黑曲霉来源Α葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法及应用.pdf

本发明公开一种黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法及应用,具体涉及以下工艺流程：（1）液体培养黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌株，经离心或膜分离技术收集含α-葡萄糖苷酶的菌丝体；（2）将上述菌丝体保持完整或经研磨后制成细胞碎片或粉末；（3）将完整菌丝体、细胞碎片或粉末经冷冻干燥或喷雾干燥后，计量，分装，即制得α-葡萄糖苷酶固体制剂。本发明方法生产工艺简便、清洁，生产成本低；该α-葡萄糖苷酶剂用于转化淀粉糖化液或麦芽糖浆生产低聚异麦芽糖，与采用进口酶制剂相比，可大幅度降低生产成本。

1.  黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂，其特征在于：有效成分为α-葡萄糖苷酶，其来源于黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌株。

2.  根据权利要求1所述的黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）液体培养黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌株，收集含α-葡萄糖苷酶的菌丝体；
（2）将上述菌丝体保持完整或经研磨后制成细胞碎片或粉末；
（3）将步骤（2）中的完整菌丝体、细胞碎片或粉末经冷冻干燥或喷雾干燥；
（4）计量，分装，即得α-葡萄糖苷酶固体制剂。

3.  根据权利要求1所述的黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂，其特征在于：所述步骤（1）中的黑曲霉（Aspergillus niger）M1，保藏编号CCTCC NO:M2014421，保藏日期为2014年9月23日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。

4.  根据权利要求1所述的黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂，其特征在于：所述黑曲霉（Aspergillus niger）M1，其合成的α-葡萄糖苷酶为胞内酶。

5.  根据权利要求2所述的黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）的具体方法为：以黑曲霉（Aspergillus niger）M1为发酵菌种，在30～35℃条件下在培养24h～48h后，发酵液经离心或膜分离技术收集含α-葡萄糖苷酶的菌丝体；所述膜分离技术为真空抽滤、板框过滤或超滤中的任意一种。

6.  权利要求1所述的黑曲霉来源的α-葡萄糖苷酶固体制剂，在转化淀粉糖化液或麦芽糖浆生产低聚异麦芽糖方面的应用。

7.  根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的淀粉糖化液是利用薯类淀粉或谷类淀粉经过α-淀粉酶或真菌淀粉酶液化，然后用β-糖化酶或真菌淀粉酶糖化制取。

8.  根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的麦芽糖浆是固形物质量百分含量5～50%的麦芽糖浆。

黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法及应用
技术领域
本发明属于微生物酶制剂领域，特别涉及到一种黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法及其用途。
背景技术
α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC 3.2.1.20）是一种广泛存在于动、植物及微生物体内的外切型糖苷酶。它能识别并水解糖类、糖脂、糖肽等糖类衍生物或糖类类似物的非还原性端的α-(1,4)糖苷键，释放出D-葡萄糖；除了水解活力外，某些α-葡萄糖苷酶还在不同程度上具备催化转苷反应的能力，能将游离的葡萄糖残基转移到其它的糖类物质、糖类衍生物或糖类类似物受体底物上，形成新的糖类、糖脂或糖肽等，因而此类α-葡萄糖苷酶又被称作葡萄糖基转移酶（transglucosidase，D-glucosyltransferase，EC 2.4.1.24）。由黑曲霉等丝状真菌产生的α-葡萄糖苷酶能够通过其自身的转苷活力催化发酵性的糊精及低聚麦芽糖转化成非发酵性的低聚异麦芽糖，是目前低聚异麦芽糖工业生产中的关键酶。
低聚异麦芽糖（Isomaltooligosaccharides, IMO），是由一系列聚合度为2-10的葡聚糖组成的混合物，它们的分子中均至少带有1个α-(1,6)糖苷键。IMO的理化性质相当稳定、加工性质佳、保健功能确切且在同类低聚糖产品中性价比高，目前是产量最大、应用最广、价格最有竞争力的低聚糖产品，其具有低热量、抗龋齿、促进机体肠道双歧杆菌增殖等特殊生理功能，现已广泛应用于食品、医药及保健品、饲料等行业。近年来IMO在日本的年需求量稳定保持在15,000吨以上；在我国，IMO的产销量均保持稳定增长，已突破50,000吨/年，并被列为我国“OLIGO项目”的重点推广品种之一。
目前，IMO产业在国内已初具规模，涌现了如山东保龄宝等较大的生产企业，以及数量众多的产品开发和销售企业，国内IMO的生产和消费也进入迅速增长中。但是，国内IMO的生产多采用传统的转化法工艺，生产中液化和糖化工序所使用的为国产淀粉酶制剂，但转苷反应所用的关键酶α-葡萄糖苷酶因为国内的产品技术尚不成熟，需要以大量从日本进口（产品名为Transglucosidase）。Transglucosidase的转苷能力强且性能稳定，更利于IMO产品质量的控制以及工艺优化，但其价格昂贵且供应量有限，使得国内IMO的生产成本居高不下，相当程度上阻碍了IMO的推广。因此，开发可替代日本产品的转苷酶制剂的是我国IMO产业面临的紧迫问题。国内学者为此做了很多工作，如选育产生转苷酶的菌株、确定并优化其发酵产酶的条件；具有转葡萄糖基活力相关酶基因资源的开发利用；研究酶的纯化、纯酶的性质及工业酶制剂的制备技术；开发酶或产酶微生物细胞的固定化及重复使用等应用技术。但在大量的研究工作中，仅有少数技术适用于IMO的工业化生产。
α-葡萄糖苷酶工业化生产的研究进展之所以如此缓慢，很大程度上是因为α-葡萄糖苷酶高产菌株的缺乏以及酶制剂制备技术的滞后。一方面，国内外研究人员选育获得的α-葡萄糖苷酶菌株其酶活力均较低，难以实现工业化生产；另一方面，通过基因工程手段使α-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中高效表达，一般为胞内酶，其提取工艺复杂，酶活回收率低，也不利于工业化生产。
发明内容
本发明本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂，有效成分为α-葡萄糖苷酶，其来源于黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌株，其合成的α-葡萄糖苷酶为胞内酶。该黑曲霉的保藏编号CCTCC NO:M2014421，保藏日期为2014年9月23日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。
本发明利用具有自主知识产权的黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌株，其所产α-葡萄糖苷酶为胞内酶，液体培养后经离心或膜分离技术收集含α-葡萄糖苷酶的菌丝体，将菌丝体保持完整或经研磨后制成细胞碎片或粉末，经冷冻干燥或喷雾干燥后，即制得α-葡萄糖苷酶固体制剂。该酶制剂可用于转化淀粉糖化液或麦芽糖浆生产低聚异麦芽糖。本发明不仅实现了α-葡萄糖苷酶的国产化，大大改善国内低聚异麦芽糖生产工业受制于国外企业的局面，而且可大幅度降低低聚异麦芽糖生产中的酶制剂成本。
黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法包括以下步骤：
（1）液体培养黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌株，收集含α-葡萄糖苷酶的菌丝体；方法为：以黑曲霉（Aspergillus niger）M1为发酵菌种，在30～35℃条件下在培养24h～48h后，发酵液经离心或膜分离技术收集含α-葡萄糖苷酶的菌丝体；所述膜分离技术为真空抽滤、板框过滤或超滤中的任意一种。
（2）将上述菌丝体保持完整或经研磨后制成细胞碎片或粉末。
（3）将步骤（2）中的完整菌丝体、细胞碎片或粉末经冷冻干燥或喷雾干燥。
（4）计量，分装，即得α-葡萄糖苷酶固体制剂。
本发明黑曲霉来源的α-葡萄糖苷酶固体制剂，主要应用在在转化淀粉糖化液或麦芽糖浆生产低聚异麦芽糖方面。所述的淀粉糖化液是利用薯类淀粉或谷类淀粉，例如木薯淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉或大米淀粉经过α-淀粉酶或真菌淀粉酶液化，然后用β-糖化酶或真菌淀粉酶糖化制取；所述的麦芽糖浆是固形物质量百分含量5～50%的市售麦芽糖浆。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.自主知识产权菌株黑曲霉（Aspergillus niger）M1，与现有报道的α-葡萄糖苷酶菌株相比，其合成的α-葡萄糖苷酶为胞内酶，菌体细胞可作为其天然的固定载体，可以菌丝体、细胞碎片或粉末形式制成α-葡萄糖苷酶固体制剂，十分有利于规模化制备。
2.该α-葡萄糖苷酶固体制剂，生产工艺简便、清洁，生产成本低；该酶制剂可用于转化淀粉糖化液或麦芽糖浆生产低聚异麦芽糖，与采用进口酶制剂相比，可大幅度降低生产成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。
实施例1：黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法及其应用1
（1）将产α-葡萄糖苷酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）M1作为菌种，32℃条件下培养36h后，发酵液经真空抽滤收集菌丝体。
（2）将菌丝体研磨后过10目筛，制成细胞碎片，经冷冻干燥后，计量、分装，即制得α-葡萄糖苷酶固体制剂。
（3）将固形物质量百分含量30%的麦芽糖浆，调节pH4.5，添加上述制得的α-葡萄糖苷酶固体制剂10%（m/v），55℃条件下转苷反应7h，即制得低聚异麦芽糖浆，经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG₃）含量为62.52%。麦芽糖浆为市售产品，生产公司为肇庆焕发生物科技有限公司。
实施例2：黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法及其应用2
（1）将产α-葡萄糖苷酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）M1作为菌种，35℃条件下培养36h后，发酵液经离心收集菌丝体。
（2）将菌丝体保持完整，经冷冻干燥后，计量、分装，即制得α-葡萄糖苷酶固体制剂。
（3）将固形物质量百分含量40%的麦芽糖浆，调节pH4.5，添加上述制得的α-葡萄糖苷酶固体制剂15%（m/v），55℃条件下转苷反应6h，即制得低聚异麦芽糖浆，经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG₃）含量为69.26%。麦芽糖浆为市售产品，生产公司为肇庆焕发生物科技有限公司。
实施例3：黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法及其应用3
（1）将产α-葡萄糖苷酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）M1作为菌种，30℃条件下培养48h后，发酵液经超滤收集菌丝体。
（2）将菌丝体研磨后过200目筛，制成细胞粉末，经喷雾干燥后，计量、分装，即制得α-葡萄糖苷酶固体制剂。
（3）将固形物质量百分含量10%的麦芽糖浆，调节pH4.5，添加上述制得的α-葡萄糖苷酶固体制剂10%（m/v），50℃条件下转苷反应8h，即制得低聚异麦芽糖浆，经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG₃）含量为36.39%。麦芽糖浆为市售产品，生产公司为肇庆焕发生物科技有限公司。
实施例4：黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法及其应用4
（1）将产α-葡萄糖苷酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）M1作为菌种，35℃条件下培养24h后，发酵液经板框过滤收集菌丝体。
（2）将菌丝体研磨后过18目筛，制成细胞碎片，经冷冻干燥后，计量、分装，即制得α-葡萄糖苷酶固体制剂。
（3）将固形物质量百分含量20%的麦芽糖浆，调节pH4.5，添加上述制得的α-葡萄糖苷酶固体制剂20%（m/v），50℃条件下转苷反应8h，即制得低聚异麦芽糖浆，经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG₃）含量为49.66%。麦芽糖浆为市售产品，生产公司为肇庆焕发生物科技有限公司。
实施例5：黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法及其应用5
（1）将产α-葡萄糖苷酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）M1作为菌种，32℃条件下培养36h后，发酵液经板框过滤收集菌丝体。
（2）将菌丝体研磨后过10目筛，制成细胞碎片，经冷冻干燥后，计量、分装，即制得α-葡萄糖苷酶固体制剂。
（3）将固形物质量百分含量50%的麦芽糖浆，调节pH4.5，添加上述制得的α-葡萄糖苷酶固体制剂20%（m/v），55℃条件下转苷反应5h，即制得低聚异麦芽糖浆，经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG₃）含量为70.56%。麦芽糖浆为市售产品，生产公司为肇庆焕发生物科技有限公司。
实施例6：黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法及其应用6
（1）将产α-葡萄糖苷酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）M1作为菌种，32℃条件下培养36h后，发酵液经离心收集菌丝体。
（2）将菌丝体研磨后过10目筛，制成细胞碎片，经冷冻干燥后，计量、分装，即制得α-葡萄糖苷酶固体制剂。
（3）将固形物质量百分含量20%的木薯淀粉糖化液，调节pH4.5，添加上述制得的α-葡萄糖苷酶固体制剂20%（m/v），50℃条件下转苷反应8h，即制得低聚异麦芽糖浆，经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG₃）含量为49.66%。木薯淀粉糖化液是以木薯淀粉经α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。
实施例7：黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法及其应用7
（1）将产α-葡萄糖苷酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）M1作为菌种，32℃条件下培养36h后，发酵液经离心收集菌丝体。
（2）将菌丝体研磨后过10目筛，制成细胞碎片，经冷冻干燥后，计量、分装，即制得α-葡萄糖苷酶固体制剂。
（3）将固形物质量百分含量20%的玉米淀粉糖化液，调节pH4.5，添加上述制得的α-葡萄糖苷酶固体制剂10%（m/v），55℃条件下转苷反应8h，即制得低聚异麦芽糖浆，经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG₃）含量为58.25%。玉米淀粉糖化液是以玉米淀粉经α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。
实施例8：黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法及其应用8
（1）将产α-葡萄糖苷酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）M1作为菌种，32℃条件下培养36h后，发酵液经离心收集菌丝体。
（2）将菌丝体研磨后过10目筛，制成细胞碎片，经冷冻干燥后，计量、分装，即制得α-葡萄糖苷酶固体制剂。
（3）将固形物质量百分含量25%的小麦淀粉糖化液，调节pH4.5，添加上述制得的α-葡萄糖苷酶固体制剂10%（m/v），55℃条件下转苷反应8h，即制得低聚异麦芽糖浆，经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG₃）含量为52.39%。小麦淀粉糖化液是以小麦淀粉经α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。
实施例9：黑曲霉来源α-葡萄糖苷酶固体制剂的制备方法及其应用9
（1）将产α-葡萄糖苷酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）M1作为菌种，32℃条件下培养36h后，发酵液经离心收集菌丝体。
（2）将菌丝体研磨后过10目筛，制成细胞碎片，经冷冻干燥后，计量、分装，即制得α-葡萄糖苷酶固体制剂。
(3)将固形物质量百分含量25％的大米淀粉糖化液，调节pH4.5，添加上述制得的α-葡萄糖苷酶固体制剂10％(m/v)，60℃条件下转苷反应7h，即制得低聚异麦芽糖浆，经高效液相色谱仪测定，有效三糖(IG+P+IG3)含量为55.42％。马铃薯淀粉糖化液是以马铃薯淀粉经α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。