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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710219103.0 (22)申请日 2017.04.06 (71)申请人 南华大学 地址 421001 湖南省衡阳市常胜西路28号 南华大学环境保护与安全工程学院环 境工程系108室 (72)发明人 谭文发丁蕾江雨萌范嘉庆 吕俊文张杰谢超罗洋 (74)专利代理机构 济南诚智商标专利事务所有 限公司 37105 代理人 牟海峰 (51)Int.Cl. C12N 11/14(2006.01) C12N 1/36(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C02。
2、F 101/20(2006.01) (54)发明名称 一种聚磷菌印迹生物炭的制备方法及应用 (57)摘要 本发明一种聚磷菌印迹生物炭的制备方法 及应用， 本发明提供的负载聚磷菌的生物炭可以 为微生物提供了一个良好的生存环境， 而且还可 以帮助聚磷菌提高抵御高盐度和重金属的能力， 同时吸附位点增多， 且具有相当的稳定性， 对重 金属的吸附性能大大提高， 产品无毒， 对环境友 好， 本发明提供的制备方法简易， 易于工业化生 产。 权利要求书2页 说明书5页 附图4页 CN 107129982 A 2017.09.05 CN 107129982 A 1.一种聚磷菌印迹生物炭的制备方法， 其特征在于，。
3、 包括以下步骤： (1)取5-10g锯末， 在200-700温度下进行厌氧恒温热解4h； 完全炭化后冷却至室温取 出， 得生物炭， 将生物炭混匀研磨， 过100目筛， 于干燥器中保存备用； (2)取10g活性污泥加入90ml无菌水中混匀， 室温静置10min， 取上清液倍比稀释， 不同 梯度倍比稀释液分别利用倒平板培养方法培养， 在出现明显单菌落的梯度平板中， 分离纯 化至平板上的单菌落形态一致， 得初纯菌株， 接于LB固体培养基斜面上， 4保存备用； (3)取一部分初纯菌株接入驯化培养基三角瓶中， 以温度为30、 转速为150r/min条件 下进行恒温好氧培养24h； 取另一部分初纯菌株接入。
4、另一驯化培养基三角瓶中， 将瓶中充入 氮气进行厌氧培养24h； 分别对好氧培养中菌体积累的聚磷颗粒和厌氧培养条件下菌体内 积累PHB颗粒进行染色， 选取在两种染色方法中都呈阳性的菌体为初筛菌； (4)将初筛菌株接入聚磷培养液中， 在30、 转速为150r/min摇床振荡培养12h， 然后在 10000r/min转速下-30冷冻离心10min， 取上清液稀释， 用钼锑抗分光光度法， 在700nm处 测量其吸光度， 计算磷的去除率， 取菌体聚磷率大于60的菌株为复筛菌； (5)步骤1)中得到的磷基生物炭和复筛菌按照质量比20:1的比例， 分别加入固定化培 养基中， 在温度30、 160r/min的。
5、恒温摇床中震荡培养18h， 然后用30目的筛子过滤出吸附 好菌体的磷基生物炭， 即聚磷菌印迹生物炭。 2.根据权利要求1所述的一种聚磷菌印迹生物炭的制备方法， 其特征在于， 制备生物炭 厌氧恒温热解温度为400-500。 3.根据权利要求1所述的一种聚磷菌印迹生物炭的制备方法， 其特征在于， 所述的稀释 倒平板培养方法为： 取上清液通过10倍稀释法将其制成浓度分别为10-1到10-6的6种菌悬 液， 分别取0.2ml不同浓度的菌液均匀涂布到固体富磷平板上， 于30培养箱培养24h。 4.根据权利要求1所述的一种聚磷菌印迹生物炭的制备方法， 其特征在于， 所述的富磷 培养基包括牛肉膏3g/L， 。
6、蛋白胨10g/L， 氯化钠5g/L， 磷酸二氢钾0.2g/L， 琼脂18g/L， 富磷培 养基pH为7.0。 5.根据权利要求1所述的一种聚磷菌印迹生物炭的制备方法， 其特征在于， 所述的驯化 培养基包括乙酸钠0.34g/L， 氯化铵0.076g/L， 硫酸镁0.02g/L， 氯化钙0.01g/L， 磷酸二氢钾 0.09g/L， 碳酸氢钠0.3g/L， 微量元素混合液1ml， 驯化培养基pH7.5。 6.根据权利要求5所述的一种聚磷菌印迹生物炭的制备方法， 其特征在于， 所述的微量 元素混合液包括： 乙二酸四乙胺10g/L， 硫酸亚铁1.54g/L， 硼酸0.15g/L， 五水硫酸铜0.03g。
7、/ L， 氯化锰0.12g/L， 碘化钾0.18g/L， 钼酸钠0.06g/L， 七水硫酸锌0.12g/L， 六水合二氯化钴 0.15g/L。 7.根据权利要求1所述的一种聚磷菌印迹生物炭的制备方法， 其特征在于， 所述的聚磷 培养液包括： 牛肉膏0.22g/L， 乙酸钠0.5g/L， 硫酸镁0.4g/L， 硫酸亚铁0.002g/L， 硫酸铜 0.08g/L， 硫酸铵0.2g/L， 磷酸氢二钾0.0147g/L， 聚磷培养液pH7.0。 8.一种聚磷菌印迹生物炭吸附剂的应用， 其特征在于， 所述的聚磷菌印迹生物炭由上 述1-7所述的一种聚磷菌印迹生物炭的制备方法制得， 其应用于重金属废水的处理。
8、。 9.根据权利要求8所述的一种聚磷菌印迹生物炭吸附剂的应用， 其特征在于， 所述聚磷 菌印迹生物炭在重金属废水中用量为0.30.6g/L。 10.根据权利要求8所述的一种聚磷菌印迹生物炭吸附剂的应用， 其特征在于， 所述聚 权利要求书 1/2 页 2 CN 107129982 A 2 磷菌印迹生物炭在重金属废水中反应条件为： 重金属废水pH值57， 反应时间为36h。 权利要求书 2/2 页 3 CN 107129982 A 3 一种聚磷菌印迹生物炭的制备方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及一种聚磷菌印迹生物炭的制备方法， 特别涉及一种聚磷菌印迹生物炭 的制备方法及应用。 背景技术 0。
9、002 我国每年有大量的锯末、 秸杆等生物质遭到焚烧浪费， 这不仅会给环境带来污染 危害， 还会造成生物能源的浪费和损失。 如何充分而又合理地利用这类 “废料” ， 使其变废为 宝， 这是需要人们亟待解决的问题。 通过热解、 改性制得的生物炭具有一定的吸附重金属作 用， 能降低环境重金属的迁移性、 生物有效性， 被广泛研究， 然而， 单一的生物炭由于本身表 面吸附位点非常有限， 其吸附性能和稳定性受到很大限制。 因此， 研究开发新型的具有高吸 附容量、 钝化性质稳定和廉价实用的吸附剂， 是其进一步发展和应用的关键， 具有重要意 义。 0003 聚磷类菌种是矿渣/土壤中常见的一类微生物， 其可作。
10、为环境载体吸持包括Cr、 U 等在内的污染物， 或通过矿化沉淀等作用改变Cr、 Pb的形态将其吸附固定， 进而降低废水中 重金属的含量或土壤中重金属的迁移性、 生物有效性和毒性。 为了使聚磷菌固定在生物炭 的表面， 增加聚磷菌附着吸附点位及稳定性， 以期在载体的保护下提高细胞对重金属的耐 受性， 增加单位体积内的生物量， 协同生物炭的作用提高对重金属的吸附效率。 发明内容 0004 本发明目的在于针对现有技术存在的技术问题， 开发一种高吸附容量、 性质稳定 和廉价实用的可用于吸附处理重金属离子的固定化微生物印迹生物炭。 0005 为实现上述目的， 本发明提供的技术方案包括以下步骤： 0006 。
11、(1)取5-10g锯末， 在200-700温度下进行厌氧恒温热解4h； 完全炭化后冷却至室 温取出， 得生物炭， 将生物炭混匀研磨， 过100目筛， 于干燥器中保存备用； 0007 (2)取10g活性污泥加入90ml无菌水中混匀， 室温静置10min， 取上清液通过10倍稀 释法将其制成浓度分别为10-1到10-6的6种菌悬液， 分别取0.2ml不同浓度的菌液均匀涂布 到固体富磷平板上， 于30培养箱培养24h， 在出现明显单菌落的梯度平板中， 挑取单菌落 转接到富磷培养基上反复纯化至平板上的单菌落形态一致， 得初纯菌株， 接于LB固体培养 基斜面上， 4保存备用； 0008 (3)将一部分初。
12、纯菌株接入驯化培养基三角瓶中， 瓶口用八层纱布封口， 置于恒温 培养摇床以温度为30、 转速为150r/min条件下进行好氧培养24h， 显微镜观察好氧培养条 件下菌体积累聚磷颗粒的情况； 另外， 将另一部初纯菌株接入另一驯化培养基三角瓶中， 随 后将瓶中充入氮气使瓶内处于厌氧状态， 用橡胶塞密封进行好氧培养24h， 显微镜观察厌氧 培养条件下菌体内积累PHB颗粒的情况； 分别对好氧培养中菌体积累的聚磷颗粒和厌氧培 养条件下菌体内积累的PHB颗粒进行染色， 选取在两种染色方法中都呈阳性的菌体为初筛 菌； 说明书 1/5 页 4 CN 107129982 A 4 0009 (4)将初筛菌株接入聚。
13、磷培养液中， 在30、 转速为150r/min摇床振荡培养12h， 然 后在10000r/min转速下-30冷冻离心10min， 取上清液稀释， 用钼锑抗分光光度法， 在 700nm处测量其吸光度， 计算磷的去除率， 取菌体聚磷率大于60的菌株为复筛菌； 0010 (5)步骤1)中得到的磷基生物炭和复筛菌按照质量比20:1的比例， 分别加入固定 化培养基中， 固定化培养基包括： 蔗糖10g/L， 牛肉膏6g/L， 酵母粉1.5g/L， pH7.0， 将固定化 培养基在温度30、 160r/min的恒温摇床中震荡培养18h， 然后用30目的筛子过滤出吸附好 菌体的磷基生物炭， 即聚磷菌印迹生物炭。
14、。 0011 优选的， 制备生物炭厌氧恒温热解温度为400-500。 0012 优选的， 所述的富磷培养基包括： 牛肉膏3g/L， 蛋白胨10g/L， 氯化钠5g/L， 磷酸二 氢钾0.2g/L， 琼脂18g/L， 富磷培养基pH为7.0。 0013 优选的， 所述的驯化培养基包括： 乙酸钠0.34g/L， 氯化铵0.076g/L， 硫酸镁0.02g/ L， 氯化钙0.01g/L， 磷酸二氢钾0.09g/L， 碳酸氢钠0.3g/L， 微量元素混合液1ml， 驯化培养基 pH7.5。 0014 优选的， 所述的微量元素混合液包括： 乙二酸四乙胺10g/L， 硫酸亚铁1.54g/L， 硼 酸0.1。
15、5g/L， 五水硫酸铜0.03g/L， 氯化锰0.12g/L， 碘化钾0.18g/L， 钼酸钠0.06g/L， 七水硫 酸锌0.12g/L， 六水合二氯化钴0.15g/L。 0015 优选的， 所述的聚磷培养液包括： 牛肉膏0.22g/L， 乙酸钠0.5g/L， 硫酸镁0.4g/L， 硫酸亚铁0.002g/L， 硫酸铜0.08g/L， 硫酸铵0.2g/L， 磷酸氢二钾0.0147g/L， 聚磷培养液 pH7.0。 0016 本发明还提供了一种聚磷菌印迹生物炭的应用， 所述的聚磷菌印迹生物炭由上述 的一种聚磷菌印迹生物炭吸附剂的制备方法制得， 其应用于重金属废水的处理。 0017 优选的， 聚磷。
16、菌印迹生物炭在重金属废水中用量为0.30.6g/L。 0018 优选的， 聚磷菌印迹生物炭在重金属废水中反应条件为： 重金属废水pH值57， 反 应时间为36小时。 0019 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 0020 本发明所公开的生物质炭在优选温度400-500范围内制备， 最大限度降低制备 过程有机碳的损失， 又尽可能提高了所形成高度芳香化有机化合物的稳定性； 然后将培养 至对数生长期的假单胞菌接种到发酵罐中， 并加入生物炭， 将聚磷菌进行固定化处理， 得到 聚磷菌印迹生物炭吸附剂。 0021 利用本发明方法制备得到的负载聚磷菌的生物炭对于重金属废水处理有特别优 良的效果， 以重金。
17、属Cr及金属U离子为例， 将负载聚磷菌的生物炭投加到含Cr及U溶液中， 经 聚磷菌与生物炭协同作用， 吸附很快达到平衡， 它可使废水中的铬、 金属铀含量分别下降 80.2-82.1与78.9-82.7。 0022 本发明使用主要原料锯末来源广泛， 制备生物炭使其变废为宝， 其它的诸如浓硝 酸， 磷酸钙是常用的化工产品； 聚磷菌常见于城市生活污水处理的剩余污泥中， 分离， 提取 方便。 0023 与现有生物炭或类生物炭吸附剂技术相比， 本发明提供的负载聚磷菌的生物炭可 以为微生物提供了一个良好的生存环境， 而且还可以帮助聚磷菌提高抵御高盐度和重金属 的能力， 同时吸附位点增多， 且具有相当的稳定。
18、性， 对重金属的吸附性能大大提高； 产品无 说明书 2/5 页 5 CN 107129982 A 5 毒， 对环境友好， 本发明提供的制备方法简易， 易于工业化生产。 附图说明 0024 下面结合附图对本发明作进一步说明： 0025 图1聚磷菌印迹生物炭的扫描电镜图； 0026 图2聚磷菌印迹生物炭的放大扫描电镜图； 0027 图3聚磷菌印迹生物炭的能谱图； 0028 图4普通生物炭的扫描电镜图； 0029 图5普通生物炭的放大扫描电镜图； 0030 图6普通生物炭的能谱图； 0031 图7普通生物炭与聚磷菌印迹生物炭的红外光谱测试图。 具体实施方式 0032 以下的实施例便于更好地理解本发明。
19、， 但并不限定本发明。 下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 0033 实施例1： 0034 (1)取510g锯末， 200-700温度下进行厌氧恒温热解4h； 完全炭化后冷却至室 温取出， 得生物炭， 将生物炭混匀研磨， 过100目筛， 于干燥器中保存备用； 0035 (2)取10g活性污泥加入90ml无菌水中混匀， 室温静置10min， 取上清液通过10倍稀 释法将其制成浓度分别为10-1到10-6的6种菌悬液， 分别取0.2ml不同浓度的菌液均匀涂布 到固体富磷平板上， 于30培养箱培养24h， 在出现明显单菌落的梯度平板中， 挑取单菌落 转接到富磷培养基上反复纯化。
20、至平板上的单菌落形态一致， 得初纯菌株， 接于LB固体培养 基斜面上， 4保存备用； 0036 (3)将一部分初纯菌株接入驯化培养基三角瓶中， 瓶口用八层纱布封口， 置于恒温 培养摇床以温度为30、 转速为150r/min条件下进行好氧培养24h， 显微镜观察好氧培养条 件下菌体积累聚磷颗粒的情况； 另外， 将另一部分初纯菌株接入另一驯化培养基三角瓶中， 随后将瓶中充入氮气使瓶内处于厌氧状态， 用橡胶塞密封进行好氧培养24h， 显微镜观察厌 氧培养条件下菌体内积累PHB颗粒的情况； 分别对好氧培养中菌体积累的聚磷颗粒和厌氧 培养条件下菌体内积累的PHB颗粒进行染色， 选取在两种染色方法中都呈阳。
21、性的菌体为初 筛菌； 0037 聚磷颗粒异染粒染色方法： 0038 (1)染色液 0039 甲液： 体积分数95乙醇2ml、 甲苯胺蓝0.15g、 冰醋酸1ml、 孔雀绿0.2g、 蒸馏水 100ml。 先将染料溶于乙醇中， 向其中加入事先混合的冰醋酸和蒸馏水， 放置24h后过滤备 用； 0040 乙液： 碘2g、 碘化钾3g、 蒸馏水100ml。 0041 (2)染色步骤 0042 滴一滴无菌水于载玻片上， 用接菌环蘸取少量菌落于无菌水中， 风干固定； 用甲液 染5min， 倾去甲液， 用乙液冲去甲液， 并染色1min， 用蒸馏水冲洗后吸干； 聚磷菌体内有异染 说明书 3/5 页 6 CN 。
22、107129982 A 6 色颗粒， 阳性会有黑色物质， 其他部分为深绿色或浅绿色。 0043 PHB颗粒染色 0044 (1)染色液 0045 苏丹黑3g/L： 苏丹黑0.3g， 体积分数70乙醇100ml， 混合用力振荡， 放置过夜备 用。 0046 二甲苯： 褪色剂蕃红水溶液50g/L： 复染液 0047 (2)染色步骤 0048 按常规染色制成涂片， 用甲液染色5min， 倾去甲液， 用乙液冲去甲液， 并染1min， 水 洗， 吸干， 镜检， PHB在染色后， 阳性会变为蓝黑色， 其他部分为红色。 0049 (4)将初筛菌株分别接入装有50mL聚磷培养液的三角瓶中， 在30、 转速为1。
23、50r/ min摇床振荡培养12h， 然后在10000r/min转速下离心10min， 倾出上清液， 移取2mL稀释至 50mL， 与未接种菌的聚磷培养液做对照， 用钼锑抗分光光度法， 在700nm处测量其吸光度， 通 过标准曲线查得磷浓度， 计算磷的去除率， 取菌体聚磷率大于60的菌株为复筛菌； 0050 (5)称取4g步骤1)中得到的磷基生物炭， 同时配置固定化培养基， 固定化培养基包 括： 蔗糖10g/L， 牛肉膏6g/L， 酵母粉1.5g/L， pH7.0； 按5质量浓度接种量接入活化后的复 筛菌， 加入称量好的磷基生物炭， 放入30、 160r/min的恒温摇床中震荡培养18h， 然。
24、后用30 目的筛子过滤出吸附好菌体的磷基生物炭， 即聚磷菌印迹生物炭。 0051 上述步骤制得的聚磷菌印迹生物炭外观呈黑色， 比表面积在25.42-56.27m2/g之 间， 将其置于扫描电镜下观察， 其结构如图1-3所示， 通过与图4-6(普通生物炭)SEM-EDS对 比可以看出聚磷菌印迹生物炭表面0.16的磷元素， 说明其表面含有一定比例的含磷菌 株， 即聚磷菌。 0052 实施例2 0053 本发明的聚磷菌印迹生物炭应用于处理废水中的Cr离子， 包括以下步骤： 取100mL 初始浓度为10100mg/L的Cr6+溶液， 调节溶液的pH值为6.0， 加入实施例1制得的聚磷菌印 迹生物炭吸附。
25、剂， 该吸附剂的用量为0.25g/L， 在30恒温振荡器进行吸附反应3小时， 再将 该吸附剂从废水中分离， 用AAS测定废水中剩余的Cr6+的含量， 计算的吸附量结果如表1所 示： 0054 表1： 聚磷菌印迹生物炭对不同Cr6+初始浓度废水的吸附量 0055 0056 由表1可知， 在初始浓度为10.01mg/L的条件下该吸附剂具有8.75mg/g的吸附量， 并随Cr6+初始浓度的增加而增加， 到一定值后25.44mg/g基本达到稳定。 0057 实施例3 0058 本发明的聚磷菌印迹生物炭用于处理废水中的放射性金属UO2+离子， 包括以下步 说明书 4/5 页 7 CN 107129982。
26、 A 7 骤： 取100mL初始浓度为10100mg/L的UO2+溶液， 调节溶液的pH值为6.0， 加入实施例1制得 的聚磷菌印迹生物炭吸附剂， 该吸附剂的用量为0.25g/L， 在30恒温振荡器进行吸附反应 3小时， 再将该吸附剂从废水中分离， 用AAS测定废水中剩余的UO2+的含量， 计算的吸附量结 果如表1所示： 0059 表2： 聚磷菌印迹生物炭对不同Cr6+初始浓度废水的吸附量 0060 0061 由表2可知， 在初始浓度为10.03mg/L的条件下该吸附剂具有17.13mg/g的吸附量， 并随UO2+初始浓度的增加而增加， 到一定值后26.52mg/g基本达到稳定。 0062 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出： 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进， 这些改进应视为本发明的保 护范围。 说明书 5/5 页 8 CN 107129982 A 8 图1 图2 说明书附图 1/4 页 9 CN 107129982 A 9 图3 图4 说明书附图 2/4 页 10 CN 107129982 A 10 图5 图6 说明书附图 3/4 页 11 CN 107129982 A 11 图7 说明书附图 4/4 页 12 CN 107129982 A 12 。