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1、(10)授权公告号 CN 101550336 B (45)授权公告日 2012.05.23 CN 101550336 B *CN101550336B* (21)申请号 200910084910.1 (22)申请日 2009.05.27 C09K 11/06(2006.01) (73)专利权人 中国科学院化学研究所 地址 100190 北京市海淀区中关村北一街 2 号 (72)发明人 姚建年 李潇 詹传郎 (74)专利代理机构 北京思海天达知识产权代理 有限公司 11203 代理人 沈波 CN 1978553 A,2007.06.13, 全文 . (54) 发明名称 一种绿光发射的二氧化硅纳米粒。
2、子的制备方 法 (57) 摘要 一种绿光发射的二氧化硅纳米粒子的制备方 法属材料技术领域。现有染料掺杂纳米二氧化硅 作为生物检测标记物 ( 及载体 ) 分辨效果差。本 发明通过染料制备、 微乳液合成纳米粒子、 表面修 饰及后处理， 制得绿光发射的二氧化硅纳米粒子。 本发明所制备的二氧化硅纳米粒子荧光量子产率 高， 作为生物检测标记物 ( 及载体 ) 易于识别， 单 分散性好， 粒径可控等优点。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 狄延鑫 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附。
3、图 2 页 1/1 页 2 1. 一种绿光发射的二氧化硅纳米粒子的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1) 制备染料水溶液 ： 将染料苝四酸二酐加入到氢氧化钠水溶液中， 染料与氢氧化钠的 摩尔比 1 4， 搅拌 20min-2h 后， 去除固体， 得到染料水溶液 ； 2) 制备微乳液前体液 ： 将环己烷、 正己烷和表面活性剂曲拉通 100 混合均匀， 其中， 环 己烷与正己烷的体积比为3.65.31， 环己烷与曲拉通100的体积比为3.25.21， 得到微乳液前体液 ； 3) 制备纳米粒子微乳液 ： 将步骤 1) 中得到的染料水溶液滴加到步骤 2) 中制备的微乳 液前体液中混合均匀后，。
4、 加入原硅酸四乙酯混合均匀， 而后加入氨水， 搅拌反应 8 24 小 时， 得到纳米粒子微乳液 ； 其中， 各物质的用量关系为 ： 染料水溶液的用量为微乳液前体液 体积的 3.5 6.0， 原硅酸四乙酯的用量为微乳液前体液体积的 0.5 1.67， 原硅酸四 乙酯与氨水的体积比为 1.0 2.0 1 ； 4) 表面修饰 ： 向步骤3) 中得到的纳米粒子微乳液中加入原硅酸四乙酯和取代硅烷， 原 硅酸四乙酯和取代硅烷的用量之和为微乳液前体液体积的 0.5 1.67， 搅拌反应 8 24 小时， 得到表面修饰的纳米粒子微乳液 ； 5) 纯化分离 ： 向步骤 4) 中制备的表面修饰的纳米粒子微乳液中加。
5、入丙酮破乳后， 固液 分离， 洗涤所得沉淀， 得到绿光发射的二氧化硅纳米粒子 ； 步骤 4) 中所述的取代硅烷选自氨丙基三甲氧基硅烷或羧乙基硅三醇三钠盐中的一 种。 权 利 要 求 书 CN 101550336 B 2 1/3 页 3 一种绿光发射的二氧化硅纳米粒子的制备方法 技术领域 0001 本发明属材料技术领域， 具体涉及一种绿光发射的单分散性二氧化硅纳米粒子的 制备方法。 背景技术 0002 二氧化硅纳米粒子因其良好的生物兼容性和易于制备等特点， 在生物检测标记物 ( 及载体 ) 领域具有广阔的发展前景。国内外已开展多项关于染料掺杂纳米二氧化硅的研 究工作。但， 目前所制备的染料掺杂纳。
6、米二氧化硅的发射波长往往在 640nm 以上， 肉眼观测 偏黄色或红色， 作为生物检测标记物 ( 及载体 ) 分辨效果差。 0003 迄今为止， 还未有关于绿光发射的二氧化硅纳米粒子的研究报道。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种绿光发射的二氧化硅纳米粒子的制备方法。 0005 本发明所提供的绿光发射的二氧化硅纳米粒子的制备方法， 包括以下步骤 ： 0006 1) 制备染料水溶液 ： 将染料苝四酸二酐加入到氢氧化钠水溶液中， 染料与氢氧化 钠的摩尔比 1 4， 搅拌 20min-2h 后， 去除固体， 得到染料水溶液 ； 0007 2) 制备微乳液前体液 ： 将环己烷、 正己烷和表面。
7、活性剂曲拉通 100(TX-100) 混合 均匀， 其中， 环己烷与正己烷的体积比为 3.6 5.3 1， 环己烷与曲拉通 100 的体积比为 3.2 5.2 1， 得到微乳液前体液 ； 0008 3) 制备纳米粒子微乳液 ： 将步骤 1) 中得到的染料水溶液滴加到步骤 2) 中制备的 微乳液前体液中混合均匀后， 加入原硅酸四乙酯混合均匀， 而后加入氨水， 搅拌反应 8 24 小时， 得到纳米粒子微乳液 ； 其中， 各物质的用量关系为 ： 染料水溶液的用量为微乳液前体 液体积的 3.5 6.0， 原硅酸四乙酯的用量为微乳液前体液体积的 0.5 1.67， 原硅酸 四乙酯与氨水的体积比为 1.0。
8、 2.0 1 ； 0009 4) 表面修饰 ： 向步骤 3) 中得到的纳米粒子微乳液中加入原硅酸四乙酯和取代硅 烷， 原硅酸四乙酯和取代硅烷的用量 ( 原硅酸四乙酯与取代硅烷可以任意比例混合 ) 之和 为微乳液前体液体积的 0.5 1.67， 搅拌反应 8 24 小时， 得到表面修饰的纳米粒子微 乳液 ； 0010 5) 纯化分离 ： 向步骤 4) 中制备的表面修饰的纳米粒子微乳液中加入丙酮破乳后， 固液分离， 洗涤所得沉淀， 得到绿光发射的二氧化硅纳米粒子。 0011 其中， 步骤 4) 中所述的取代硅烷选自氨丙基三甲氧基硅烷或羧乙基硅三醇三钠 盐中的一种。 0012 本发明具有以下有益效果。
9、 ： 0013 1) 本发明中所选用苝四酸二酐为荧光染料， 所制备的二氧化硅纳米粒子荧光量子 产率高， 荧光发射波长在 500 纳米附近， 显示为绿色发光， 作为生物检测标记物 ( 及载体 ) 易于识别。 说 明 书 CN 101550336 B 3 2/3 页 4 0014 2) 本发明所制备的二氧化硅纳米粒子单分散性好， 粒径可控， 表面具有自由氨基 或羧基修饰， 易于进一步修饰或与标记物结合。 附图说明 0015 图 1、 实施例 1 制备的绿光发射的二氧化硅纳米粒子的扫描电子显微镜 (SEM) 图 像。 0016 图 2、 实施例 1 制备的绿光发射的二氧化硅纳米粒子的透射电子显微镜 。
10、(TEM) 图 像。 0017 图 3、 实施例 1 制备的绿光发射的二氧化硅纳米粒子的荧光光谱。 0018 图 4、 实施例 2 制备的绿光发射的二氧化硅纳米粒子的扫描电子显微镜 (SEM) 图 像。 0019 图 5、 实施例 3 制备的绿光发射的二氧化硅纳米粒子的扫描电子显微镜 (SEM) 图 像。 0020 以下结合附图和具体实施方法对本发明作进一步说明， 但本发明的保护范围并不 局限于以下实施例。 具体实施方式 0021 实施例 1 0022 1) 制备染料水溶液 ： 将 0.1 克苝四酸二酐固体加入到 5 毫升 0.2M 的氢氧化钠溶 液中， 室温下搅拌反应 1 小时， 得到深绿色。
11、的苝四酸 ( 四 ) 钠盐溶液， 过滤， 保留清液 ； 0023 2) 制备微乳液前体液 ： 将环己烷 91 毫升、 正己烷 23 毫升和 TX-100 表面活性剂 20 毫升在三角瓶中混合均匀后， 避光保存备用 ； 0024 3) 制备纳米粒子微乳液 ： 取 11.8 毫升微乳液前体液于试管中， 并使用注射器滴加 480 微升染料水溶液， 超声池中超声 10 分钟， 再置于磁力搅拌器上搅拌 20 分钟后， 加入 100 微升原硅酸四乙酯， 磁力搅拌 20 分钟， 加入 60 微升氨水， 继续磁力搅拌 24 小时， 得到纳米 粒子微乳液 ； 0025 4) 表面修饰 ： 向步骤 3) 中得到的。
12、纳米粒子微乳液中， 加入 50 微升原硅酸四乙酯 和10微升氨丙基三甲氧基硅烷， 继续磁力搅拌反应24小时， 得到氨基表面修饰的纳米粒子 微乳液 ； 0026 5) 纯化分离 ： 向步骤 4) 中得到氨基表面修饰的纳米粒子微乳液中加入 1 毫升丙 酮破乳， 将全部沉淀转入离心管中， 于 3000 转 / 分钟的转速下离心 3 分钟， 去除上清液后， 将所得沉淀用 95的乙醇超声洗涤 3 次， 再以无水乙醇冲洗一次， 得到绿光发射的二氧化 硅纳米粒子。 0027 采用扫描电镜和投射电镜进行表征， 如图1和图2所示， 所得二氧化硅纳米粒子的 粒径为 70nm， 为单分散纳米粒子。采用荧光光谱表征，。
13、 如图 3 所示， 所得二氧化硅纳米粒子 在 485nm 和 516nm 处具有发射峰。 0028 实施例 2 0029 1) 制备染料水溶液 ： 同实施例 1 中的步骤 1) ； 0030 2) 制备微乳液前体液 ： 将环己烷 90 毫升、 正己烷 21.3 毫升和 TX-100 表面活性剂 说 明 书 CN 101550336 B 4 3/3 页 5 18 毫升在三角瓶中混合均匀后， 避光保存备用 ； 0031 3) 制备纳米粒子微乳液 ： 同实施例 1 中的步骤 3) ； 0032 4) 表面修饰 ： 向步骤 3) 中得到的纳米粒子微乳液中， 加入 40 微升原硅酸四乙酯 和60微升羧乙。
14、基硅三醇三钠盐， 继续磁力搅拌反应12小时， 得到羧基表面修饰的纳米粒子 微乳液 ； 0033 5) 纯化分离 ： 同实施例 1 中的步骤 5)， 得到绿光发射的二氧化硅纳米粒子。 0034 采用扫描电镜进行表征， 如图 4 所示， 所得二氧化硅纳米粒子的粒径为 65nm， 为单 分散纳米粒子。 0035 实施例 3 0036 1) 制备染料水溶液 ： 同实施例 1 中的步骤 1) ； 0037 2) 制备微乳液前体液 ： 将环己烷 90 毫升、 正己烷 21.3 毫升和 TX-100 表面活性剂 18 毫升在三角瓶中混合均匀后， 避光保存备用 ； 0038 3) 制备纳米粒子微乳液 ： 同实。
15、施例 1 中的步骤 3) ； 0039 4) 表面修饰 ： 向步骤 3) 中得到的纳米粒子微乳液中， 加入 40 微升原硅酸四乙酯 和60微升羧乙基硅三醇三钠盐， 继续磁力搅拌反应24小时， 得到羧基表面修饰的纳米粒子 微乳液 ； 0040 5) 纯化分离 ： 同实施例 1 中的步骤 5)， 得到绿光发射的二氧化硅纳米粒子。 0041 采用扫描电镜进行表征， 如图 5 所示， 所得二氧化硅纳米粒子的粒径为 70nm， 为单 分散纳米粒子。 0042 本发明所制备的绿光发射的二氧化硅纳米粒子作为生物标记物的应用 ： 0043 1) 将绿光发射的二氧化硅纳米粒子与羊抗鼠 IgG 在 4 摄氏度下搅。
16、拌孵育 4 小时 后， 在 pH 6.8 的磷酸盐缓冲液中透析， 每 1.5 小时更换磷酸盐缓冲液， 更换三次后取出， 聚乙二醇 20000 中浓缩， 得到标记液 ； 0044 2) 将标记液用 pH 7.2 的 PBST( 磷酸盐缓冲液中加入 1的曲拉通 100) 稀释至 在 520nm 处吸光度为 0.2 为宜， 得到稀释标记液 ； 0045 3) 以鼠 IgG 和牛血清白蛋白分别包覆 96 孔酶标板 ： 取鼠 I gG 和牛血清白蛋白各 1 毫克， 分别以 pH 6.8 的磷酸盐缓冲液 50 毫升溶解后， 分别加入 96 孔酶标板中， 每孔加 入 200 微升， 37 摄氏度下孵育 2 。
17、小时后， 用磷酸盐缓冲液清洗两次去除未附着蛋白 ； 0046 4) 将步骤 2) 中稀释后的标记液分别加入步骤 3) 中以鼠 I gG 包覆的酶标板和以 牛血清白蛋白包覆的酶标板内， 37 摄氏度下孵育 30 分钟后， 用磷酸盐缓冲液清洗一次。以 鼠 IgG 包覆酶标板在阳光下具有绿色发光， 而以牛血清白蛋白包覆酶标板则无， 显示鼠 IgG 呈阳性， 而牛血清白蛋白呈阴性。 说 明 书 CN 101550336 B 5 1/2 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101550336 B 6 2/2 页 7 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 101550336 B 7 。