发明详述 本发明第一方面提供了降低油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 和 / 或生物燃料中的固 醇糖苷的量 ( 或除去固醇糖苷 ) 的方法， 所述方法包括将一种或多种酶和包含固醇糖苷的 油或脂混合 ； 从而使所述一种或多种酶降解所述固醇糖苷。
本发明第二方面提供了一种或多种酶在油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 中用于降低 固醇糖苷的量 ( 或除去固醇糖苷 ) 的应用。
本发明第三方面提供了通过本发明的方法可获得的 ( 优选获得的 ) 一种或多种油 或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 或生物燃料。
本发明第四方面提供了一种或多种油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 或生物燃料， 其 中所述油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 和 / 或生物燃料的固醇糖苷的量与没有经过本发明的 酶处理的相当的 (comparable) 油或脂相比降低。
本发明另一方面提供了用于生产生物燃料的酶组合物， 所述酶组合物包含一种或 多种能够水解固醇糖苷和 / 或酰化固醇糖苷中的糖苷键的酶， 合适地， 所述酶组合物包含 一种或多种葡糖苷酶， 合适地， 所述酶组合物包含一种或多种 β- 葡糖苷酶， 合适地， 所述 酶组合物包含一种或多种淀粉葡糖苷酶。
合适地， 在本发明方法和 / 或应用中使用的一种或多种酶可以为以下酶中的一种 或多种 ： 能够进行糖苷键裂解的酶， 尤其是能够进行固醇糖苷和 / 或酰化固醇糖苷中的糖 苷键的裂解的酶， 能够进行以下反应的酶 ：
； 糖苷酶 (E.C.3.2.1.X)， 如 β- 葡糖苷酶、 淀粉葡糖苷酶 (E.C.3.2.1.3)。
合适地， 用于本发明的一种或多种酶可以为以下酶中的一种或多种 ： 能够水解固 醇糖苷和 / 或酰化固醇糖苷中的糖苷键的酶。
合适地， 用于本发明的一种或多种酶可以为以下酶中的一种或多种 ： 葡糖苷酶， 如 β- 葡糖苷酶或淀粉葡糖苷酶或具有淀粉葡糖苷酶活性的另外的酶。
在一个实施方式中， 适合用在本发明中的酶可以为果胶酶 GrindamylTM Ca 150( 可 获自 Danisco A/S)。不期望受理论约束， 认为 GrindamylTM Ca 150 是除了果胶酶活性之外 还具有多种副活性的酶制剂。这些副活性之一可以为 β- 葡糖苷酶活性。不期望受理论约 束， 认为就是这种 β- 葡糖苷酶副活性使所述酶组合物 GrindamylTM Ca 150 能够水解固醇 糖苷和 / 或酰化固醇糖苷中的糖苷键。
适合本发明使用的酶可以为淀粉葡糖苷酶 AMG8000( 可获自 DaniscoA/S)。在一个实施方式中， 淀粉葡糖苷酶或能够进行固醇糖苷和 / 或酰化固醇糖苷中的 糖苷键的裂解的酶与油或脂肪 ( 例如生物燃料底物 )、 水和能够进行油或醇的酯交换的酶 混合。
在一个实施方式中， 合适的油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 可以为生物柴油底物 ( 即适合形成生物柴油的油或脂 )。
在一个实施方式中， 合适的油或脂可以为生物燃料底物 ( 如生物柴油底物 )。
在另一个实施方式中， 合适的油或脂可以为食品工业中使用的油或脂。
在再一个实施方式中， 可以将从中除去固醇糖苷和 / 或固醇糖苷含量降低的油或 脂用作生物燃料底物和 / 或可以将其用在食品工业中。
在一个实施方式中， 油或脂 ( 例如生物燃料底物， 如生物柴油底物 ) 可以为植物油 或植物脂。
在再一个实施方式中， 油或脂 ( 例如生物燃料底物， 如生物柴油底物 ) 可以为包含 固醇糖苷的油或脂 ( 合适地为植物油或植物脂 )。
在另一个实施方式中， 油或脂 ( 例如生物燃料底物， 如生物柴油底物 ) 可以为选 自以下组成的组的植物油 ： 菜籽油、 芥花籽油 (canola oil)、 大豆油、 米糠油、 棕榈油、 玉米 油、 棉籽油、 向日葵油、 红花油、 旱金莲籽油 (nasturtium seed oil)、 芥菜籽油、 橄榄油、 芝 麻油、 花生油、 巴巴苏坚果油 (babassu nut oil)、 蓖麻油、 棕榈仁油、 低芥子酸菜籽油、 羽 扇豆油 (lupin oil)、 麻风树油、 椰子油、 亚麻籽油、 月见草油、 霍霍巴油、 非洲酪脂树坚果油 (shea nut oil) 或亚麻荠油。 在一个实施方式中， 优选油或脂 ( 例如生物燃料底物， 如生物柴油底物 ) 可以为选 自以下组成的组的植物油 ： 菜籽油、 芥花籽油、 大豆油、 米糠油、 棕榈油、 玉米油、 棉籽油和向 日葵油。
在一个实施方式中， 合适地， 生物燃料可以为生物柴油。
在一个实施方式中， 合适地， 所述方法可以进一步包括脱胶步骤， 例如水 - 脱胶步 骤。
本发明使用的 “水 - 脱 胶 步 骤”通 常 可 以 通 过 将 0.5-3 ％ w/w 的 热 水 和 温 (60-90℃ ) 原油 (crude oil) 混合而进行。通常的处理时间为 30-60 分钟。所述水 - 脱胶 步骤除去当水合时在油中变得不溶的磷脂和粘胶。所述水合磷脂和胶可以通过沉淀、 过滤 或离心 ( 离心为最常用的操作 ) 而从油中分离。所述水 - 脱胶步骤的主要目的是从油中分 离水合磷脂。在本发明中上述将热水混合在油中广义应理解为根据本领域标准的水 - 脱胶 方法将含水溶液混入油中。
在另一个实施方式中， 本发明的方法可以进一步包括酶促脱胶步骤
在另一个实施方式中， 本发明的方法可以包括其中将水加入到油或脂 ( 如生物燃 料底物 ) 中的酶促脱胶步骤。合适地， 在酶促脱胶步骤过程中加入的水量可以为油重量的 约 0.1％ - 约 5％ ( 通常为约 2％ w/w 酶 / 油 )。
合适地， 在脱胶步骤 ( 例如水脱胶步骤和 / 或酶促脱胶步骤 ) 之前、 过程中和 / 或 之后利用本发明的一种或多种酶减少固醇糖苷的量。换而言之， 所述一种或多种酶 ( 如葡 糖苷酶， 如淀粉葡糖苷酶 ) 与油或脂 ( 如生物燃料底物 ) 的混合发生在脱胶步骤 ( 例如水 脱胶步骤和 / 或酶促脱胶步骤 ) 之前、 过程中和 / 或之后。
在再一个实施方式中， 本发明的方法可以包括酯交换步骤。
在一个实施方式中， 合适地， 所述方法可以进一步包括离心步骤。
合适地， 在离心步骤之前、 过程中和 / 或之后利用本发明的一种或多种酶减少固 醇糖苷的量。换而言之， 所述一种或多种酶 ( 如葡糖苷酶， 如淀粉葡糖苷酶 ) 与油或脂 ( 如 生物燃料底物 ) 的混合发生在离心之前、 过程中和 / 或之后。
在一个实施方式中， 所述方法可以在约 30℃ -70℃进行， 合适地在约 40℃ -60℃进 行， 合适地在约 45℃ -55℃进行， 合适地在约 50℃进行。
合适地， 所述方法可以在原油 ( 粗油 ) 上进行。
合适地， 所述方法可以在将油或脂 ( 例如生物燃料底物， 如生物柴油底物 ) 加工成 生物燃料 ( 或生物柴油 ) 的过程中， 在油或脂 ( 例如生物燃料底物， 如生物柴油底物 ) 上进 行。
在一个实施方式中， 合适地， 可以在油的精炼过程中将一种或多种酶与油 ( 优选 植物油， 如生物燃料底物 ) 混合。
当油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 经历脱胶步骤时， 可以在将水加入到油或脂 ( 例 如生物燃料底物 ) 中的脱胶步骤的过程中加入酶。在一个实施方式中， 可以在酶促脱胶步 骤的过程中加入所述酶。 当油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 经历酯交换步骤 ( 可以利用催化油和甲醇之间的 酯交换的酶进行该步骤 ) 时， 还可以在酶促酯交换步骤过程中将本发明的酶加入到油或脂 中。
在另一个实施方式中， 合适地， 可以将一种或多种酶和水与油或脂 ( 优选植物油， 如生物燃料底物 ) 混合。
在另一个实施方式中， 合适地， 可以在油进行酶促脱胶步骤的同时将一种或多种 酶与所述油或脂 ( 优选植物油， 如生物燃料底物 ) 混合， 合适地， 在所述酶促脱胶步骤中将 水加入到油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 中。
在另一个实施方式中， 合适地， 可以在油或脂进行酯交换 ( 优选酶促酯交换 ) 步骤 的同时将一种或多种酶与所述油或脂 ( 优选植物油， 如生物燃料底物 ) 混合。
在一个实施方式中， 优选与未经处理的油或脂 ( 例如生物燃料底物 )( 即相同的油 或脂 ( 如生物燃料底物 ) 但未经本发明方法处理 ) 相比， 通过本发明的方法可获得 ( 优选 获得 ) 的油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 所含的固醇糖苷较少。
在一个实施方式中， 优选与未经处理的生物燃料 ( 例如生物柴油 )( 即相同生物燃 料但未经本发明方法处理 ) 相比， 通过本发明的方法可获得 ( 优选获得 ) 的生物燃料 ( 例 如生物柴油 ) 所含的固醇糖苷较少。
不期望受理论约束， 本发明使用的酶可以通过水解固醇糖苷以形成游离的固醇和 糖或酰化糖 ( 取决于固醇糖苷是否被酰化 ) 而除去固醇糖苷。
在一些实施方式中， 本发明可以包括除去油或脂中形成的任何游离固醇的步骤。 例如， 可以在进一步加工油或脂的过程中、 之前或之后除去游离固醇。 当油或脂用在食品工 业中时， 这可能尤其有益。
合适地， 本发明的方法和应用除去油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 中的至少 20％、 50％、 80％的固醇糖苷。
测定油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 或生物燃料中的固醇糖苷的量
可以通过任何常规方法测定油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 和 / 或生物燃料中的固 醇糖苷的量。
可 以 通 过， 例 如 Phillips et al.(2005)， Journal of Food Lipids， 12(2)， 124-140 中描述的固相提取法和气相色谱法测定油或脂中的固醇糖苷量。
可以利用标准的滤器堵塞试验， 如 D 2068“Standard Test Method for Filter Blocking Tendency of Distillate Fuel Oils” 中的 ASTM 法测定生物柴油的质量。当使 用所述标准滤器阻塞试验测定时， 根据本发明除去固醇糖苷的生物柴油的质量好于相当的 对照生物柴油 ( 与本发明的相同， 只是不经历本发明的方法 )。
当指油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 中和 / 或生物燃料中的固醇糖苷量 “减少” 或 “降低” 时， 术语 “减少” 或 “降低” 表示与相当的油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 或生物燃料 ( 除了没有加入本发明的酶外， 其与所请求保护的生物燃料底物或生物燃料相同 ) 相比。
优点
本发明提供了用于除去油和脂 ( 尤其是用作生物燃料底物或在食品工业中使用 的油或脂 ) 和 / 或生物燃料 ( 如生物柴油 ) 中的固醇糖苷的简便且成本合算的方法。 本发明的一个优点是可以在固醇糖苷沉淀前除去油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 和 / 或生物燃料 ( 如生物柴油 ) 中的固醇糖苷。
本发明的另一个优点是可以在加工过程中除去油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 中的 固醇糖苷。
本发明的另一个优点是无需为了除去油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 和 / 或生物燃 料 ( 如生物柴油 ) 中的固醇糖苷而进行离心或过滤步骤。
本发明的再一个优点是其是有效除去油或脂 ( 例如生物燃料底物和 / 或食物油或 脂 ) 和 / 或生物燃料中的固醇糖苷的方法。
本发明的再一个优点是不需要用于除去油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 和 / 或生物 燃料 ( 如生物柴油 ) 中的固醇糖苷的专门的或昂贵的离心或过滤设备。
本发明的另一个优点是产生的生物燃料 ( 尤其是生物柴油 ) 即使在贮存 ( 如贮存 数周 ) 后仍能够通过 “滤器阻塞试验” 。
固醇糖苷
固醇糖苷由与一个固醇分子的羟基相连的一个碳水化合物单元组成。 所述固醇部 分可以为菜油固醇、 豆固醇、 谷固醇、 菜子固醇和二氢谷固醇。 所述糖部分可以由葡萄糖， 木 糖， 甚至是阿拉伯糖 (Graminae) 组成。当所述糖部分为葡萄糖时， 固醇糖苷可以指固醇葡 糖苷 (steryl glucoside)。在本发明中， 术语固醇糖苷意在涵盖固醇葡糖苷。
在一个实施方式中， 所述固醇糖苷为固醇葡糖苷。
所述糖部分可以通过糖苷键与固醇部分连接。所述糖部分可以在碳 6 位置被酰 化。
固醇糖苷以酰化和未酰化形式天然存在于油和脂 ( 尤其是植物油和脂 ) 中。当为 酰化形式时， 其极易溶于油。在本发明中， 术语 “固醇糖苷” 表示酰化和未酰化的固醇糖苷 两者。类似地， 本发明使用的术语 “固醇葡糖苷” 表示酰化和未酰化的固醇葡糖苷两者。
在用于将油或脂 ( 例如生物燃料底物 ) 转化成生物燃料 ( 例如生物柴油 ) 的步骤
的过程中， 酰化固醇糖苷被转化成未酰化固醇糖苷， 而未酰化固醇糖苷的熔点高且较不易 溶于生物柴油或柴油燃料混合物中。
固醇糖苷 ( 例如固醇葡糖苷 ) 能够沉淀， 以在燃料中形成分散的细固体颗粒， 该细 固体颗粒通过简单加热不能通过堵塞的燃料滤器。这些颗粒还可促进其它燃料组分的结 晶， 这可恶化冷结晶组分 ( 如单甘油酯 ) 的问题。
固醇糖苷可以在任何温度下 ( 不仅仅在冷温度下 ) 形成聚集物。固醇糖苷在生物 燃料中的水平即使很低 ( 例如 10-90ppm) 也可以形成聚集物。
固醇糖苷具有约 240℃的高熔点， 因此不能简单地通过熔解除去包含固醇糖苷的 聚集物。
植物原油中固醇糖苷的量是可变的。
大豆原油中固醇糖苷的量高于通常用于制造生物燃料的其它一些油， 如菜籽油、 玉米油、 棉油或向日葵油。
仅作为示例， 将不同植物油中存在的固醇糖苷的水平示于下表 ：
植物油 大豆油 玉米油 向日葵油
固醇糖苷的水平 (ppm) 2300 500 300生物燃料
在本发明中将生物燃料 ( 还可以指农作物燃料 (agrofuel 或 agrifuel)) 宽泛地 定义为包含或源自最近死亡的生物材料 ( 最常见的是植物 ) 的固体、 液体或气体燃料。这 使其与源自死亡时间很长的生物材料的石油燃料不同。
理论上， 可以由任意 ( 生物 ) 碳源产生生物燃料。目前最常见的是捕获太阳能的 光合植物。多种不同的植物和源自植物的物质都可用于生产生物燃料。
全球都在使用生物燃料， 且生物燃料工业正在欧洲、 亚洲和美洲扩大。 最常使用的 生物燃料为用于汽车运输的液体燃料。可再生生物燃料的使用降低了对石油的依赖性， 并 增强了能源安全。
在一个实施方式中， 优选地， 本发明教导的生物燃料为液体燃料。 所述生物燃料优 选用于运输的液体生物燃料。
在一个实施方式中， 优选地， 所述生物燃料为生物柴油。
油或脂
合适地， 油或脂可以为植物油或脂或经加工的植物油或脂。
合适地， 用于本发明的油或脂 ( 优选植物油或脂 ) 可以为包含固醇糖苷的任意油 或脂 ( 优选植物油或脂 )。
在一个实施方式中， 所述油或脂为包含至少 10ppm 固醇糖苷的油或脂。
用于本发明的植物油或脂可以选自由以下组成的组中的一种或多种 ： 菜籽油、 芥花籽油、 大豆油、 米糠油、 棕榈油、 玉米油、 棉籽油、 向日葵油、 红花油、 旱金莲籽油、 芥菜籽 油、 橄榄油、 芝麻油、 花生油、 巴巴苏坚果油、 蓖麻油、 棕榈仁油、 低芥子酸菜籽油、 羽扇豆油、 麻风树油、 椰子油、 亚麻籽油、 月见草油、 霍霍巴油、 非洲酪脂树坚果油或亚麻荠油。
用于本发明的植物油或脂可以选自由以下组成的组中的一种或多种 ： 菜籽油、 大 豆油 ( 也称为豆油 )、 向日葵油、 芥花籽油、 棕榈油、 米糠油、 棉油和玉米油。
在一个实施方式中， 优选地， 所述植物油为大豆油。
在一个实施方式中， 优选地， 所述油可以为源自藻类的油。
在一个实施方式中， 所述油或脂 ( 优选植物油或脂 ) 适合用于生产生物燃料， 如生 物柴油， 并由此被分别认为是 “生物燃料底物” 或 “生物柴油底物” 。
在一些实施方式中， 所述油或脂可以为动物脂和 / 或油。
所述油或脂可以为原油或者可以为经加工的油。 本发明使用的术语 “经加工的油” 表示已经经过一些形式的加工 ( 例如精炼、 漂白、 脱胶、 酯交换和 / 或除臭 ) 的油。
在一些实施方式中， 所述油或脂可以为氢化油、 油或脂衍生物， 或者油或脂的一部 分。
在一个实施方式中， 优选地， 所述油或脂为原油 ( 优选为植物原油 ) 和 / 或经加工 的油 ( 优选经加工的植物油 )。 在一个实施方式中， 优选地， 所述油或脂用于生产生物燃料， 并由此被认为是生物 燃料底物， 合适地为生物柴油底物。
在另一个实施方式中， 所述油或脂可用于生产用于食品工业的食用油或脂， 在这 种情况下， 所述油或脂被认为是可食用的油或脂。
生物燃料底物
本发明使用的生物燃料底物表示可以被转化成生物燃料 ( 优选液体生物燃料 ) 的 任何物质。合适地， 所述生物燃料底物为最近死亡的生物物质， 最常见的为植物。
在一个实施方式中， 优选地， 所述生物燃料底物为油或脂。
生物柴油
生物柴油与常规的石油柴油类似， 但其由植物或动物脂和油产生。目前生物柴油 越来越受欢迎， 原因是其被作为对环境的损害可能比化石燃料小的可再生的碳中性燃料。 生物柴油可以被用作用于柴油发动机的石油柴油的替代燃料， 并且通常被用作石油柴油的 添加物。纯生物柴油被分类为 B100， 但其经常与石油柴油混合， 由此含 20％生物柴油的柴 油为 B20。
多数生物柴油通常在催化剂的存在下， 由三甘油酯 ( 如油和 / 或脂 ) 和醇的酯交 换产生， 从而形成酯和甘油。所述催化剂通常为氢氧化钠或氢氧化钾。由于甲醇和乙醇是 商业生物柴油生产中最常用的醇， 商业生产的多数生物柴油都包含脂肪酸的甲酯或乙酯。
生物柴油为生物燃料， 并且其化学名称为脂肪酸甲 ( 或乙 ) 酯 (FAME)。
在一个实施方式中， 所述生物柴油可以为由混合有石油柴油的植物和 / 或动物脂 或油生产的生物柴油。
在一个实施方式中， 优选地， 本发明所指的所述生物燃料为生物柴油。
食物
在一个实施方式中， 所述油或脂可以被用作食物， 或用在食物的制备中。 在本发明
中使用的术语 “食物” 具有宽泛的含义且涵盖人用食物和动物用食物 ( 即饲料 )。在优选方 面， 所述食物用于人消费。
所述食物可以为溶液或固体的形式， 这取决于应用和 / 或使用的形式和 / 或施用 的形式。
一方面， 根据本发明制备的油或脂可以用于选自以下一种或多种的食品中 ： 蛋， 基于蛋的产品， 包括但不限于蛋黄酱、 沙拉调料、 沙司、 冰淇淋、 改良的蛋黄和由其制造 的产品 ； 焙烤食品， 包括面包、 蛋糕、 甜面团产品 (sweet dough product)、 叠层面团产品 (laminated dough)、 液态奶蛋糊、 松饼、 炸面圈、 饼干、 薄脆饼干和曲奇饼 ； 糖果， 包括巧克 力、 冰糖、 焦糖、 halawa、 口香糖 ( 包括不含糖的口香糖和加糖变甜的口香糖， 泡泡糖、 软泡 泡糖、 橡皮糖和布丁 ； 冷冻产品， 包括果汁冰糕， 优选冷冻乳制品， 包括冰淇淋和牛奶冻 ； 乳 制品， 包括干酪、 黄油、 乳、 咖啡奶精、 生奶油、 乳蛋糕乳脂、 乳饮料和酸乳酪 ； 幕斯、 搅打植物 奶油 (whipped vegetable cream) ； 食用油和脂、 搅打起泡和不起泡的产品、 水包油乳液、 油 包水乳液、 人造黄油、 起酥油和涂抹食品 (spreads)， 包括低脂和超低脂涂抹食品 ； 调味品、 蛋黄酱、 蘸酱、 基于奶油的沙司、 基于奶油的汤、 饮料、 调味乳液和沙司。
在一个实施方式中， 所述油或脂可以为食用油或脂、 搅打起泡和不起泡的产品、 水 包油乳液、 油包水乳液、 人造黄油、 起酥油和涂抹食品 (spreads)， 包括低脂和超低脂涂抹食 品。 食品组分
可以将本发明的组合物用作食品组分。
本发明使用的术语 “食物组分” 包括可以加入到食品中或者为食品的制品。本发 明使用的术语食品组分还指能够以低水平用在需要乳化、 凝胶化、 组织化 (texturising)、 稳定化、 悬浮、 成膜和结构化、 保持多汁并改善口感的多种产品中的制品。
所述食品组分可以是液体或固体的形式， 这取决于应用和 / 或使用的形式和 / 或 施用的形式。
本发明的酶
本发明的酶是指能够切断固醇糖苷和 / 或酰化固醇糖苷的糖苷键的酶。
在一个实施方式中， 所述酶可以被称为 “糖苷酶” 。本发明使用的术语 “糖苷酶” 可 以指能够裂解固醇糖苷和 / 或酰化固醇糖苷的糖苷键的酶， 优选在以下教导的测试条件下 ( 使用固醇糖苷和 / 或酰化固醇糖苷底物 ) 能够切断固醇糖苷和 / 或酰化固醇糖苷的糖苷 键的酶。
如果在以下教导的测试条件下， 糖苷酶水解固醇糖苷底物中的固醇糖苷， 则糖苷 酶被认为是适合本发明使用的酶 (( 如糖苷酶 )。
根据本发明测定酶是否裂解固醇糖苷和 / 或酰化固醇糖苷中的糖苷键的实验 ：
利用以下步骤制备固醇糖苷底物 ( 可以为酰化的或未酰化的 ) ：
在 7ml 微量玻璃瓶 (dram glass) 中称量 1.0mg 固醇糖苷 ；
加入 10μl 99％的乙醇 ；
加入 200μl 50mM HEPES 缓冲液， pH 7 ；
加入含 0.4％ Triton X100 的 300μl 10mM HEPES 缓冲液。
通过在 40℃搅动 30 分钟分散固醇糖苷。
利用感兴趣的酶按照以下方法处理 5×100μl 固醇糖苷底物样品。 表1 样品号 1 2固醇糖苷底物 μl 100 100
水 μl 10
感兴趣的酶 μl 10
将 100μl 固醇糖苷底物转移到 Eppendorf 试管中并置于 40℃的振荡孵箱中。加 入酶或水， 并将反应混合物在 40℃温育 16 小时。
利用 1ml 氯仿萃取反应混合物。分离氯仿相并在氮气流下蒸干。
将样品重新溶解在 200μl 氯仿∶甲醇 (2 ∶ 1) 中， 然后通过 HPTLC 分析 ( 按照实 施例 1 中的教导 )。 为了证明固醇的形成， 还可以利用植物固醇为对照物， 通过 GLC( 按照实 施例 1 中的教导 ) 分析样品。
利用感兴趣的酶处理固醇糖苷时由固醇糖苷形成的游离固醇证实了所述酶能够 裂解固醇糖苷和 / 或酰化固醇糖苷的糖苷键， 并且能够用在本发明中。 在本发明的一个实施方式中， 所述酶能够裂解 ( 或者可以裂解 ) 固醇葡糖苷和 / 或酰化固醇葡糖苷的糖苷键。
在一个实施方式中， 所述酶可以为 “葡糖苷酶” 。本发明使用的术语 “葡糖苷酶” 可 以表示优选在以下教导的试验条件下， 能够裂解固醇葡糖苷和 / 或酰化固醇葡糖苷中的糖 苷键的酶。
根据本发明测定酶是否裂解固醇葡糖苷和 / 或酰化固醇葡糖苷中的糖苷键的实 验：
利用以下步骤制备固醇葡糖苷底物 ( 其可以为酰化的或未酰化的 )， 例如来自 Matreya， Pennsylvania 的固醇葡糖苷 98％ ：
在 7ml 微量玻璃瓶 (dram glass) 中称量 1.0mg 固醇葡糖苷 ；
加入 10μl 99％的乙醇 ；
加入 200μl 50mM HEPES 缓冲液， pH 7 ；
加入含 0.4％ Triton ×100 的 300μl 10mM HEPES 缓冲液。
通过在 40℃搅拌 30 分钟分散固醇葡糖苷。
利用感兴趣的酶按照以下方法处理 5×100μl 固醇葡糖苷底物的样品。
表1
样品号 1 2
固醇葡糖苷底物 μl 100 100
水 μl 10
感兴趣的酶 μl 10
将 100μl 固醇葡糖苷底物转移到 Eppendorf 试管中并置于 40℃的振荡孵箱中。 加入酶或水， 并将反应混合物在 40℃温育 16 小时。
利用 1ml 氯仿萃取反应混合物。分离氯仿相并在氮气流下蒸干。
将样品重新溶解在 200μl 氯仿∶甲醇 (2 ∶ 1) 中， 然后通过 HPTLC 分析 ( 按照实 施例 1 中的教导 )。 为了证实固醇的形成， 还可以利用植物固醇为对照物， 通过 GLC( 按照实 施例 1 中的教导 ) 分析样品。
利用感兴趣的酶处理固醇葡糖苷时由固醇葡糖苷形成的游离固醇证实了所述酶 能够裂解固醇葡糖苷和 / 或酰化固醇葡糖苷的糖苷键， 并且能够用在本发明中。
在一个实施方式中， 本发明使用的 “糖苷酶” 包括 “葡糖苷酶” 。本发明使用的术语 “葡糖苷酶” 表示能够进行以下反应 ( 其中固醇葡糖苷为酰化或未酰化的形式 ) 的酶 ：
在一个实施方式中， 合适地， 所述酶可以为葡糖苷酶。 在一个实施方式中， 所述酶可以为 β- 糖苷酶 ( 如 β- 葡糖苷酶 ) 或淀粉葡糖苷酶。 在一个实施方式中， 用于本发明的酶可以为 β- 糖苷酶 ( 如 β- 葡糖苷酶 )。
合 适 地， 如 果 所 述 酶 为 β- 糖 苷 酶 ( 如 β- 葡 糖 苷 酶 )， 则所述酶可以为以 下酶中的一种或多种： 固 醇 基 -β- 葡 糖 苷 酶 (E.C.3.2.1.104) ； 1， 3-β- 葡 糖 苷 酶 (E.C.3.2.1.58) 和 / 或葡聚糖 1， 4β- 葡糖苷酶 (E.C.3.2.1.74)。
在另一个实施方式中， 所述糖苷酶为淀粉葡糖苷酶 (E.C.3.2.1.3( 根据国际生 物化学和分子生物学联盟命名委员会在 1992 年酶的命名和分类会议上的建议的酶命名 法 ))。 淀粉葡糖苷酶 (EC.3.2.1.3) 是高果糖玉米糖浆 (HFCS) 制造商使用的一种重要的工 业用酶。在本发明中， 淀粉葡糖苷酶还可以指葡聚糖 1， 4-α- 葡糖苷。
用于本发明的酶可以水解液化淀粉中的 1， 4-α 键和 1， 6-α 键和 / 或 β- 键。在 利用例如淀粉葡糖苷酶水解的过程中， 以逐步的方式将葡萄糖单元从底物分子的非还原末 端除去。水解速度取决于键的类型以及链长度， 即水解 1， 4-α 键比水解 1， 6-α 键容易， 并 且麦芽三糖和麦芽糖的断裂速度小于更长链的寡糖。
作为用于本发明的酶的主要活性或副活性， 其可以裂解固醇糖苷的糖苷键。
用于本发明的一个合适的酶可以为真菌的淀粉葡糖苷酶， 如可获自 ( 获自 ) 真菌 黑曲霉 (Aspergillus niger) 菌株的淀粉葡糖苷酶。
适合本发明应用的酶可以为天然存在的 ( 和任选分离的 ) 酶或经过基因修饰的 酶。
糖 苷 酶 ( 或 适 合 本 发 明 应 用 的 酶 ) 的 最 佳 pH 可 以 为 约 3.0- 约 7.0， 优选约 4.0-7.0， 最佳温度为约 55℃ - 约 80℃， 合适地为约 75℃。
在一个实施方式中， 合适的淀粉葡糖苷酶可以为 AMG 8000TM( 可获自 Danisco A/ S-Denmark)。
一些酶组合物 ( 例如果胶酶组合物固体 Grindamyl Ca150TM) 可以具有糖苷酶活性 ( 即能够裂解固醇糖苷的糖苷键 )。此类酶组合物的糖苷酶活性可以为副活性 ( 次于主要 ( 在此处为果胶酶 ) 活性的活性 )。
因此， 在一个实施方式中， 合适地， 具有糖苷酶活性 ( 即能够裂解固醇糖苷的糖苷 键 ) 的酶可以为果胶酶组合物。在一个实施方式中， 所述具有糖苷酶活性的果胶酶可以为 TM Grindamyl Ca 150。
所述用于本发明的酶 ( 例如葡糖苷酶 ) 可以以每千克油约 0.1mg- 约 50mg 酶蛋白 的剂量用于本发明， 优选以每千克油约 1mg- 约 10mg 酶蛋白的剂量用于本发明。
脱胶
食用油精炼的目的是除去影响质量 ( 例如味道、 气味和外观 ) 和耐储性的不期望 的杂质。
由于所述杂质 ( 游离脂肪酸、 金属离子、 颜色化合物、 香料、 胶等 ) 的多样性， 通常 采用一系列的化学和物理性质的工艺进行精炼。
传统使用两种工艺用于油的脱胶， 即物理脱胶工艺和化学脱胶工艺。
在所谓的化学精炼中， 通过利用大大过量的 NaOH 进行初始处理除去几乎所有的 游离脂肪酸量。同时， 磷脂的含量也降低至通常低于 10ppm 的磷水平。随后对油进行漂白 和除臭。
所谓的物理精炼通常由水脱胶步骤和随后的酸脱胶、 中和、 漂白、 汽提 ( 以除去游 离脂肪酸和除臭 ) 组成。
与在物理精炼过程中使用酸脱胶不同， 开发了使用酶促脱胶。
所 述 酶 促 脱 胶 步 骤 是 基 于 使 用 胰 磷 脂 酶 而 开 发 的。 由 于 该 酶 是 不 洁 净 的 (non-kosher)， 因 此 磷 脂 酶 最 终 被 微 生 物 磷 脂 酶 A1(Lecitase UltraTM-Novozymes， Denmark) 代替 (Oil Mill Gazetteer， Vol 111 July 2005 pp2-4)。
所述酶促步骤与所述化学或物理脱胶步骤相比具有几个优点， 包括节省成本、 产 率高和对环境更加友好。
所述酶促油脱胶步骤基于向已进行水脱胶的油中添加磷脂酶。
在 WO2006/008508 中教导了脂质酰基基转移酶在食用油的酶促脱胶中的应用。WO 2006/008508 教导了向水脱胶的油中添加脂质酰基基转移酶或者向原油中添加脂质酰基基 转移酶而无需使油经历水脱胶步骤。
“水脱胶的油” 通常可以通过常规的 “水脱胶步骤” 而获得， 该步骤包括将 1-2％ w/w 的热软水和温 (70℃ -90℃ ) 原油 (AOCS 对脂和油的加工的介绍 - 表 8- 脱胶步骤 -http:// www.aocs.org/meetings/education/mod3sample.pdf)。经验规则是向原油中加入的水量 通常约等于原油中的磷脂量。通常的处理时间为 30-60 分钟。所述水脱胶步骤除去了在水 合时在油中变得不溶的磷脂和粘胶。所述水合磷脂和胶可以通过沉淀、 过滤或离心 ( 离心 为更常用的操作 ) 而从油中分离。所述水 - 脱胶步骤的主要目的是从油中分离水合磷脂。 上述将热水混合在油中在本发明中应被广义理解为根据本领域标准的水 - 脱胶方法将含 水溶液混合入油中。传统的水脱胶步骤中将磷脂的主要部分去除在重的胶相中。在水脱胶步骤结束 时， 将油相与胶相分离。 胶相虽然可以进一步加工成商品， 但其主要被视为油精炼的副产品 (bi-product)。具有商业重要性的是油相。然而， 由于磷脂可以为良好的乳化剂， 因此在水 脱胶过程中不可避免地损失一些油。
本发明 ( 例如添加一种或多种酶以除去固醇糖苷 ) 可以与脱胶 ( 例如化学脱胶、 水脱胶或酶促脱胶 ) 组合使用。为除去固醇糖苷所添加的所述一种或多种酶可以在脱胶步 骤前、 过程中或之后加入。
与其它酶的组合
合适地， 本发明使用的酶 ( 例如糖苷酶 ) 可以与另外的酶组合使用。
在一个实施方式中， 合适地， 本发明使用的酶 ( 例如糖苷酶 ) 可以与以下酶中 的一种或多种组合使用 ： 具有脂质酰基转移酶活性的酶 (E.C.2.3.1.43) ； 具有糖脂酶 (glycolipase) 活性的酶 (E.C.3.1.1.26)， 具有磷脂酶 A2 活性的酶 (E.C.3.1.1.4)， 具有 磷脂酶 A1 活性的酶 (E.C.3.1.1.32)。合适地， 具有这些活性的酶是本领域熟知的， 例如包 括以下脂肪酶 ： 磷脂酶 A1 LECITASE ULTRA(Novozymes A/S， Denmark)， 磷脂酶 A2( 例如 磷脂酶 A2， 来自 Biocatalysts 的 LIPOMODTM 22L， 来自 Genencor 的 LIPOMAXTM 和 LysoMax PLA2TM)， LIPOLASE (Novozymes A/S， Denmark)。 在一些实施方式中， 将用于本发明的酶 ( 例如糖苷酶 ) 和脂质酰基转移酶和 / 或 磷脂酶 ( 如磷脂酶 A1、 磷脂酶 A2、 磷脂酶 B、 磷脂酶 C 和 / 或磷脂酶 D) 组合可能是有益的。
分离
一方面， 本发明使用的酶为回收的 / 分离的酶。因此， 所述酶可以是分离的形式。
术语 “分离的” 表示序列或蛋白至少基本不含至少一种其它组分， 其中所述序列或 蛋白与所述其它组分本质上天然相关且天然存在。
纯化
一方面， 本发明使用的酶可以为纯化的形式。
术语 “纯化的” 表示所述序列处于相对纯的状态， 例如至少约 51％的纯度， 或者至 少约 75％， 或者至少约 80％， 或者至少约 90％的纯度， 或者至少约 95％的纯度或者至少约 98％的纯度。
下文将仅以示例的方式参考以下附图和实施例对本发明进行描述。
附图说明 图 1 表示与 1) 水、 2)Grindamyl Ca 150、 3)AMG 8000(Danisco A/S) 一起温育的固 醇糖苷 (SG) 的 HPTLC 结果。
实施例 1
利用酶除去 / 降解固醇糖苷
材料
固醇葡糖苷， 98％， 来自 Matreya， Pennsylvania。
酶：
果胶酶 Grindamyl Ca150( 货号 1222616)
淀粉葡糖苷酶 AMG 8000( 货号 1205013)
HPTLC
点样器 (Applicator) ： CAMAG 点样器 AST4。
HPTLC 板 ： 20×10cm(Merck no.1.05641)
使用前通过将色谱板在烤箱中于 160℃干燥 20-30 分钟活化色谱板。
点样 ： 使用 AST4 点样器将 8.0μl 溶解在氯仿∶甲醇 (2 ∶ 1) 的萃取脂质加到 HPTLC 板上。 还向 HPTLC 板上加入 0.1μl、 0.3μl、 0.5μl、 0.8μl、 1.5μl 已知浓度的标准 组分的标准溶液。
运行缓冲液 1 ： P- 醚∶甲基叔丁醚 (MTBE) ∶乙酸 (50 ∶ 50 ∶ 1)
点样 / 洗脱时间 ： 12 分钟
运行缓冲液 4 ： 氯仿∶甲醇∶水 (65 ∶ 25 ∶ 4)
展开 ： 7cm， 利用自动展开室 ADC 2。
衍生化液体 (Derivatization fluid) ： 含 6％乙酸铜的 16％ H3PO4
洗脱后， 将色谱板在烤箱于 160 ℃干燥 10 分钟， 冷却并浸入显色液体中， 然后在 160℃再干燥 5 分钟。通过视觉评价色谱板。
GLC 分析 Perkin Elmer Autosystem 9000 毛细管气相色谱仪， 其配备有 WCOT 熔凝硅石柱 12.5m×0.25mm ID×0.1μ 膜厚度 5％苯甲基硅酮 (phenyl-methyl-silicone)(CP Sil8 CB 来自 Chrompack)。
载气 ： 氦
注射器 ： PSSI 冷分流注射 ( 最初温度 50℃加热到 385℃ )， 体积 1.0μl
检测器 FID ： 395℃
炉程序 ( 自 2003 年 10 月 30 日开始使用 ) ： 1 2 3
炉温度，℃ . 90 280 350
等温线， 时间， 分钟 . 1 0 10
温度比，℃ /min. 15 4
样品制备 ： 将萃取的样品溶解于含有 0.5mg/ml 内标十七烷的 0.5ml 庚烷∶吡啶 (2 ∶ 1) 中。 将 300μl 的样品溶液移到钳口瓶 (crimp vial) 中， 添加 300μlMSTFA(N- 甲基 N- 三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺 (N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoraceamid))， 60 ℃ 反应 20 分钟。
计算 ： 通过纯化的参考物质确定固醇的反应因子。
方法和结果
利用以下步骤制备固醇葡糖苷底物 ：
在 7ml 微量玻璃瓶中称量 1.0mg 固醇葡糖苷 ；
加入 10μl 99％的乙醇 ；
加入 200μl 50mM HEPES 缓冲液， pH 7 ；
加入含 0.4％ Triton X100 的 300μl 10mM HEPES 缓冲液。
通过在 40℃搅拌 30 分钟分散固醇葡糖苷。
利用表 1 列出的多种酶按照以下方法处理 5×100μl 固醇葡糖苷底物的样品。
表1
16102083995 A CN 102084003
说明1书2 314/14 页样品号固醇葡糖苷底物 μl 100 100 100
水 μl 10
Grindamyl Ca 150 μl 10
AMG 8000， 10％， 在水中 μl 10
将 100μl 固醇葡糖苷底物转移到 Eppendorf 试管中并置于 40℃的振荡孵箱中。 加入酶或水， 并将反应混合物在 40℃温育 16 小时。
利用 1ml 氯仿萃取反应混合物。分离氯仿相并在氮气流下蒸干。
将样品重新溶解在 200μl 氯仿∶甲醇 (2 ∶ 1) 中， 然后通过 HPTLC 分析。TLC 板 的图示于图 1。
图 1 的 TLC 色谱表明， 果胶酶 (Grindamyl Ca 150) 和淀粉葡糖苷酶 (AMG8000) 能 够产生保留时间与固醇相等的组分， 这表明这些酶将固醇葡糖苷降解。
为了证实固醇的形成， 还利用植物固醇为对照物质通过 GLC 对样品进行分析。GLC 分析证实了游离固醇的形成， 结果示于表 2。
表2： 固醇的 GLC 分析 ( 基于固醇葡糖苷的量的百分数 )
样品号 酶处理 固醇 (％ )
1 水 0.54
2 Grindamyl Ca 150 15.3
3 AMG 8000， 10％， 在水中 12.8
GLC 分析结果 ( 表 2) 证实了利用果胶酶或淀粉葡糖苷酶处理固醇葡糖苷时由固醇 葡糖苷形成游离固醇。
上面说明书中提及的所有公开的内容包含在本文中作为参考。 在不偏离本发明的 范围和精神的前提下， 本发明方法和系统的不同修饰和改变对于本领域普通技术人员来说 是清楚的。 尽管根据优选的具体实施方案对本发明进行了描述， 但是应理解， 本发明权利要 求保护的范围不应该过度限于这些特殊的具体实施方案。事实上， 对于生物化学领域和生 物工程学领域或相关领域的普通技术人员是显而易见的实现发明的所述方式的各种修饰 都意图包含在权利要求的保护范围内。