产酶培养0012产酶培养基培养基1L豆粕或硝酸钠6G，麦芽糖或葡萄糖、果糖、纤维二糖12G，五水硫酸铜04G，磷酸二氢钾1G，磷酸氢二钠02G，七水硫酸镁05G，硫酸锰0034G初始PH自然。0013发酵罐规格为容量5L实际发酵产酶培养基装液量为3L说明书CN102080046ACN10208。
8、0049A2/4页40014发酵参数转速200R/MIN温度30度通气量14L/MIN120H。0015根据上述条件，在5L发酵罐中进行发酵，发酵液的漆酶活力最高达60000U/L以上。0016本发明从广东省采集的枯木中筛选出一种高产漆酶的野生密孔菌属菌株，命名为PYCNOPORUSSPSYBCL3。00171、本菌株的筛选001811平板初筛0019样品的处理方法将材料用少量无菌水30浸泡24H，之后采用梯度稀释法稀释至108，取1ML均匀涂布在121灭菌20MIN的含有愈创木酚萘酚004的PDA马铃薯20，葡萄糖2，琼脂2平板培养基上30恒温培养3D，挑取周边有红色变色圈的菌落划线分离。将。
9、分离后的能产生变色圈的菌株重新接种至新的平板，并记录其变色圈直径，筛选出产漆酶活力较高的菌株保藏备用。002012摇瓶复筛0021将长满菌丝的平板用10ML无菌水冲洗，吸取1ML接入种子培养基葡萄糖5，酵母膏1，蛋白胨05，PH自然，121灭菌20MIN，种子培养基装液量为250ML三角瓶中装50ML培养基，培养温度30、转速200R/MIN摇床恒温培养48小时，取菌悬液按接种量10接入液态发酵基础培养基葡萄糖1，酒石酸铵04，KH2PO401，NA2HPO4002，MGSO47H2O005，CUSO400007，MNSO400034，121灭菌20MIN，液态发酵基础培养基装液量为250ML。
10、三角瓶中装50ML培养基，培养温度30、转速200R/MIN，摇床恒温培养8天。002213经上述两种方法筛选最终筛选到一株漆酶活力相对较高的菌株，平板菌落图1，电镜图2，16SRDNA序列鉴定见序列并鉴定确定为密孔菌属，命名为PYCNOPORUSSPSYBCL3。00232、酶活的测定方法00243ML反应体系中包括05ML10MMOL/LDMP2，6二甲氧基酚，24ML01MOL/L磷酸氢二钠柠檬素缓冲液PH35，01ML粗酶液发酵液经冷冻高速离心机12000G、4离心10分钟，得到上清液即为粗酶液，视活力稀释，以去离子水替代粗酶液溶液作为空白对照，在469NM处测吸光值每隔10S读取一次。
11、吸光度值，一般持续进行1MIN后停止测定，以反应的线性范围计算酶活。酶活力定义1分钟催化一微摩尔底物所需酶量，酶活性以UL1表示。0025本发明的有益效果0026首先提供了一株高产漆酶的菌株及用该菌为出发菌株采用液体发酵制备漆酶的方法。本发明的菌种和发酵产酶方法与其它菌种和制备漆酶的方法相比较，具有如下特点00271、发酵性能稳定，菌体易于培养00282、产酶周期短，在第5天即可停止发酵00293、产酶活力高，最高可达60000U/L以上00304、粗酶液中漆酶含量约占总蛋白含量的80以上，在胞外成为主导产物，便于分离纯化说明书CN102080046ACN102080049A3/4页50031。
12、5、粗酶性质稳定，以DMP为底物时，在酸性环境下能发挥最大催化功效，最适温度为55度，较耐热。00326、作用底物广泛，有广阔的应用前景0033因此本发明的菌株和发酵产漆酶的方法所生产出来的漆酶可广泛使用于食品、农业、畜牧业、工业和环境废水处理等方面，并可替代价格昂贵的进口漆酶，因此本发明的菌种和发酵产酶方法有广泛的工业使用价值和显著的经济效益前景。0034附图表说明0035图1和图2分别为PYCNOPORUSSPSYBCL3菌株平板菌落和扫描电镜形态。0036生物材料样品保藏0037PYCNOPORUSSPSYBCL3已保存于已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM2010。
13、235，保藏日期2010年9月15日具体实施方式0038实施例10039取斜面菌种一环在PDA平板上点接菌丝，30培养7天，取一平板用10ML无菌水冲洗，并打碎成均匀的孢子悬液每1ML孢子悬液接入50ML种子培养基250ML规格的三角瓶，准备若干份。培养条件转速200RPM，温度30度，恒温培养2D，即为发酵产酶的种子。0040在5L发酵罐中装入3L产酶培养基，按10接种量，加入上述发酵产酶种子，培养条件为转速200R/MIN温度30通气量14L/HOUR培养时间120H，发酵液酶活力达60200U/L。0041产酶培养基为豆粕18G，麦芽糖36G，五水硫酸铜12G，磷酸二氢钾3G，磷酸氢二钠。
14、06G，七水硫酸镁15G，硫酸锰0102G初始PH自然。0042实施例20043发酵产酶种子的培养同例1。0044在5L发酵罐中装入3L产酶培养基，按10接种量，加入上述发酵产酶种子，培养条件为转速200R/MIN温度30通气量14L/HOUR培养时间120H，发酵液酶活力达48200U/L。0045产酶培养基为豆粕18G，葡萄糖36G，五水硫酸铜12G，磷酸二氢钾3G，磷酸氢二钠06G，七水硫酸镁15G，硫酸锰0102G初始PH自然。0046实施例30047发酵产酶种子的培养同例1。0048在5L发酵罐中装入3L产酶培养基，按10接种量，加入上述发酵产酶种子，培养条件为转速200R/MIN温。
15、度30通气量14L/HOUR培养时间120H，发酵液酶活力达53000U/L。0049产酶培养基为豆粕18G，果糖36G，五水硫酸铜12G，磷酸二氢钾3G，磷酸氢二钠06G，七水硫酸镁15G，硫酸锰0102G初始PH自然。0050实施例40051发酵产酶种子的培养同例1。说明书CN102080046ACN102080049A4/4页60052在5L发酵罐中装入3L产酶培养基，按10接种量，加入上述发酵产酶种子，培养条件为转速200R/MIN温度30通气量14L/HOUR培养时间120H，发酵液酶活力达51800U/L。0053产酶培养基为硝酸钠18G，麦芽糖36G，五水硫酸铜12G，磷酸二氢钾3G，磷酸氢二钠06G，七水硫酸镁15G，硫酸锰0102G初始PH自然。说明书CN102080046ACN102080049A1/1页7序列表序列表CN102080046ACN102080049A1/2页8说明书附图CN102080046ACN102080049A2/2页9图2说明书附图CN102080046A。