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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610579908.1 (22)申请日 2016.07.21 (71)申请人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路800号 (72)发明人 白林泉齐震 (74)专利代理机构 上海科盛知识产权代理有限 公司 31225 代理人 杨元焱 (51)Int.Cl. C12N 15/76(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/31(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (54)发明名称 匹马霉素A菌株的基因工程改。
2、造方法 (57)摘要 一种匹马霉素A菌株的基因工程改造方法， 是通过在菌株Streptomyceschattanoogensis QZ12中过表达后修饰基因pimD与pimF， 实现了匹 马霉素A产量的大幅度提高， 并降低了匹马霉素B 的产生。 本发明利用代谢工程方法构建了一株高 效低毒匹马霉素A的高产菌株， 该菌株在使匹马 霉素B产量降低86的基础上， 将高效低毒匹马 霉素A的产量提高了107， 实验室摇瓶发酵水平 达到746mg/L， 为匹马霉素A的工业化生产奠定了 基础。 权利要求书1页 说明书8页 CN 106191095 A 2016.12.07 CN 106191095 A 1.一。
3、种匹马霉素A菌株的基因工程改造方法， 其特征在于， 通过在菌株Streptomyces chattanoogensis QZ12中过表达后修饰基因pimD与pimF， 实现了匹马霉素A产量的大幅度 提高， 并降低了匹马霉素B的产生。 2.如权利要求书1所述的匹马霉素A菌株的基因工程改造方法， 其特征在于， 所述pimD 为P450单加氧酶基因， pimD基因的序列如SEQ ID NO.1所示。 3.如权利要求书1所述的匹马霉素A菌株的基因工程改造方法， 其特征在于， 所述pimF 为铁氧还蛋白基因， 所编码的铁氧还蛋白为P450单加氧酶PimD的辅助蛋白， pimF基因序列 如SEQ ID N。
4、O.2所示。 4.如权利要求书1所述的匹马霉素A菌株的基因工程改造方法， 其特征在于， 所述通过 在菌株Streptomyces chattanoogensis QZ12中过表达后修饰基因pimD与pimF的构建步骤 如下： 一、 设计并构建用于基因pimD与pimF过表达的质粒I； 二、 将第一步构建得到的质粒I接合转移导入受体菌株QZ12中； 三、 通过对突变株的PCR验证及阿泊拉霉素抗性验证筛选得到过表达菌株QZ14。 5.权利要求书4所述匹马霉素A菌株的基因工程改造方法， 其特征在于， 步骤一中所述 质粒I的构建方法是， 在质粒pPM927的EcoRI位点依次插入两拷贝1.4kb测序确。
5、认的红霉素 启动子控制下的基因pimD的PCR片段及0.4kb测序确认的红霉素启动子控制下的基因pimF 的PCR片段。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106191095 A 2 匹马霉素A菌株的基因工程改造方法 技术领域 0001 本发明涉及生物工程， 尤其是涉及一种匹马霉素A菌株的基因工程改造方法。 背景技术 0002 匹马霉素的结构简单， 化学性质稳定， 是一种常用的多烯类抗生素， 被广泛用作食 品防腐添加剂、 抗真菌兽药以及用于角膜炎治疗。 在目前最常用的四种多烯类抗生素(匹马 霉素、 两性霉素B、 制霉菌素和杀念菌素)中， 匹马霉素的溶血毒性最低， 但其抗真菌活性同 样也相对较低。
6、。 相对偏低的药理性质， 严重限制了匹马霉素在临床中的应用价值。 在前期的 研究中， 我们通过基因工程改造的方法， 对匹马霉素生物合成基因簇中的P450单加氧酶基 因pimG进行了失活， 并成功从其发酵产物中鉴定得到了一种高效低毒的匹马霉素衍生物 匹马霉素A(12-脱羧-12甲基-匹马霉素)。 经体外活性实验测定， 匹马霉素A的活性是匹马霉 素的2倍， 而其毒性不足匹马霉素的1/4， 是一种高效低毒的匹马霉素衍生物， 具有良好的应 用前景。 0003 但是， P450单加氧酶基因pimG失活菌株QZ01除产生匹马霉素A外， 还产生一种低毒 的匹马霉素B(4,5-脱环氧-12-脱羧-12甲基-匹。
7、马霉素)及无活性的匹马霉素C(2-氢-3-羟 基-4,5-脱环氧-12-脱羧-12甲基-匹马霉素)。 前期实验中， 我们通过替换PKS基因中的 DH12KR12结构域构建了突变株QZ12， 并成功消除了发酵产物中匹马霉素C的产生。 但菌株 QZ12发酵产物中匹马霉素B的存在仍限制了后续的分离纯化， 而其相对较低的产量也限制 了匹马霉素A的工业化生产。 因此， 通过基因工程改造的方法， 进一步消除或降低菌株QZ12 中低效低毒匹马霉素B的产生并进一步提高匹马霉素A的产量， 将极大地推动匹马霉素A的 工业化生产， 具有重要的经济价值。 体内及体外实验证实， 匹马霉素B是匹马霉素A未发生 C4-C5。
8、位环氧化的前体， 因此， 我们在QZ12菌株中尝试通过超量表达负责编码环氧化酶的基 因pimD及其辅助基因pimF， 降低或消除匹马霉素B的产生， 并提高匹马霉素A的产量， 进而达 到优化产生菌株的目的。 发明内容 0004 本发明的目的， 就是为了提高匹马霉素A的产量， 提供一种匹马霉素A菌株的基因 工程改造方法。 0005 为了达到上述目的， 本发明采用了以下技术方案： 一种匹马霉素A菌株的基因工程 改造方法， 是通过在菌株Streptomyces chattanoogensis QZ12中过表达后修饰基因pimD 与pimF， 实现了匹马霉素A产量的大幅度提高， 并降低了匹马霉素B的产生。
9、。 0006 所述pimD为P450单加氧酶基因， pimD基因的序列如SEQ ID NO.1所示。 0007 所述pimF为铁氧还蛋白基因， 所编码的铁氧还蛋白为P450单加氧酶PimD的辅助蛋 白， pimF基因序列如SEQ ID NO.2所示。 0008 所述通过在菌株Streptomyces chattanoogensis QZ12中过表达后修饰基因pimD 与pimF的构建步骤如下： 说明书 1/8 页 3 CN 106191095 A 3 0009 一、 设计并构建用于基因pimD与pimF过表达的质粒I； 0010 二、 将第一步构建得到的质粒I接合转移导入受体菌株QZ12中； 。
10、0011 三、 通过对突变株的PCR验证及阿泊拉霉素抗性验证筛选得到过表达菌株QZ14。 0012 步骤一中所述质粒I的构建方法是， 在质粒pPM927的EcoRI位点依次插入两拷贝 1.4kb测序确认的红霉素启动子控制下的基因pimD的PCR片段及0.4kb测序确认的红霉素启 动子控制下的基因pimF的PCR片段。 0013 采用本发明的方法， 可以使后修饰基因pimD与pimF的转录水平分别提高10及7倍 左右， 进而提高匹马霉素B到匹马霉素A的转化， 最终使匹马霉素A的产量提高了约107， 实 验室摇瓶发酵水平达到746mg/L， 极大推动了匹马霉素A的工业化生产。 具体实施方式 001。
11、4 下面通过实施例对本发明作进一步说明。 本实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施， 并给出了详细的实施方式和过程， 但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 下 列实施例中未注明具体条件的实验方法， 按照常规条件或制造厂商的建议条件。 0015 实施例 0016 步骤一： 整合型质粒I的构建 0017 以菌株Streptomyces chattanoogensis QZ12的基因组DNA为模板， 使用引物 pimD-F/R、 pimF-F/R， 通过PCR扩增得到后修饰基因pimD与pimF， 通过基因测序确认PCR片段 的正确性； 在质粒pPM927的EcoRI位点依次插入两个拷贝的红霉。
12、素启动子控制下的的pimD 基因片段及单拷贝的红霉素启动子控制下的pimF基因片段(MunI/EcoRI酶切位点)； 通过上 述方法得到用于基因pimD与pimF过表达的质粒I。 0018 上述步骤一中所用到的引物序列如表1所示： 0019 表1 0020 0021 步骤二： 将整合型质粒I通过接合转移的策略导入菌株QZ12， 并筛选得到改造菌株 QZ14。 0022 将已构建完成用于基因过表达的质粒I转化进入大肠杆菌宿主E.coli ET12567 (含有pUZ8002质粒)中。 取该转化子于含有氯霉素、 卡那霉素和阿泊拉霉素三种抗生素的LB 中于37过夜培养， 用相同的培养基， 将过夜培养。
13、物按10的比例转接一次并培养4h， 然后 用新鲜的LB溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。 于此同时制备菌株QZ12的新鲜孢子约 109个， 用TES溶液漂洗23次之后再用2mLTES溶液悬浮孢子， 于50热激10min后， 冷却至 室温， 等体积加入2孢子预萌发培养液后于37培养2.5h， 并用新鲜的LB溶液漂洗孢子2 3次。 将预萌发的孢子与之前制备的大肠杆菌宿主菌E.coli ET12567混合(孢子和宿主菌 说明书 2/8 页 4 CN 106191095 A 4 的比例约为10:1)均匀后涂布于YMG平板， 待平板吹干后转移至30培养箱正置培养17h后 取出平板， 分别取阿泊拉霉素和。
14、萘啶酮酸两种抗生素混匀于1mL无菌水中， 覆盖于YMG平板 上， 将平板晾干后转移至30培养箱中培养。 一般35天后可见平板上有单菌落接合子长 出， 通过菌丝体PCR验证和抗性验证的方法验证接合子正确， 即得到改造菌株QZ14。 0023 步骤三： 改造菌株QZ14中基因pimD与pimF转录水平的测定 0024 用于RNA提取的样品为发酵培养48h的菌丝体， 其一般保存在Redzol溶液中。 RNA提 取过程要求低温， 离心过程除特殊说明， 均在4、 12000rpm的条件下进行。 取已经破碎处理 的样品500 L加入100 L氯仿， 涡旋振荡混匀， 离心15min后吸取上清液， 加入100。
15、 L无水乙醇 并混匀后将样品吸入离心柱(赛百盛)中， 静置2min， 离心1min， 弃液体， 用漂洗液(Washing buffer， 赛百盛)漂洗两次， 弃液体， 将离心柱置于收集管中继续离心2min。 换用新的收集 管， 往离心柱中加入60 L DEPC处理过的水， 离心2min， 将RNA样品从离心柱上洗脱下来。 用 Nanodrop 2000型核酸蛋白分析仪测定RNA的浓度和OD260/280， 提取后的RNA样品-80保 存。 RNA样品经DNase消化处理4h后， 每个反应体系加入5 L 50mM EDTA后65加热10min即 可终止消化， 消化好的RNA样品-80保存。 RN。
16、A经过逆转录后就得到cDNA， 可用于后续的基 因转录分析。 0025 取cDNA样品用DEPC处理水稀释至合适的浓度， 配制qRT-PCR体系(2SYBR Green 缓冲液10 L， 引物20pmol， cDNA5 L， 加DEPC水至体积20 L)， 离心去掉溶液中的气泡之后使 用ABI公司7500型快速RT-PCR仪测定样品Ct值。 采用hrdB作为看家基因测定pimD与pimF的 转录水平。 收集的数据使用2- CT法进行处理。 一般对照组样品的基因转录水平设参比为1， 实验组样品基因转录与之比较即得到实验组基因转录改变的倍数。 0026 测定基因转录水平使用的引物如表2所示： 00。
17、27 表2 0028 0029 改造菌株QZ14的后修饰基因pimD与pimF转录变化结果表明， 在基因pimD与pimF过 表达后， 其转录水平较对照菌株分别有大约10倍与7倍的提高， 基因pimD与pimF的转录量明 显提高。 0030 步骤四： 改造菌株QZ14的发酵培养及其产量测定 0031 种子培养基各组分质量体积比为葡萄糖1.75、 胰蛋白胨1.5、 氯化钠1.0； 发 酵培养基各组分质量体积比为葡萄糖6.0、 酵母提取物0.7、 黄豆饼粉2.8。 按种子培 养基及发酵培养配方， 分别配制种子培养基及发酵培养基， 并分装于250mL三棱瓶中， 每瓶 说明书 3/8 页 5 CN 1。
18、06191095 A 5 装50mL， 115灭菌30min， 将过表达菌株及对照菌株菌丝体接入上述种子培养基中， 在 220rpm转速、 30， 摇床培养24h得种子培养液。 将种子培养液按10接种量接入发酵培养 基中， 在220rpm转速、 30， 摇床培养5d。 0032 使用Agilent公司的Agilent 1200系列HPLC进行色谱分析， 采用DAD二极管阵列检 测器测定303nm下的色谱吸收峰。 色谱柱的参数为： Agilent TC-C18， 5 m， 4.6250mm； 流动 相流速为1mL/min； 流动相组成及其体积比为： 67的含0.1甲酸(v/v)的水溶液和33的 。
19、HPLC级乙腈。 柱温： 35。 0033 表3为出发菌株QZ12与改造菌株QZ14的发酵产量数据， 结果表明， 改造菌株QZ14中 低效低毒匹马霉素B的产量降低了86左右， 而高效低毒匹马霉素A的产量提高了约107， 达到746mg/L， 为匹马霉素A的工业化生产奠定了基础。 0034 表3： 出发菌株QZ12与改造菌株QZ14的发酵产量数据 0035 0036 表示该菌株不产生这一类抗生素。 说明书 4/8 页 6 CN 106191095 A 6 0037 说明书 5/8 页 7 CN 106191095 A 7 0038 说明书 6/8 页 8 CN 106191095 A 8 0039 说明书 7/8 页 9 CN 106191095 A 9 0040 说明书 8/8 页 10 CN 106191095 A 10 。