一种分泌表达人Kallistatin的重组酵母菌株及生产工艺 【技术领域】
本发明涉及分子药物学，生物技术和疾病防治，具体地说是采用酵母菌株生产人Kallistatin(Kal)的生产工艺，分泌表达载体的构建，发酵条件和纯化方法。
背景技术
目前恶性肿瘤已经成为发达国家和地区居于前列的致死性疾病。虽然外科手术，放疗和化疗作为的常规治疗手段仍在不断发展，但由于其固有的局限，其疗效已基本达到极限，因而迫切需要开发新的治疗手段。
自从Folkman于1971年首次阐述肿瘤与新生血管依赖关系，并提出有关分子机制假说以来，以肿瘤新生血管为靶点的抗血管生成治疗成为抗肿瘤研究的热点。
Kal是一新型的具有抗血管生成作用的内源性蛋白(Miao RQ，et al.Blood2002；100：3245-52)，其抗血管生成作用与内皮抑素(endostatin)类似。内皮抑素通过其肝素结合活性介导其对血管生成的抑制作用。各种生长因子必须结合细胞表面两种不同的受体，才能引发一个信号。硫酸肝素糖蛋白(HSPGs)是最普通的低吸附受体，在调节多种生长因子的作用时，发挥关键作用。许多生长因子，如VEGF和bFGF是肝素结合生长因子，VEGF和bFGF与内皮细胞表面的HSPGs结合，可以调节它们与专属受体的结合。Kal是肝素结合蛋白，可以与VEGF和bFGF，以及其它含有肝素结合区的生长因子竞争结合HSPGs，因此阻断了这些生长因子与HSPGs的结合，阻断了这些生长因子引发的血管生成事件。另外，Kal还是丝氨酸蛋白酶抑制剂的一员，最初被认为是组织胰激肽原酶结合蛋白。越来越多的证据显示，组织胰激肽原酶在肿瘤相关事件中非常重要，其中包括肿瘤生长调节，血管生成，侵入和转移等。我们的研究发现，在Kal的作用下，HCC中作为细胞增殖的标志Ki-67染色降低，显示Kal与组织胰激肽原酶的结合可能与HCC细胞增殖抑制有关。Kal可以从不同途径抑制血管生成，因此是抗肿瘤血管生成治疗的良好候选者。
已进行的Kal的抗肿瘤作用研究主要采用基因治疗手段，而基因治疗一般需要采用病毒载体，其长期应用的风险是各国卫生部门重点关注的问题，目前尚不明朗，很难在短期内实现上市并广泛应用于肿瘤病人。而多种重组蛋白药物已广泛地应用于临床，相关技术比较成熟，是开发基因重组药物最常规的手段。所以本领域研究人员试图建立一种高效生产Kal重组蛋白的方法，研究其蛋白形式对肿瘤的作用，为新型抗肿瘤药物的开发奠定基础。Kal的发现者Chao等曾采用大肠杆菌表达Kal重组蛋白，但表达量很低。本课题组也曾用大肠杆菌表达人Kal蛋白，表达水平也极低，且杂蛋白多难以纯化。毕赤酵母表达系统是近年来建立起来的一种真核表达系统，已成功地表达了大量的重组蛋白，它既具有原核表达系统繁殖快、操作简单的优点，同时又具有原核表达系统所没有的优势：如能对表达的目的蛋白进行正确加工、折叠及适度糖基化，分泌表达的杂蛋白少，易于分离纯化等，因此越来越广泛地用于重组蛋白的表达。国内外文献尚未有利用毕赤酵母表达Kal蛋白的报道。本发明人利用毕赤酵母表达人Kal蛋白，发现采用常规的技术方法得到的重组菌株表达水平很低，难以大规模生产。纯化工艺也比较复杂。现有市售酵母分泌型表达载体所用的信号肽几乎全是α交配因子信号肽，重组蛋白的翻译后加工需要两种不同的酶参与，往往产生加工不均匀和不正确的现象，得到的重组蛋白的N端序列出现偏差。
【发明内容】
针对现有技术存在的问题和缺陷，本发明对市售的酵母分泌型表达载体pPIC9进行改造，并从发酵工艺和纯化工艺等多个环节进行最佳条件的摸索和优化，得到了可以高效表达人Kal的分泌型表达酵母菌株，并建立了可以用于工业化生产的发酵工艺和纯化工艺。
信号肽序列是分泌型酵母表达载体非常重要的表达元件，对于不同的目标蛋白，α交配因子信号肽往往不能有效、正确的转位和加工，因而所得到的目标蛋白的N端序列经常不是天然序列。本发明对多种信号肽序列进行了筛选，从表达水平高低和N端序列正确与否等多个方面进行了研究，确定了本发明载体的关键元件构成。
本发明采用廉价的BMMY培养基即可成功地高水平分泌表达Kal蛋白。由于分泌的Kal蛋白成分水平高，下游纯化非常方便，经两步层析纯度即可达到98％以上，非常便于工艺化生产。
【附图说明】
图1发酵上清液的Western Blot分析。条带1为酵母菌株GS115/p PIC9的发酵上清液，无Kal的阳性反应；带1为酵母菌株Kal02地发酵上清液，呈现Kal的阳性反应。箭头所指为Kal蛋白。
图2发酵时间对重组Kal蛋白表达的影响。条带1为分子量标志；条带2为酵母菌株Kal02的发酵上清液；条带3为酵母菌株Kal02的第1天发酵上清液；条带4为酵母菌株Kal02的第2天发酵上清液；条带5为酵母菌株Kal02的第3天发酵上清液；条带6为酵母菌株Kal02的第4天发酵上清液；条带7为酵母菌株Kal02的第5天发酵上清液；条带7为酵母菌株Kal02的第6天发酵上清液。箭头所指为Kal蛋白。
图3各纯化步骤产物的SDS-PAGE图谱。条带1为分子量标志；条带2为酵母菌株Kal02的发酵上清液；条带3为Phenyl Superose疏水层析产物；条带4为Sepharose FF亲和层析产物。
【具体实施方式】
1含α交配因子信号肽工程菌株的构建
1.1表达载体pPIC9-Kal01的构建
以含有Kal cDNA全长序列的pAAV-Kal为模板，选用上游引物5′-aacctcgagaaaagagatggtgagagttgcagtaacagct-3′引入Xho l酶切位点，下游引物5′ccagaattcctatggtttcgtggggtcgacgacc-3′引入EcoR I酶切位点，用Pyrobest DNA聚合酶，经PCR得到人Kal成熟蛋白对应的DNA序列。目的片段回收、酶切后插入至pPIC9载体的Xhol/EcoRI位点之间。转化后经菌落PCR、酶切等方法筛选出符合要求的阳性克隆，委托大连宝生物公司对pPIC9-Kal01进行测序。
1.2工程菌株Kal01的构建与鉴定
pPIC9-Kal01表达载体经StuI线性化，电转化毕赤酵母GS115(his4)宿主菌，涂布MD平板，菌落PCR鉴定。将阳性克隆接种于含有3mL BMMY酵母培养液的试管中，培养24h，用2％甲醇诱导48小时，ELISA法测定目的蛋白含量。发酵上清液经SDS-PAGE分离后电转至硝酸纤维素膜上，用封闭液封闭2h，滴加一抗室温孵育2h，洗涤液洗3次，滴加二抗室温孵育2h，洗涤液洗3次，最后使用BeyoECL荧光检测试剂检测目的蛋白，X胶片曝光后显影、定影。
2含人白蛋白信号肽工程菌株的构建
2.1表达载体pPIC9-Kal02的构建
依据NCBI中报道的编码白蛋白信号肽(NP_000468)序列以及编码人成熟Kal蛋白序列设计引物，上游引物1：5′-CAGGATCCCAAACGATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGC-3′，上游引物2：5′-CCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCGATGGTGAGAGTTGCAGTAAC-3′和下游引物：5′-CCA GAATTCCTATGGTTTCGTGGGGTCGACGACC-3′，引入BamH I、EcoR I酶切位点。利用合成的引物通过两次重叠PCR从pAAV-Kal质粒中扩增出人Kal成熟蛋白对应的DNA序列。目的片段回收、酶切后插入至pPIC9载体的BamHI-EcoRI位点之间。转化后经菌落PCR、酶切等方法筛选出符合要求的阳性克隆，委托大连宝生物公司对pPIC9-Kal02进行测序。
2.2工程菌株Kal02的构建与鉴定
按照1.2步骤同法操作。
3含人Kal信号肽工程菌株的构建
3.1表达载体pPIC9-Kal03的构建
依据编码人Kal蛋白序列设计引物，上游引物1：5′-CAGGATCCCAAACGATGCATCTTATCGA-3′下游引物：5′-CCAGAATTCCTATGGTTTCGTGGGGTCGACGACC-3′，引入BamH I、EcoR I酶切位点。利用合成的引物通过两次重叠PCR从pAAV-Kal质粒中扩增出人Kal成熟蛋白对应的DNA序列。目的片段回收、酶切后插入至pPIC9载体的BamHI-EcoRI位点之间。转化后经菌落PCR、酶切等方法筛选出符合要求的阳性克隆，委托大连宝生物公司对pPIC9-Kal03进行测序。
3.2工程菌株Kal03的构建与鉴定
按照1.2步骤同法操作。
4工程菌株的筛选
将从不同工程菌株所得到的Kal表达水平和N-端序列测定结果进行分析：工程菌株Kal03的表达产物N-端序列与天然产物一致，但表达水平很低；工程菌株Kal01的表达产物N-端序列出现与天然产物不一致现象，但表达水平高；工程菌株Kal02的表达产物N-端序列与天然产物一致，表达水平也很高。
工程菌株Kal02发酵上清液的Western Blot分析见图1。
5发酵条件的优化
5.1培养基
选取BMM和BMMY两种常用培养基进行培养，将培养上清直接进行电泳分离，BMMY培养基的上清液可见清晰的Kal条带，而BMM培养基的上清液中Kal蛋白条带非常模糊。经ELISA测定BMM、BMMY培养基中的Kal表达水平(见表1)，BMMY培养基中的表达是BMM的3倍。
表1培养基成份对Kal蛋白表达量影响(n＝3)
5.2pH值
选用不同pH的BMMY培养基进行发酵，ELISA测得发酵上清液中Kal蛋白含量(见表2)。可见该菌种最佳表达的pH值为7.0。
表2pH对Kal蛋白表达量影响(n＝3)
5.3甲醇浓度
在pH 7的BMMY培养基中进行发酵，选用不同浓度的甲醇诱导Kal蛋白的表达，ELISA法测得发酵上清液Kal蛋白含量(见表3)。可见诱导Kal蛋白表达的最佳甲醇浓度为2％。
表3甲醇浓度对Kal蛋白表达影响(n＝3)
5.4发酵时间
在pH 7的BMMY培养基中进行发酵，采用2％甲醇诱导，在不同的发酵时间取样，ELISA法测定发酵上清中Kal蛋白含量。随着发酵时间的延长，Kal的表达逐渐增加，产物的时间积累效果显著，在第5天达到最高水平，之后上清中杂蛋白条带增多，Kal蛋白含量降低(SDS-PAGE图谱见图2)。
6Kal蛋白的纯化
Kal蛋白纯化过程包括发酵上清液的硫酸铵预处理和连续的两步层析。预处理后的上清液经过Phenyl Superose介质疏水层析，平衡缓冲液为20mmol/L Tris-HCl，1.5mol/L硫酸铵，pH 6.0，用20mmol/L Tris-HCl，0.4mol/L硫酸铵，pH 6.0缓冲液洗脱；洗脱液透析后经过Heparin Sepharose FF介质亲和层析，用20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 6.0缓冲液洗脱，此步洗脱液经过透析后过滤除菌就得到Kal蛋白原液。纯化的Kal蛋白经Western blotting鉴定为阳性，用ELISA测定Kal蛋白原液浓度为0.404mg/mL。通过该纯化工艺，可以从每升发酵上清中获得7g纯度大于98％的的Kal蛋白。不同纯化步骤产物的SDS-PAGE见图3。
7对血管内皮细胞增殖的影响
将血管内皮细胞HUVEC细胞(1×105细胞/ml)接种至96孔板，每孔100μl，细胞贴壁后加入重组Kal蛋白，培养48h后MTT法检测细胞活性。结果3μmol/L Kal蛋白组抑制率为60％±1％，1.5μmol/L Kal蛋白组抑制率为25％±1％，0.75μmol/L Kal蛋白组抑制率为15％±2％，表现出量效关系，阳性对照药内皮抑素(3μmol/L)抑制率为32％±0.9％。