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根据天然人干扰素-β编号，25位的天冬酰胺被天冬氨酸残基重组替换的人干扰素-β蛋白类似物，以相对于IFN-β1b而言提高的水平显示人干扰素-β(例如IFN-β1b)的生物活性。这些类似物通过将编码Asp25 IFN-β的基因引入细胞和表达该重组蛋白来获得。得到的IFN-β蛋白类似物适用于在大规模生产中掺入用于治疗疾病(包括多发性硬化)的含HA或无HA的治疗剂中。使用酶消化和其后的RP-HPLC产生蛋白质的指纹图谱的还原型Lys内切蛋白酶-C肽作图技术，还可作为ID试验用于IFN-β蛋白类似物产品的质量控制中。

1.  人干扰素-β蛋白类似物，其包含：
不含Asn25的Asp25人干扰素-β。

2.  权利要求1的蛋白类似物，其中所述蛋白类似物显示天然人干扰素-β的生物活性。

3.  权利要求1的蛋白类似物，其包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

4.  权利要求1的蛋白类似物，其中，根据天然干扰素-β编号，17位的半胱氨酸缺失或被中性氨基酸替换。

5.  权利要求4的蛋白类似物，其中所述半胱氨酸残基已被丝氨酸残基替换。

6.  权利要求5的蛋白类似物，其还包括：
其中25位的残基选自异天冬氨酸和环状二酰亚胺的人干扰素-β。

7.  权利要求5的蛋白类似物，其中所述蛋白类似物是未糖基化的。

8.  权利要求7的蛋白类似物，其中所述蛋白类似物具有N末端甲硫氨酸缺失。

9.  权利要求2的合成蛋白类似物，其中所述蛋白类似物具有高于IFN-β1b的生物活性。

10.  权利要求9的蛋白类似物，其中所述蛋白类似物具有比无HA的IFN-β 1b高至少约1.6倍的生物活性。

11.  权利要求9的蛋白类似物，其中所述蛋白类似物具有比以HA配制的IFN-β 1b高至少约1.7倍的生物活性。

12.  具有IFN-β活性的治疗性组合物，其包含与可药用载体介质混合的治疗有效量的权利要求1的蛋白类似物。

13.  权利要求12的组合物，其中所述组合物不含HA。

14.  权利要求12的组合物，其中所述组合物以HA配制。

15.  制备IFN-β蛋白类似物的方法，其包括：
用Asp25干扰素-β的编码序列转化细胞；和
培养所述转化细胞以表达Asp25IFN-β蛋白类似物。

16.  权利要求15的方法，还包括：
分离和纯化所述Asp25 IFN-β蛋白类似物。

17.  根据权利要求15的方法制备的无Asn的Asp25人干扰素-β蛋白类似物。

18.  治疗患者的方法，包括对所述患者施用有效量的权利要求12的组合物。

19.  权利要求18的方法，其中所述治疗是治疗患者的多发性硬化，所述有效量是该组合物的治疗有效量。

20.  权利要求19的方法，其中所述多发性硬化为复发缓解型的。

21.  肽作图方法，包括：
将蛋白质样品在pH至少6.5的、含有Lys内切蛋白酶-C的缓冲溶液中孵育；
允许Lys内切蛋白酶-C消化该蛋白质样品；
用还原剂还原经消化的蛋白质样品；和
通过液相层析拆分经消化的蛋白质样品中的肽片段。

22.  权利要求21的方法，其中还原剂为二硫苏糖醇(DTT)。

23.  权利要求22的方法，其中蛋白质样品为人IFN-β蛋白类似物。

24.  权利要求21的方法，其中液相层析为RP-HPLC。

25.  权利要求23的方法，其中孵育在约7的pH进行。

26.  权利要求21的方法，其中缓冲溶液还包含增溶剂。

27.  权利要求26的方法，其中增溶剂为烷基甜菜碱兼性表面活性剂。

28.  含有编码Asp25人干扰素-β的DNA序列的微生物。

29.  编码Asp25人干扰素-β并包含SEQ ID NO：5所示序列的DNA序列。

30.  权利要求29的序列，还包含用于表达Asp25人干扰素-β的启动子序列，该编码序列和启动子序列包含如SEQ ID NO：6所示的序列。

31.  具有可药用的纯度的权利要求1的人干扰素-β类似物。

32.  权利要求15的方法，其中转化的细胞选自微生物细胞、CHO细胞和昆虫细胞。

33.  权利要求32的方法，其中转化的细胞为大肠杆菌细胞。

34.  权利要求15的方法，其中转化的细胞为真核细胞。

具有增强的生物活性的重组干扰素-β
1.技术领域
本发明属于生物活性蛋白质化学的一般领域。更具体地，其涉及经突变而改变的干扰素-β类似物，所述类似物通过替换、缺失或修饰半胱氨酸、天冬酰胺和其他残基而与天然蛋白不同。
2.背景技术
已经发现干扰素-β可用于治疗人类疾病，特别是多发性硬化。多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是慢性、经常致残的中枢神经系统疾病，在神经纤维周围的保护鞘破碎时发生。约30％的MS患者患有该疾病的复发缓解形式，其中症状在突发后完全或部分消失，其后为可持续数月或数年的稳定期。FDA已批准施用β干扰素(干扰素-β或IFN-β)来治疗复发缓解形式的MS。目前，已上市用于治疗MS的三种干扰素-β产品：Betaseron、Avonex和Rebif，每年的合并销售额超过30亿美元。对更有效的IFN-β产品及其更高效的生产方法的需求一直存在。
已经开发了重组DNA(rDNA)技术来促进大规模生产基于干扰素-β的药物。重组DNA分子是在活细胞外通过将天然或合成DNA区段与能在活细胞中复制的DNA分子连接而构建的DNA分子，或由于其复制而产生的分子。重组DNA技术使得可以大规模生产天然的或经突变改变的蛋白质。这些技术中特别需要解决的一个问题是人β干扰素(其氨基酸序列在图1中提供(SEQ ID NO：1))在17、31和141位含有半胱氨酸残基(Gene(1980)10：11-15和Nature(1980)285：542-547)，它们能在一些生产步骤中形成分子间或分子内连接。这些连接可在变性IFN-β的复性过程中形成，导致不期望的错误折叠结构和聚集体。在通过rDNA技术以微生物制备IFN-β的过程中，已经观察到由于这种分子间连接而在含有高浓度IFN-β的提取物中形成IFN-β的二聚体和寡聚体。这种多聚体形成使得IFN-β的纯化和分离十分费力费时，并需要纯化和分离方法中的若干额外步骤，例如在纯化过程中还原蛋白质和将其重新氧化以恢复其原始构象，由此增加了形成不正确的二硫键的可能性。此外，这种多聚体形成与低的比生物活性相关。
为了解决这些问题，已经开发了精细rDNA技术，以便以如下方式改变微生物生产的生物活性IFN-β蛋白类似物，其中所述方式为所述改变不会对IFN-β蛋白的生物活性产生不良影响，但是可以降低或消除其形成分子间交联或或如下分子内键接的能力，其中所述分子内键接将导致蛋白质采取不期望的三级结构(例如降低蛋白质活性的构象)。定向诱变技术已成功地用于制备突变的生物活性蛋白类似物(本文中“蛋白类似物”指合成的蛋白质，在该蛋白质中一个或多个氨基酸已经被遗传修饰和/或化学修饰和/或热修饰，并且该蛋白质保留亲本蛋白的生物活性)，该类似物保留其亲本蛋白的期望活性，但缺乏形成分子间连接或不期望的分子内二硫键的能力。已经发现，17位半胱氨酸残基缺失或被其他氨基酸替换的IFN-β生物活性蛋白的合成蛋白类似物具有期望的活性和特征。
具体地，干扰素-β1b(IFN-β1b)——一种IFN-β的合成重组蛋白类似物——是17位半胱氨酸残基被丝氨酸残基替换的生物活性蛋白。作为微生物产生的蛋白质，IFN-β1b是未糖基化的。它还具有N末端甲硫氨酸缺失。IFN-β1b已经制备成成功上市的药物，它显示对MS的治疗和控制有效。该蛋白类似物、其生产材料和技术、其作为治疗剂的制剂及其用于治疗MS的用途在大量美国专利及申请中描述并要求保护，包括1986年5月13日授权的专利No.4,588,585；1988年4月12日授权的专利No.4,737,462以及1990年9月25日授权的专利No.4,959,314，其中每篇均就其对这些特征的公开内容通过参考并入本文。
用于药物的IFN-β的大规模生产还可以在哺乳动物来源(特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中进行。这种IFN-β类似物(称为IFN-β1a)缺少IFN-β1b的Ser17突变，并且是糖基化的。IFN-β1a被制备成治疗产品，作为和上市。
像多数治疗剂一样，持续期望鉴定和生产更有效的生物活性剂。对于基于IFN-β的药物，具有提高的生物活性的IFN-β类似物将是期望的。此外，一些IFN-β药物制剂(包括)含有人白蛋白(HA或HAS)——一种常用的蛋白质稳定剂。HA是一种人血液制品，其供给日益减少。因此，最近期望不含HA的药物制剂，稳定且有效的无HA的IFN-β制剂将是期望的。
一般地，需要能用或不用HA进行配制的生物活性提高的IFN-β组合物以及产生这些组合物的方法。
发明概述
本发明通过提供纯化且分离的重组人干扰素-β蛋白类似物来解决这些需求，所述蛋白类似物含有其中25位(根据天然干扰素-β编号)天冬酰胺通过突变而被天冬氨酸残基替换的IFN-β。使用rDNA技术，通过提供编码Asp25IFN-β的基因以及将此基因引入细胞(如微生物细胞或真核细胞(如CHO细胞或昆虫细胞)以在这些细胞中实现Asp25IFN-β蛋白类似物的表达，引入该Asn25Asp突变。在一些实施方案中，用于转化细胞的rDNA还包括启动子序列。该重组干扰素-β蛋白类似物不含天然Asn25IFN-β，并以相对于IFN-β1b而言提高的水平显示IFN-β(例如IFN-β1b)的生物活性。这种蛋白类似物在无HA时稳定，并可配制成无HA或含HA的治疗性组合物。
该重组的干扰素-β蛋白类似物除Asp25IFN-β蛋白类似物以外还可包含其分解产物，例如图2所示的Isoasp25和Imide25蛋白变体。
在一个具体的实施方案中，重组Asp25IFN-β是合成的人干扰素-β1b蛋白类似物，其中17位的半胱氨酸(根据天然干扰素-β编号)缺失或被中性氨基酸(特别是丝氨酸)替换，并且25位的天冬酰胺被重组改变为天冬氨酸。在这个实施方案中，Asp25 IFN-β具有N末端甲硫氨酸缺失，并且是未糖基化的。具体地，Asp25 IFN-β可具有如图3所示的一级氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
该人干扰素-β蛋白类似物可以使用在至少约6.5的pH(优选约6.9至约7.1，最优选约7的pH)进行的还原型Lys-C内切蛋白酶测定法来表征。在此pH范围内进行的Lys-C消化在特定位点切割蛋白质，而不改变样品中分解产物的相对量。该消化所得到的肽片段可通过反相(Rp)HPLC进一步分离并通过Edman测序来鉴定。
本发明还提供了该活性蛋白类似物化合物配制在治疗性组合物中的制剂，包括含HA和无HA的制剂，及其生产和使用方法。
在结合附图阅读以下对本发明的详细描述以后，本发明的这些及其他目的和特征将更为清楚。

附图简述
图1是人IFN-β氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的图示。
图2是展示Asp25IFN-β分解途径的示意图，显示了根据天然IFN-β编号第25位的天冬氨酸残基。
图3是Asp25IFN-β1b氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的图示，显示了本发明Asn25Asp突变的位点和Lys-C切割位点。
图4A显示Asp25IFN-β1b和Asn25IFN-β1b的还原型Lys-C肽图谱。
图4B显示图4A的图谱的一部分的放大图。
图5A显示Asp25IFN-β1b和Asp25IFN-β1b高温处理样品的还原型Lys-C肽图谱。
图5B显示图5A的图谱的一部分的放大图。
图6显示Asn25IFN-β1b、Asp25IFN-β1b和Asp25IFN-β1b高pH处理样品的Mono S阳离子交换(CEX)HPLC。
本发明具体实施方案描述
现通过若干实施方案描述本发明的化合物、组合物、材料以及相关的技术和用途。所述实施方案的重要特性和特征在文章的结构中展示。尽管将结合这些实施方案描述本发明，但应该理解，本发明不旨在仅限于这些实施方案。相反，旨在涵盖可包括在所附权利要求所定义的本发明精神和范围内的替代方案、修改方案和等同方案。在以下描述中，公开了大量具体细节以提供对本发明的充分理解。本发明可以不经一些或全部这些具体细节而实施。在另一些情况下，对熟知的方法操作没有详细描述，以免不必要地模糊本发明。
引言
本发明提供重组产生的干扰素-β蛋白类似物，其以相对于IFN-β1b而言提高的水平显示人干扰素-β(如IFN-β1b)的生物活性。所述蛋白类似物可以用或不用HA进行配制，但无需HA进行蛋白质稳定。特别地，该干扰素-β蛋白类似物含有人干扰素-β类似物，其中25位的天冬酰胺(根据天然干扰素-β编号)被天冬氨酸残基重组替换。这种干扰素-β蛋白类似物不含有天然Asn25 IFN-β。
在一个实施方案中，重组产生的干扰素-β蛋白类似物还可含有Asp25IFN-β的分解产物，例如图2所示产物。参考图示描述Asp25 IFN-β的主要分解途径的图2，Asp25残基201可通过琥珀酰亚胺中间体205(二酰亚胺25(Imide25))转化成异天冬氨酸残基203(Isoasp25)。这样的转化可在例如接触高温或高pH条件时发生。在25位被异天冬氨酸或琥珀酰亚胺替换的干扰素-β类似物不显著降低重组Asp25 IFN-β类似物的生物活性，并可存在于IFN-β类似物产品及其治疗性制剂中。该Asn25Asp突变使用rDNA技术引入，通过提供编码Asp25 IFN-β的基因以及将此基因引入细胞(如微生物细胞或真核细胞(如CHO细胞或昆虫细胞)以在这些细胞中实现Asp25 IFN-β蛋白类似物的表达。在一些实施方案中，用于转化细胞的rDNA还包括启动子序列。
该IFN-β蛋白类似物可使用在至少6.5的pH(优选约7的pH)进行的还原型Lys-C内切蛋白酶测定法来表征。在此pH进行的Lys-C消化在特定位点切割蛋白质，而不改变样品中分解产物的相对量。该消化所得到的肽片段可通过RP HPLC进一步分离、收集并通过Edman测序来鉴定。本发明还提供该活性蛋白类似物化合物在治疗性组合物中的制剂及其生产和使用方法。
“蛋白类似物”在本文中指合成的蛋白质，其中一个或多个氨基酸已经被遗传修饰和/或化学修饰，并且该蛋白质保留亲本蛋白的生物活性，例如细胞致病作用或抗增殖活性。在一个具体实施方案中，重组人干扰素-β蛋白类似物含有人干扰素-β1b蛋白类似物，其中17位(根据天然干扰素-β编号)的半胱氨酸缺失或被中性氨基酸(特别是丝氨酸)替换，并且25位的天冬酰胺被天冬氨酸重组替换(例如，IFN-β_{ser17，asp25})。在另一些实施方案中，Asp25进一步化学修饰成异天冬氨酸或琥珀酰亚胺残基(例如分别为IFN-β_{ser17，isoasp25}或IFN-β_{ser17，湖泊酰亚胺25})。Asp25IFN-β1b蛋白类似物以相对于IFN-β1b而言提高的水平显示人干扰素-β的生物活性。此外，所述增强的生物活性在该蛋白质类似物的无HA制剂中观察到，从而使得无HA的IFN-β1b具有治疗性。
用Asp25替换Asn25
在本发明的合成蛋白类似物中，半胱氨酸17残基可以缺失或被丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或甲硫氨酸替换。在一个具体实施方案中，所述替换为丝氨酸17。使用rDNA技术用天冬氨酸残基替换天冬酰胺25残基。参考图3，展示了本发明Asp25IFN-β 1b蛋白类似物的一级(氨基酸序列(SEQ ID NO：1))和二级(折叠、交联)结构。在25位，天然Asn残基被重组引入的Asp残基替换。Asp25残基可部分或基本上转化成琥珀酰亚胺和/或异天冬氨酸，例如，通过使Asp25 IFN-β类似物接触诱导异构化作用的条件，例如高温或高pH。这些条件也可诱导天冬氨酸从L型旋光异构成D型。本发明涵盖L和D型的Asp25、Isoasp25和Imide25IFN-β蛋白类似物。
该蛋白类似物通过重组合成技术产生，任选地可以辅以表达后化学修饰。Asp25 IFN-β1b合成蛋白类似物可以通过重组DNA定向诱变技术来制备。在本申请上文的背景技术章节中提到的专利中已经描述了Cys17Ser改变。定向诱变技术是熟知的，并综述于Lather，R.F.和Lecoq，J.P.，Genetic Engineering Academic Press(1983)31-50页。寡核苷酸定向诱变具体综述于Smith，M.和Gillam，S.，Genetic Engineering：Principles andMethods，Plenum Press(1981)3：1-32。Asn25Asp突变在下文将具体描述。应该理解，以下诱变描述仅作为例子提供，并不旨在以任何方式限制本发明。本发明还涵盖对本领域技术人员而言显而易见的对以下方案的修改。
通过PCR(聚合酶链式反应)在作为模板的产生IFN-β的质粒(pSY2501)上引入突变。可以使用Quik-Change诱变试剂盒(Stratagenekit#200516，Stratagene，La Jolla，CA)。在PCR中使用合成寡核苷酸作为引物。在Asn25Asp诱变中使用的引物如下：
Asp25正向引物BSN25DF(SEQ ID NO：3)：
5′-CAGAAGCTCCTGTGGCAATTGGATGGGAGGCTTGAATATTGC-3′
Asp25反向引物BSN25DR(SEQ ID NO：4)：′
5′-GCAATATTCAAGCCTCCCATCCAATTGCCACAGGAGCTTCTG-3′
正向引物(SEQ ID NO：3)含有编码天冬氨酸的核苷酸GAT。反向引物(SEQ ID NO：4)与正向引物互补。两个引物以相反的方向但在相同位置结合在质粒DNA的不同链上。通过PCR复制整个质粒，接着通过DpnI酶消化。DpnI仅消化甲基化的细菌模板DNA链，而使未甲基化的PCR所复制的质粒保留完整。接着将DpnI处理的反应混合物加入XL Gold超级感受态细胞(Stratagene)中，用带有突变的质粒转化细胞。在羧苄青霉素和色氨酸存在下在Luria琼脂培养基中培养细胞集落。接着挑取若干集落，并在羧苄青霉素和色氨酸存在下在Luria培养基中培养。从每个培养物中提取质粒DNA，并通过对质粒的IFN-β插入片段进行测序来进行分析。IFN-β插入片段的测序证实了Asn25向Asp25的突变。还对其余质粒部分进行充分的限制性消化。该IFN-β插入片段含有启动子，其后直接跟随编码Asp25 IFN-β1b蛋白的基因。Asp25 IFN-β1b编码基因(SEQ IDNO：5)和IFN-β插入片段(基因和启动子，SEQ ID NO：6)的核苷酸序列在下文提供。编码天冬氨酸的密码子GAT和终止密码子TGA加有下划线。
Asp25IFN-β1b编码基因的序列(SEQ ID NO：5)
ATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTTTC
AGAGTCAGAAGCTCCTGTGGCAATTGGATGGGAGGCTTGAATATTGCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGACGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAGACAAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCTATCATCAGATAAACCATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGATTTCACCAGGGGAAAACTCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACAGTCACTGTGCCTGGACCATAGTCAGAGTGGAAATCCTAAGGAACTTTTACTTCATTAACAGACTTACAGGTTACCTCCGAAACTGAAGATCC
用于表达Asp25IFN-β1b的启动子和基因序列(SEQ ID NO：6)
GAATTCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGATAAGCTTATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTTTCAGAGTCAGAAGCTCCTGTGGCAATTGGATGGGAGGCTTGAATATTGCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGACGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAGACAAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCTATCATCAGATAAACCATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGATTTCACCAGGGGAAAACTCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACAGTCACTGTGCCTGGACCATAGTCAGAGTGGAAATCCTAAGGAACTTTTACTTCATTAACAGACTTACAGGTTACCTCCGAAACTGAAGATCC
使用标准蛋白质表达技术在细菌细胞中表达了Asp25 IFN-β。用带有Asp25 IFN-β1b基因的质粒转化表达色氨酸阻抑物的大肠杆菌细胞。培养细胞以表达Asp25 IFN-β1b，并分离和纯化所表达的蛋白质。
本领域技术人员将明了，也可以使用其他表达系统，例如哺乳动物细胞(HEK293或CHO-K)、杆状病毒/昆虫细胞或酵母系统。在这些系统(如真核细胞)的一些中进行的表达可导致Asp25 IFN蛋白没有末端Met缺失，或者表达为糖基化的蛋白，这些均在本发明的范围之内。
通过肽片段的Edman测序，证实了Asp25突变蛋白的身份，其中所述肽片段通过将该蛋白在pH7进行还原型Lys-C内切蛋白酶作图消化来获得。该重组产生的Asp25 IFN-β1b经确定含有主要的Asp25种类和两种次要的分解产物，即，Isoasp25和Imide25 IFN-β1b类似物。这些产物由重组Asp25 IFN-β通过图2所示的分解途径形成。Isoasp25和Imide25种类的量可以通过化学手段或通过热处理作用而改变。例如，当对Asp25 IFN-β进行高温处理时，Isoasp25种类的比例可以提高。IFN-β蛋白类似物中Asp25、Isoasp25和Imide25种类的相对比例还可以通过改变该混合物的pH来改变。例如，在较高的pH(如9.25)，Imide25级分的相对量降低。术语“人IFN-β蛋白类似物“涵盖重组Asp25 IFN-β及其分解产物，例如Isoasp25和Imide25。应该理解，重组Asp25 IFN-β蛋白类似物完全不含Asn25 IFN-β。尽管有可能如US专利申请11/271,516所述通过天冬酰胺残基的化学脱酰胺作用获得25位脱酰胺的干扰素类似物，但化学脱酰胺的干扰素产品通常含有未反应的天然Asn25蛋白。Asn25干扰素显示低于Asp25IFN-β蛋白类似物的生物活性，因此获得不含Asn25的干扰素类似物是有利的。
通过进行细胞致病作用(CPE)测定和Hs294T抗增殖测定，研究了重组Asp25 IFN-β蛋白类似物产物的生物活性。Asp25 IFN-β1b的CPE活性为5.82×10⁷IU/mg，比无HA的Asn25 IFN-β1b的CPE活性高1.6倍，比以HA配制的IFN-β1b()的CPE活性高1.7倍。Asp25 IFN-β1b的Hs294T抗增殖生物活性为5.72×10⁷IU/mg，比无HA的Asn25 IFN-β1b的Hs294T抗增殖活性高1.3倍，比以HA配制的IFN-β_ser17的相应活性高1.7倍。
Asp25 IFN-β蛋白类似物在多种条件(包括高pH和高温条件)下在无HA时保持其生物活性。因此，不需要用HA进行配制来维持含有Asp25IFN-β的治疗性产品的生物活性。对高pH或高温处理的无HA的Asp25IFN-β 1b样品通过RP HPLC和CEX HPLC进行表征，这可以对完整蛋白或Lyc-C消化所得的肽混合物进行。在经受高pH(例如pH9.25)的样品和经受高温(例如37℃)处理的样品中均未观察到可能指示意外蛋白质降解的意外峰。在所有样品中均证实了Asp25、Isoasp25和Imide25种类的存在。使样品接触37℃18天导致该IFN-β蛋白类似物中Isoasp25级分的量提高。使样品接触pH9.254小时使得Imide25种类级分降低，而Asp或Isoasp级分提高。
还观察到，当重组Asp25IFN-β蛋白类似物IFN-β接触高温时，该Asp25 IFN-β的生物活性提高。在37℃孵育18天的Asp25 IFN-β1b的CPE活性显示出相对于以HA配制的IFN-β 1b为2.9倍提高以及相对于无HA的IFN-β 1b为2.7倍提高，达到9.6×10⁷IU/mg。该提高的生物活性可能归因于IFN-β蛋白类似物中Isoasp25或Imide25种类的较高比例。
一般而言，有多种可能的技术可使得重组产生的Asp25 IFN-β蛋白类似物中Isoasp25或Imide25类似物的量提高。这些技术可能在大规模药物生产中是有效并适于采用的，任何可以改变Asp25、Isoasp25和Imide25的相对量而保持天然生物活性(优选提高生物活性)的技术均可使用。宽泛而言，可通过在中温至高温(例如25至60℃)和多种pH(从低(如约0至4)、中(如约4至10)到高(如约10至14))下孵育来改变Asp25、Isoasp25和Imide25 IFN-β类似物的相对量，其中反应时间取决于条件从约1分钟到约90天或更长。例如，可通过在高达60℃或约25至40℃(例如约37℃)孵育Asp25 IFN-β(例如，Asp25 IFN-β1a或Asp25 IFN-β1b)至少24小时(例如18天或长达40天)来获得具有提高的生物活性的IFN-β蛋白类似物。
用于制备重组人Asp25 IFN-β蛋白类似物的该技术产生不含有Asn25种类的产物。Asp25、Isoasp25和Imide25的相对量可根据重组蛋白生产及后续化学处理(例如接触高温或高pH)的条件而变化。例如，可以获得含有至少25％、至少50％、至少75％或约100％ Asp25 IFN-β的IFN-β蛋白类似物。在一些情况下，可能期望纯化和分离IFN-β蛋白类似物混合物中的单个种类。这种纯化和分离可通过阳离子交换(CEX)HPLC来实现，例如使用以下条件：
层析固定相：Pharmacia Mono S HR 5/5或等同物；
洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，pH 7.0，含有0.5％Empigen BB(正十二烷基-N，N-二甲基甘油(烷基甜菜碱十二烷基二甲基甜菜碱，一种兼性表面活性剂))
梯度：洗脱缓冲液中NaCl线性梯度，至200mM或更高。为了生产，该技术可以大规模进行。
在一个实施方案中，当合成蛋白类似物通过微生物产生时，它是未糖基化的。此外，该蛋白类似物还具有N末端甲硫氨酸缺失。在另一些实施方案中，所述蛋白类似物可在哺乳动物细胞中产生，因此是糖基化的。
如下文中进一步的描述，多种活性测定试验证明，重组Asp25 IFN-β 1b蛋白类似物具有相对于其亲本Asn25 IFN-β1b蛋白而言提高的生物活性。已经使用无HA的样品获得了稳定性结果，表明本发明的重组IFN-β蛋白类似物适于不用HA配制为治疗剂。为了形成治疗性组合物，可将如上述部分或基本纯化的蛋白类似物与可药用载体介质(例如对这类治疗产品而言熟知的那些)混合。
尽管显示无HA稳定性是本发明组合物的有利特性，但Asp25 IFN-β蛋白类似物也可以在含有HA的制剂中使用，它们并不排除在本发明范围之外。此外，尽管本文中主要参考IFN-β1b蛋白类似物描述了本发明，但本发明也可应用于其他IFN-β类似物，包括IFN-β 1a类似物，和IFN-β蛋白的其他功能性变体。
本发明的IFN-β蛋白类似物和组合物显示出生物活性，该活性提示其在多种应用中的治疗用途，包括调节患者的细胞生长和治疗患者的病毒性疾病。可证明本发明的治疗剂可用于治疗患者的多发性硬化，特别是复发缓解型的MS。
实施例
以下实施例展示本发明的一些方面，但不旨在以任何方式限制本发明。
实施例1.制备重组Asp25 IFN-β1b。
用于制备重组脱酰胺IFN-β1b的PCR混合物的代表性组成和代表性PCR方案分别示于表1和表2。
表1.PCR混合物的组成