用于在木霉属的突变体中产生异源多肽的方法.pdf

本发明涉及亲本木霉属菌株的突变体，这些突变体包括一种编码多肽的多核苷酸和一种或多种选自下组的基因，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、以及第三萜烯环化酶基因，其中这些基因的一种或多种是经修饰的，使得该突变株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比在一种或多种选自下组的酶的产生中有缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、第二萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。本发明还涉及在此类突变体中产生多肽的方法和用于产生此类突变体的方法。

1.  一种亲本木霉属菌株的突变体，包括一种编码异源多肽的多核苷酸和一种或多种选自下组的基因，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、以及第三萜烯环化酶基因，其中这些基因的一个或多个是经修饰的，使得该突变株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比在一种或多种选自下组的酶的产生中有缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、第二萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。

2.  如权利要求1所述的突变体，其中该哌珀霉素合成酶基因编码一种具有哌珀霉素合成酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:2具有至少60％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件下与SEQ ID NO:1或其cDNA序列或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:1或其cDNA序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及(d)一种多肽，包括或其组成为SEQ ID NO:2。

3.  如权利要求1或2所述的突变体，其中该副胞菌素合成酶基因编码一种具有副胞菌素合成酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)包括或其组成为与SEQ ID NO:4具有至少60％序列一致性的氨基酸序列的多肽；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件下与SEQ ID NO:3或其cDNA序列或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；(c)一种多肽，该多肽由包括或其组成为与SEQ ID NO:3或其cDNA序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及(d)一种多肽，包括或其组成为SEQ ID NO: 4。

4.  如权利要求1-3中任一项所述的突变体，其中该第一萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:6具有至少60％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件下与SEQ ID NO:5或其基因组DNA序列或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:5或其基因组DNA序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及(d)一种多肽，包括或其组成为SEQ ID NO:6。

5.  如权利要求1-4中任一项所述的突变体，其中该第二萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括或其组成为与SEQ ID NO:8具有至少60％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件下与SEQ ID NO:7或其基因组DNA序列或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；(c)一种多肽，该多肽由包括或其组成为与SEQ ID NO:7或其基因组DNA序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及(d)一种多肽，包括或其组成为SEQ ID NO:8。

6.  如权利要求1-5中任一项所述的突变体，其中该第三萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:10具有至少60％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件下与SEQ ID NO:9或其基因组DNA序列或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；(c)一种多肽，该多肽由 包括与SEQ ID NO:9或其基因组DNA序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及(d)一种多肽，包括或其组成为SEQ ID NO:10。

7.  一种产生异源多肽的方法，该方法包括：在用于产生该异源多肽的培养基中培养亲本木霉属菌株的一种突变体，其中该突变体菌株包括一种编码该异源多肽的多核苷酸和一种或多种选自下组的基因，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、以及第三萜烯环化酶基因，其中这些基因的一个或多个是经修饰的，使得该突变株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比在一种或多种选自下组的酶的产生中有缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、第二萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。

8.  如权利要求7所述的方法，进一步包括从培养基中回收该异源多肽。

9.  如权利要求7或8所述的方法，其中该哌珀霉素合成酶基因编码一种具有哌珀霉素合成酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:2具有至少60％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件下与SEQ ID NO:1或其cDNA序列或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:1或其cDNA序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及(d)一种多肽，包括或其组成为SEQ ID NO:2。

10.  如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中该副胞菌素合成酶基因编码一 种具有副胞菌素合成酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括或其组成为与SEQ ID NO:4具有至少60％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件下与SEQ ID NO:3或其cDNA序列或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；(c)一种多肽，该多肽由包括或其组成为与SEQ ID NO:3或其cDNA序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及(d)一种多肽，包括或其组成为SEQ ID NO:4。

11.  如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中该第一萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:6具有至少60％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件下与SEQ ID NO:5或其基因组DNA序列或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:5或其基因组DNA序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及(d)一种多肽，包括或其组成为SEQ ID NO:6。

12.  如权利要求7-11中任一项所述的方法，其中该第二萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括或其组成为与SEQ ID NO:8具有至少60％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件下与SEQ ID NO:7或其基因组DNA序列或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；(c)一种多肽，该多肽由包括或其组成为与SEQ ID NO:7或其基因组DNA序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及(d)一种多肽，包括或其组成为SEQ ID NO:8。

13.  如权利要求7-12中任一项所述的方法，其中该第三萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:10具有至少60％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件下与SEQ ID NO:9或其基因组DNA序列或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:9或其基因组DNA序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及(d)一种多肽，包括或其组成为SEQ ID NO:10。

14.  一种用于获得亲本木霉属菌株的突变体的方法，包括：修饰一种或多种选自下组的基因，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、和第三萜烯环化酶基因；并且鉴定来自步骤(a)的突变体菌株，其中这些基因中的一种或多种是经修饰的，使得该突变体菌株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比在一种或多种选自下组的酶的产生中有缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、第二萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。

15.  如权利要求14所述的方法，其中该哌珀霉素合成酶基因编码一种具有哌珀霉素合成酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:2具有至少60％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件下与SEQ ID NO:1或其cDNA序列或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:1或其cDNA序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列的多核 苷酸编码；以及(d)一种多肽，包括或其组成为SEQ ID NO:2。

16.  如权利要求14或15所述的方法，其中该副胞菌素合成酶基因编码一种具有副胞菌素合成酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括或其组成为与SEQ ID NO:4具有至少60％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件下与SEQ ID NO:3或其cDNA序列或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；(c)一种多肽，该多肽由包括或其组成为与SEQ ID NO:3或其cDNA序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及(d)一种多肽，包括或其组成为SEQ ID NO:4。

17.  如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中该第一萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:6具有至少60％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件下与SEQ ID NO:5或其基因组DNA序列或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:5或其基因组DNA序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及(d)一种多肽，包括或其组成为SEQ ID NO:6。

18.  如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中该第二萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括或其组成为与SEQ ID NO:8具有至少60％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件下与SEQ ID NO:7或其基因组DNA序列或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；(c)一种多 肽，该多肽由包括或其组成为与SEQ ID NO:7或其基因组DNA序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及(d)一种多肽，包括或其组成为SEQ ID NO:8。

19.  如权利要求14-18中任一项所述的方法，其中该第三萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:10具有至少60％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件下与SEQ ID NO:9或其基因组DNA序列或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:9或其基因组DNA序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码；以及(d)一种多肽，包括或其组成为SEQ ID NO:10。

用于在木霉属的突变体中产生异源多肽的方法
对序列表的引用
本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及在产生次生代谢物中有缺陷的木霉属突变体菌株、获得该木霉属突变体菌株的方法以及在木霉属突变体菌株中产生异源多肽的方法。
相关技术说明
已经显示木霉属可以用作宿主细胞，以用于重组产生具有生物活性的多肽(WO 96/00787和WO 97/26330)。具有所希望的增加的蛋白表达和分泌的性状的木霉属宿主可以不一定具有用于成功发酵的最希望的特征。由于生物物质的产生对感兴趣的具体多肽的产生、回收或应用有害，发酵可能不是最佳的。
哌珀霉素是由大的被称为非核糖体肽合成酶的多结构域酶合成的，该多结构域酶从一系列前体组装化合物(包括非蛋白原氨基酸和羟基或羧酸)，其可以是N-甲基化、酰化、还原、或差向异构化的(玛拉耶尔(Marahiel)等人，1997，《化学评论》(Chem.Rev.)97:2651-2674；佐谢尔河(Zocher)和凯勒(Keller)，1997，《微生物生理学进展》(Adv.Microb.Physiol.)38:85-131)。这些合成酶具有一种模块化结构，其中每个模块是一个识别、活化和修饰最终多肽的一种单一残基的半自主性单元。每个模块可以进一步划 分为不同的腺苷酰化、巯化和缩合结构域，这些结构域一起代表这样一种合成酶的最小重复单元(斯泰因(Stein)等人，1996，《生物化学杂志》(Journal of Biological Chemistry)271:15428-15435)。
慕克吉(Mukherjee)等人，2012，《微生物学》(Microbiology)158:35-45，描述了木霉属中的次生代谢。慕克吉(Mukherjee)等人，2011，《生物化学杂志》(Journal of Biological Chemistry)286:4544-4554，披露了两类由绿色木霉的单一非核糖体肽合成酶合成的新的哌珀霉素。库比切克(Kubicek)等人，2011，《基因组生物学》(Genome Biology)12:R40，描述了一种强调重寄生作用为木霉属的祖先生活方式的比较基因组序列分析。尼奥霍夫(Neohof)等人，2007，《微生物学》(Microbiology)153:3417-3437，描述了通过木霉属进行的哌珀霉素形成的完整细胞的MALDI-TOF质谱分析。
慕克吉(Mukherjee)等人，2012(见上文)还描述了若干种木霉属菌株产生通过萜烯环化酶的作用从五-碳异戊烯基单元合成的萜类。绿色木霉基因组具有六种萜烯环化酶，而深绿木霉和里氏木霉各自具有三种。
本发明涉及改善的木霉属宿主，其结合了表达商业量的感兴趣的多肽的能力，同时在一种或多种哌珀霉素和一种或多种萜烯(可以使该多肽的产生、回收和应用复杂化)的产生中有缺陷。
发明概述
本发明涉及亲本木霉属菌株的突变体，这些突变体包括一种编码异源多肽的多核苷酸和一种或多种(例如，若干种)选自下组的基因，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、以及第三萜烯环化酶基因，其中这些基因的一种 或多种是经修饰的，使得该突变株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比在一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶的产生中有缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、第二萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。
本发明还涉及产生一种异源多肽的方法，这些方法包括：
(a)在用于产生该异源多肽的培养基中培养亲本木霉属菌株的一种突变体，其中该突变体菌株包括一种编码异源多肽的多核苷酸和一种或多种(例如若干种)选自下组的基因，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、以及第三萜烯环化酶基因，其中这些基因的一个或多个是经修饰的，使得该突变株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比在一种或多种(例如若干种)选自下组的酶的产生中有缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、第二萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶；以及任选地
(b)从培养介质中回收这些异源多肽。
本发明进一步涉及获得亲本木霉属菌株的突变体的方法，该方法包括：
(a)修饰一种或多种(例如若干种)选自下组的基因，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、和第三萜烯环化酶基因；并且
(b)鉴定来自步骤(a)的突变体菌株，其中这些基因中的一种或多种是经修饰的，使得该突变体菌株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比在一种或多种(例如若干种)选自下组的酶的产生中有缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、第二萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。
附图简要说明
图1示出了pJyHi002的限制性图谱。
图2示出了pJyHi001的限制性图谱。
定义
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
天冬氨酸蛋白酶：该术语“天冬氨酸蛋白酶”意指一种使用一个或多个天冬氨酸残基来催化肽和蛋白中的肽键水解的蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶是使用一个天冬氨酸残余物来催化其肽底物的蛋白酶家族。通常，它们在其活性位点具有两个高度保守的天冬氨酸，并且在酸性pH下具有最佳活性(思泽茨斯(Szecsi)，1992，《斯堪的纳维亚临床和实验室调查杂志》(Scand.J.Clin.Lab.In vest.)增刊210:5-22)。出于本发明的目的，根据WO 2011/075677中描述的程序确定天冬氨酸蛋白酶活性。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从成熟的剪接的mRNA分子逆转录制备的DNA分子，该mRNA分子是从真核细胞中获得。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从 一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于编码多肽的多核苷酸的表达为必要的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
缺陷：术语“缺陷”意指一种木霉属突变体菌株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比较不产生一种或多种(例如若干种)选自下组的酶的可检测的活性，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶，或者，在替代方案中，与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比优选产生少至少25％、更优选少至少50％、甚至更优选少至少75％、并且最优选少至少95％的一种或多种(若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、第二萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。由本发明的木霉属突变体菌株产生的哌珀霉素、副胞菌素、或萜类化合物的水平可以使用由诺伊霍夫(Neuhof)等人，2007，《微生物学》(Microbiology)153:3417-3437或德根科尔布(Degenkolb)等人，2012，《化学与生物多样性》(Chemistry&Biodiversity)9:499-535所描述的方法来确定。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，该细胞类型对于用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等是易感的。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不出现的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括：(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其天然相关联的一种或多种或所有天然存在的成分中去除的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于在自然界中发现的那种物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量(例如，宿主细胞中的重组体产量；编码该物质的基因的多个拷贝；以及比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)而修饰的任何物质。
低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200 微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指呈其在翻译以及任何翻译后修饰之后的最终形式的多肽，所述修饰如N-末端加工、C-末端截断、糖基化、磷酸化等。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
修饰：术语“修饰”意指在一种基因或一种其转录或翻译所需的控制序列中引入、取代或去除一个或多个(例如若干个)核苷酸、或基因破坏、基因转换、基因缺失、或基因的随机或特异性诱变，该基因例如哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、第三萜烯环化酶基因、或其组合。哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、以及第三萜烯环化酶 基因的一种或多种(例如若干种)的缺失可以是部分的或完全的。该修饰导致该哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、第二萜烯环化酶、第三萜烯环化酶、或其组合的表达的减少或消除(失活)。在一个优选的方面，哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、第三萜烯环化酶基因的一种或多种(例如若干种)是失活的。
非核糖体肽合成酶：术语“非核糖体肽合成酶”意指一类包括非蛋白原氨基酸(特别是α-氨基异丁酸)的非核糖体合成肽(被称为哌珀霉素)的生物合成中涉及的酶。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或者以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
副胞菌素：术语“副胞菌素”意指包含α-氨基异丁酸的肽抗生素。副胞菌素是一种由苯丙氨醇(phenylalaninol)作为C-末端氨基醇的存在以及通过哌珀霉素的特定氨基酸含量和序列表征的哌珀霉素(普齐比尔斯基(Przybylski)等人，1984，《生物医学质谱》(Biomed.Mass Spectrometry)11,569；布鲁克纳等人，1983，《经验》(Experientia)39:528-530；布鲁克纳等人，1984，《经验》40:1189-1197；莱迪恩尼(Ritieni)等人，1995，《天然产品杂志》(Journal of Natural Products)58:1745-1748；波克斯阿尔维(Pócsfalvi)等人，1997，《质谱快讯》(Rapid Commun.Mass  Spectrometry)11:922-930)。
副胞菌素合成酶：术语“副胞菌素合成酶”意指一种催化副胞菌素形成的哌珀霉素合成酶。
哌珀霉素：术语“哌珀霉素”意指由短的线性链长度(<20残基)、C-末端醇残基、和高水平非标准氨基酸(主要是α-氨基异丁酸)、异缬氨酸和亚氨基酸羟脯氨酸表征的肽。哌珀霉素亚家族1、4、5和9已经得以描述(塞凯赖什(Szekeres)等人，2005，《匈牙利微生物免疫学学报》(Acta.Microbiol.Immunol.Hung.)52:137-168)。亚家族1(SF1)包括大约一半的已知结构并且包含长度范围从18至20个残基的肽。所有这些肽具有部分序列一致性或相似性。亚家族4(SF4)是由11-14个残基构成的，还与SF1共享序列相似性，但是与SF1不具有序列关系。亚家族5和9(SF5和SF9)仅具有一些成员并且分别包括含有11个或6个和7个残基的多肽，与其他亚家族也不具有序列相似性(诺伊霍夫(Neuhof)等人，2007，《微生物学》(Microbiology)153:3417-3427；惠特莫尔(Whitmore)等人，2004，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)32D593-D594；慕克吉(Mukherjee)等人，2011，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)286:4544-4554)。
哌珀霉素合成酶：术语“哌珀霉素合成酶”意指涉及一种或多种哌珀霉素合成的非核糖体肽合成酶。
多肽片段：术语“多肽片段”意指从多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽，其中该片段具有酶活性，例如副胞菌素合成酶、哌珀霉素合成酶、或萜烯环化酶活性。在一个方面，一个片段含有哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶或萜烯环化酶的至少85％的氨基酸残基(例如至少90％的氨基酸残基或至少95％的氨基酸残基)，如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10；或其同 源序列。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从 一种多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的核苷酸序列，其中该子序列编码具有酶活性(例如副胞菌素合成酶、哌珀霉素合成酶、或萜烯合成酶活性)的片段。在一个方面，子序列含有编码哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶或萜烯环化酶的多核苷酸的至少85％的核苷酸(例如至少90％的核苷酸或至少95％的核苷酸)，如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:9；或其同源序列。
枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶：术语“枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶”意指一种具有类似于枯草杆菌蛋白酶的底物特异性的蛋白酶，其使用一个丝氨酸残基用于催化多肽和蛋白质中的肽键的水解。枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(枯草杆菌酶)是由天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸这三种氨基酸的催化三联体表征的丝氨酸蛋白酶。来自地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)的原型枯草杆菌蛋白酶共享这些催化残基的安排(西埃泽恩(Siezen)和洛因伊森(Leunissen)，1997，《蛋白质科学》(Protein Science)6:501-523)。出于本发明的目的，根据WO 2011/075677中描述的程序确定枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性。
萜烯环化酶：术语“萜烯环化酶”意指一种通过含有不同数目的异戊二烯单位的线性萜烯(例如异戊烯基-焦磷酸、牦牛儿基-焦磷酸、法呢基-焦磷酸和牦牛儿基-焦磷酸)的环化来催化环状萜烯的形成的酶。绿色木霉基因组具有六种萜烯环化酶，而深绿木霉和里氏木霉各自具有三种。
萜烯：术语“萜烯”意指一组由若干个自异戊烯焦磷酸合成的异戊二烯单位构成的天然产物。萜烯也被称为萜类化合物或类异戊二烯。
胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶：术语“胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶”意指一种具有类似于胰蛋白酶的底物特异性的蛋白酶，其使用一个丝氨酸残基用于催化多肽和蛋白质中的肽键的水解。出于本发明的目的，根据由WO  2011/075677描述的程序确定胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性。
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
非常低严格条件：术语“非常低严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
发明详细说明
本发明涉及亲本木霉属菌株的突变体，这些突变体包括一种编码异源多肽的多核苷酸和一种或多种(例如，若干种)选自下组的基因，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、以及第三萜烯环化酶基因，其中这些基因的一种或多种是经修饰的，使得该突变株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比在一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶的产生中有缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、第二萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。
本发明还涉及用于产生一种异源多肽的方法，这些方法包括：(a)在用于产生该异源多肽的培养基中培养亲本木霉属菌株的一种突变体，其中该突变体菌株包括一种编码异源多肽的多核苷酸和一种或多种(例如若干种)选自 下组的基因，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、以及第三萜烯环化酶基因，其中这些基因的一个或多个是经修饰的，使得该突变株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比在一种或多种(例如若干种)选自下组的酶的产生中有缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、第二萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶；并且任选地(b)从该培养基中回收该异源多肽。
本发明进一步涉及获得亲本木霉属菌株的突变体的方法，该方法包括：(a)修饰一种或多种(例如若干种)选自下组的基因，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、和第三萜烯环化酶基因；以及(b)鉴定来自步骤(a)的突变体菌株，其中这些基因中的一种或多种是经修饰的，使得该突变体菌株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比在一种或多种(例如若干种)选自下组的酶的产生中有缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、第二萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。
术语“哌珀霉素合成酶基因”和“副胞菌素合成酶基因”在此还分别被称为“第一哌珀霉素合成酶基因”和“第二哌珀霉素合成酶基因”。术语“哌珀霉素合成酶”和“副胞菌素合成酶”在此还分别被称为“第一哌珀霉素合成酶”和“第二哌珀霉素合成酶”。
本发明的优点是消除或减少了一种或多种(例如若干种)酶活性，这些酶活性可以对感兴趣的具体多肽的产生、回收和/或应用是有害的。
在本发明的方法中，亲本木霉属菌株可以是任何木霉属菌株，如一种野生型木霉属菌株或其一种突变体。该亲本木霉属菌株可以是哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉；或其可替代的有性形式，例如肉 座菌属。
在另一个方面中，该亲本木霉属菌株是哈茨木霉。在另一个方面中，该亲本木霉属菌株是康宁木霉。在另一个方面中，该亲本木霉属菌株是长枝木霉。在另一个方面中，该亲本木霉属菌株是里氏木霉。在另一个方面中，该亲本木霉属菌株是绿色木霉。
在另一个方面中，该亲本里氏木霉菌株是里氏木霉RutC30。在另一个方面中，该亲本里氏木霉菌株是里氏木霉的突变体。在另一个方面中，该亲本里氏木霉菌株是里氏木霉RutC30的突变体。在另一个方面中，该亲本里氏木霉菌株是里氏木霉的形态突变体(WO 97/26330)。
本发明的木霉属突变体菌株可以通过使用本领域熟知的方法，如插入、破坏、替代或缺失来减少或消除一种或多种(例如若干种)选自下组的基因的表达来构建，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、以及第三萜烯环化酶基因。可以修饰该基因的一部分，如编码区或为编码区的表达所需的控制序列。该基因的这样一种控制序列可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响该基因的表达的部分。例如，可以将启动子序列失活从而无表达或可以将天然启动子替换为较弱的启动子以减少编码序列的表达。可修饰的其他控制序列包括但不限于前导子、前肽序列、信号序列、转录终止子以及转录激活因子。
可以通过基因缺失技术来构建木霉属突变体菌株，以消除或减少这些基因的表达。基因缺失技术使得可以部分或完全除去该基因，从而消除其表达。在此类方法中，使用已经构建为邻接地包含侧翼于该基因的5'和3'区的质粒，通过同源重组完成该基因的缺失。
还可以通过引入、取代和/或除去该基因或为其转录或翻译所需的其控制 序列中的一个或多个(例如若干个)核苷酸来构建木霉属突变体菌株。例如，可以插入或除去核苷酸，例如用于引入终止密码子、除去起始密码子或移码开放阅读框。可以根据本领域已知的方法，通过定点诱变或PCR产生的诱变完成这样的修饰。参见，例如波特斯坦(Botstein)和绍特勒(Shortle)，1985，《科学》(Science)229:4719；洛(Lo)等人，1985，《美国国家科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)81:2285；樋口(Higuchi)等人，1988，《核酸研究》(NNucleic Acids Research)16:7351；岛田(Shimada)，1996，《分子生物学方法》(Meth.Mol.Biol.)57:157；霍(Ho)等人，1989，《基因》(Gene)77:61；霍尔顿(Horton)等人，1989，《基因》(Gene)77:61；以及萨卡尔(Sarkar)和松梅尔(Sommer)，1990，《生物技术》(BioTechniques)8:404。
还可以通过基因破坏技术，通过将破坏性核酸构建体插入进该基因中而构建木霉属突变体菌株，该破坏性核酸构建体包括与该基因同源的核酸片段，该片段将产生具有同源性的区域的重复并且在重复的区域之间掺入构建体DNA。这样的一种基因破坏可以消除基因表达，如果插入的构建体将该基因的启动子与编码区分离或打断编码序列，这样使得产生无功能性基因产物。破坏构建体可以简单地是伴有与该基因同源的5’和3’区的选择性标记基因。该选择性标记使得可以鉴定包含破坏的基因的转化株。
还可以通过基因转化过程构建木霉属突变体菌株(参见例如，伊格莱西亚斯(Iglesias)和特劳特勒(Trautner)，1983，《分子普通遗传学》(Molecular General Genetics)189:73-76)。例如，在基因转化方法中，将对应于该基因的核苷酸序列体外诱变，以产生缺陷核苷酸序列，然后将其转化进亲本木霉属菌株中以产生缺陷基因。通过同源重组，该缺陷核苷酸序列替换该内源基因。该缺陷核苷酸序列还包括一种用于选择含有缺陷基因的转化 株的标记可以是令人希望的。
还可以使用与该基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列，通过已建立的反义技术构建木霉属突变体菌株(帕里斯(Parish)和斯托克(Stoker)，1997，FEMS微生物学简讯(FEMS Microbiology Letters)154:151-157)。更确切而言，可以通过引入与该基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列来减少或失活木霉属菌株对该基因的表达，该核苷酸序列可以在该菌株中转录并且能够与在该菌株中产生的mRNA杂交。在允许互补的反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，所翻译蛋白的量由此减少或消除。
该木霉属突变体菌株还可以通过已确立的RNA干扰(RNAi)技术来构建(参见，例如WO 2005/056772和WO 2008/080017)。
可以使用本领域熟知的方法(包括但不限于化学诱变)，通过随机或特异诱变进一步构建木霉属突变体菌株(参见例如，霍普伍德(Hopwood)，《微生物学方法中的突变体分离》(The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology)(J.R.诺里斯(Norris)和D.W.里本(Ribbons)，编辑))第363-433页，学术出版社(Academic Press)，纽约，1970)。可以通过使亲本菌株经受诱变并筛选其中该基因的表达已经被减少或失活的突变体菌株来修饰该基因。诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适合的物理或化学诱变剂、使用适合的寡核苷酸或使DNA序列经受PCR产生的诱变来进行。此外，诱变可以通过使用这些诱变方法的任何组合来进行。
适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射，羟胺，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，N-甲基-N’-亚硝基胍(NTG)邻甲基羟胺，亚硝酸，乙基甲磺酸(EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸和核苷酸类似物。当使用此类试剂时，诱变典型地是在适合条件下在所选的诱变剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本菌株并选择展现出该基因的减少表达 或无表达的突变体来进行的。
在一个方面中，该修饰导致一种或多种(例如若干种)选自下组的基因的失活，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、和第三萜烯环化酶基因。在另一个方面中，该修饰导致一种或多种(例如若干种)选自下组的基因的表达的减少，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、和第三萜烯环化酶基因。在另一个方面中，该修饰导致一种或多种(例如若干种)选自下组的基因的表达减少、失活或其组合，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、和第三萜烯环化酶基因。
在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括副胞菌素合成酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括第一萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括第二萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括第三萜烯环化酶基因的修饰。
在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因和副胞菌素合成酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因和第一萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因和第二萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括副胞菌素合成酶基因和第一萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括副胞菌素合成酶基因和第二萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括副胞菌素合成酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。在另 一个方面中，该突变体包括第一萜烯环化酶基因和第二萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括第一萜烯环化酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括第二萜烯环化酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。
在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因和第一萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因和第二萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括副胞菌素合成酶基因、第二萜烯环化酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因和第二萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因和第二萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因、第二萜烯环化酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。
在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因和第二萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因和第三萜烯 环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第二萜烯环化酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。
在另一个方面中，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。
在一个方面中，该哌珀霉素合成酶基因编码一种具有哌珀霉素合成酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列。在另一个方面中，该哌珀霉素合成酶基因编码一种具有哌珀霉素合成酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:2。
在另一个方面中，该哌珀霉素合成酶基因包括一种多核苷酸，该多核苷酸包括或其组成为与SEQ ID NO:1或其cDNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列。在另一个方面中，该哌珀霉素合成酶基因包括一种多核苷酸，该核苷酸包括或其组成为SEQ ID NO:1。
在另一个方面中，该哌珀霉素合成酶基因包括一种多核苷酸，该多核苷 酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与SEQ ID NO:1或其cDNA序列；或与前两者的全长互补体杂交。
在另一个方面中，该副胞菌素合成酶基因编码一种具有副胞菌素合成酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为与SEQ ID NO:4具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列。在另一个方面中，该副胞菌素合成酶基因编码一种具有副胞菌素合成酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:4。
在另一个方面中，该副胞菌素合成酶基因包括一种多核苷酸，该多核苷酸包括或其组成为与SEQ ID NO:3具有至少60％，例如，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列。在另一个方面中，该副胞菌素合成酶基因包括一种多核苷酸，该多核苷酸包括或其组成为SEQ ID NO:3。
在另一个方面中，该副胞菌素合成酶基因包括一种多核苷酸，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与SEQ ID NO:3或其cDNA序列；或与前两者的全长互补体杂交。
在另一个方面中，该第一萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性 的多肽，该多肽包括或其组成为与SEQ ID NO:6具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列。在另一个方面中，该第一萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:6。
在另一个方面中，该第一萜烯环化酶基因包括一种多核苷酸，该多核苷酸包括或其组成为与SEQ ID NO:5或其基因组DNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列。在另一个方面中，该第一萜烯环化酶基因包括一种多核苷酸，该多核苷酸包括或其组成为SEQ ID NO:5。
在另一个方面中，该第一萜烯环化酶基因包括一种多核苷酸，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与SEQ ID NO:5或其基因组DNA序列；或与前两者的全长互补体杂交。
在另一个方面中，该第二萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为与SEQ ID NO:8具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、 至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列。在另一个方面中，该第二萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:8。
在另一个方面中，该第二萜烯环化酶基因包括一种多核苷酸，该多核苷酸包括或其组成为与SEQ ID NO:7或其基因组DNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列。在另一个方面中，该第二萜烯环化酶基因包括一种多核苷酸，该多核苷酸包括或其组成为SEQ ID NO:7。
在另一个方面中，该第二萜烯环化酶基因包括一种多核苷酸，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与SEQ ID NO:7或其基因组DNA序列；或与前两者的全长互补体杂交。
在另一个方面中，该第三萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为与SEQ ID NO:10具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列。在另一个方面中，该第三萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:10。
在另一个方面中，该第三萜烯环化酶基因包括一种多核苷酸，该多核苷 酸包括或其组成为与SEQ ID NO:9或其基因组DNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列。在另一个方面中，该第三萜烯环化酶基因包括一种多核苷酸，该多核苷酸包括或其组成为SEQ ID NO:9。
在另一个方面中，该第三萜烯环化酶基因包括一种多核苷酸，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与SEQ ID NO:9或其基因组DNA序列；或与前两者的全长互补体杂交。
在此披露的核苷酸序列或其子序列以及其氨基酸序列或其片段可以用来设计核酸探针，以便根据本领域熟知的方法从不同属或物种的菌株中鉴定并克隆上述基因的同源DNA。具体地说，此类探针可以用于按照标准DNA印迹程序与感兴趣的属或种的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定并分离其中的相应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少14，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。
因此，可以针对与上述的探针杂交的DNA来筛选由此类其他生物制备的基因组DNA或cDNA文库。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分 离技术分离其他生物的基因组或其他DNA。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与在此披露的核苷酸序列或其子序列同源的克隆或DNA，在DNA印迹法中使用载体材料。出于本发明的目的，杂交表明该核苷酸序列在非常低到非常高严格条件下与一种被标记的核酸探针杂交，该探针对应于在此披露的核苷酸序列、其互补链、或其子序列。使用X射线胶片检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针而言，严格条件被定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡(McCarthy)(1962，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48:1390)的计算法所计算的T_m之下大约5℃至大约10℃，在每毫升0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X登哈特(Denhardt)溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA中预杂交和杂交12至24小时。最后，将载体材料在所计算的T_m之下5℃至10℃，在6X SCC加0.1％SDS中洗涤1次(持续15分钟)并且使用6X SSC洗涤2次(每次15分钟)。
可以使用来自其他微生物来源的与在此描述的基因同源或互补的核苷酸序列来修饰所选的木霉属菌株中的对应基因。
在另一个方面中，木霉属突变体菌株中的基因修饰未用选择性标记加以标记。可以通过将突变体在反向选择培养基中进行培养来除去选择性标记基因。在该选择性标记基因包含侧翼于其5'和3'端的重复序列的情况下，当该突变体菌株经受反向选择时，这些重复序列将有助于该选择性标记基因通过同源重组而环出。还可以通过向该突变体菌株中引入一个核酸片段，该核酸片段包括缺陷基因的5'和3'区但是缺乏该选择性标记基因，随后在一种反向 选择培养基上进行选择，通过同源重组来除去该选择性标记基因。通过同源重组，包含该选择性标记基因的缺陷基因被缺乏该选择性标记基因的核酸片段替换。还可以使用本领域已知的其他方法。
应理解的是，本发明的这些方法并不限于获得木霉属突变体菌株的特定顺序。可以在构建用于产生感兴趣的多肽的菌株中的任何步骤向亲本菌株中引入基因的修饰。优选的是该木霉属突变体菌株在此类构建之前已经被制成哌珀霉素、副胞菌素和/或萜烯缺陷的。
在本发明的一个另外的方面中，木霉属菌株的突变体可以含有其他基因的另外的修饰，例如缺失或破坏，这些其他基因可以编码有害于感兴趣的多肽的产生、回收或应用的物质。
在一个方面，该木霉属菌株进一步包括一种或多种(例如若干种)编码选自下组的蛋白水解活性的基因的修饰，例如破坏或缺失，该组由以下各项组成：氨肽酶、二肽基氨肽酶、三肽基氨肽酶、羧肽酶、金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和液泡蛋白酶。
在一个优选的方面中，该木霉属菌株进一步包括一种或多种(例如若干种)选自下组的基因的修饰，例如破坏或缺失，该组由以下各项组成：第一枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、第一天冬氨酸蛋白酶基因、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、第二枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、以及第二天冬氨酸蛋白酶基因，如在WO 2011/075677中所述，将该文献通过引用以其全文结合在此。
在另一个方面中，该木霉属菌株进一步包括编码选自下组的酶的一种或多种(例如若干种)另外的基因的修饰，例如破坏或缺失，该组由以下各项组成：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。
在另一个方面中，该木霉属菌株进一步包括编码选自下组的酶的一种或 多种(例如若干种)另外的基因的修饰，例如破坏或缺失，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、氨肽酶、α-淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、纤维素诱导蛋白、壳多糖酶、香豆酸酯酶、环糊精糖基转移酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、棒曲霉素、阿魏酸酯酶、AA9(GH61)多肽、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、葡糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡萄糖醛酸酯酶、卤素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、膨胀蛋白、α-1,6-转葡糖苷酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
在另一个方面中，该木霉属菌株进一步包括编码选自下组的酶的一种或多种(例如若干种)另外的基因的修饰，例如破坏或缺失，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维素二糖水解酶和β-葡糖苷酶，
在本发明的方法中，木霉属突变体菌株优选产生与在相同产生条件下培养的相应的亲本木霉属菌株至少相同量的感兴趣的异源多肽。在另一个方面中，该突变体菌株比在相同产生条件下培养的相应的亲本木霉属菌株产生多至少5％、例如多至少10％、多至少25％、多至少50％、多至少75％以及多至少100％的异源多肽。
将这些木霉属突变体菌株在营养培养基中使用本领域已知方法培养，用于产生感兴趣的异源多肽。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养 菌株。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。该分泌的多肽可以直接从培养基中回收。如果该多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中获得。包括感兴趣的异源多肽的全发酵液还可以被回收。
可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该感兴趣的多肽。这些检测方法可以包括使用特异性抗体、高效液相层析、毛细管层析、酶产物的形成、酶底物的消失或SDS-PAGE。例如，可以使用酶测定来确定酶的活性。对于许多酶，用于确定酶活性的程序在本领域是已知的(参见例如，D.朔姆堡(Schomburg)和M.扎尔茨曼(Salzmann)(编辑)，《酶手册》(Enzyme Handbook)，施普林格出版社(Springer-Verlag)，纽约，1990)。
可以通过本领域已知的方法来分离该所得的多肽。例如，可以通过常规程序，包括但不限于离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从培养基中分离感兴趣的多肽。然后，可以通过本领域已知的多种程序进一步纯化分离的多肽，这些程序包括但不限于层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水层析、聚焦层析和大小排阻层析)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦(IEF))、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、或萃取(参见，例如，《蛋白纯化》(Protein Purification)，编者J.-C.詹森(Janson)和拉尔斯赖登(Lars Ryden)，VCH出版社，纽约，1989)。
感兴趣的多肽可以是任何对于木霉属菌株是外源的多肽。该多肽可以由单个基因或两个或更多个基因编码。术语“编码多肽的多核苷酸”应理解为涵盖涉及多肽产生中涉及的一种或多种(例如若干种)基因。术语“异源多肽”在此定义为对于宿主菌株并非天然的多肽；其中已经进行了结构修饰以 改变天然多肽(例如天然多肽的蛋白序列)的天然多肽；或由于通过重组DNA技术(例如，较强的启动子、编码多肽的DNA的多拷贝)操纵多核苷酸或宿主菌株的结果其表达发生数量上变化的天然多肽。因此，本发明在术语“异源多肽”的范围内还涵盖天然多肽的此类重组产生，在这个意义上，此类表达涉及使用对于木霉属菌株并非天然的基因元件(genetic element)，或使用已经被操纵以宿主菌株中非正常发生的方式发挥功能的天然元件。
该异源多肽可以是具有感兴趣的生物学活性的任何多肽。术语“多肽”在此不意在是指特定长度的编码产物，并且因此，涵盖肽、寡肽和蛋白。术语“多肽”还包括多肽的天然发生的等位基因变异和工程化变异。术语“多肽”进一步涵盖杂合和融合的多肽。
一种杂合多肽包括部分多肽序列的组合，这些序列获得自至少两个不同的多肽，其中一个或多个(例如，若干个)序列对于木霉属菌株可以是异源的。
一种融合多肽或可切割的融合多肽包括在另一个多肽的N-末端或C-末端处融合的多肽。通过将编码一种多肽的多核苷酸融合至编码另一多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，《科学》(Science)266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，《工业微生物与 生物技术杂志》(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，《生物技术杂志》(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，《生物技术》(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，《生物技术》9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，《生物化学》(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，《生物技术》13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，《蛋白质：结构、功能以及遗传学》(Proteins:Structure，Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，《药物发现世界》(Drug Discovery World)4:35-48。
在一个方面中，该多肽是一种抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、激素、免疫调节剂(immunodilator)、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白或转录因子。
在另一个方面中，该多肽是一种氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。在另一个方面中，该多肽是一种乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、氨肽酶、α-淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、纤维素诱导蛋白、壳多糖酶、香豆酸酯酶、环糊精糖基转移酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、棒曲霉素、阿魏酸酯酶、AA9(GH61)多肽、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、葡糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡萄糖醛酸酯酶、卤素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、 肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、膨胀蛋白、α-1,6-转葡糖苷酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
在另一个方面中，该多肽是一种白蛋白、胶原、弹性蛋白原、弹性蛋白或明胶。
在另一个方面中，该多肽是一种内切葡聚糖酶。在另一个方面中，该多肽是一种纤维素二糖水解酶。在另一个方面中，该多肽是一种β-葡糖苷酶。在另一个方面中，该多肽是一种AA9(GH61)多肽。在另一个方面中，该多肽是一种木聚糖酶。在另一个方面中，该多肽是一种β-木糖苷酶。在另一个方面中，该多肽是一种乙酰木聚糖酯酶。在另一个方面中，该多肽是一种阿魏酸酯酶。在另一个方面中，该多肽是一种阿拉伯呋喃糖苷酶。在另一个方面中，该多肽是一种葡糖醛酸糖苷酶。在另一个方面中，该多肽是一种乙酰甘露聚糖酯酶。在另一个方面中，该多肽是一种阿拉伯聚糖酶。在另一个方面中，该多肽是一种香豆酸酯酶。在另一个方面中，该多肽是一种半乳糖苷酶。在另一个方面中，该多肽是一种葡萄糖醛酸酯酶。在另一个方面中，该多肽是一种甘露聚糖酶。在另一个方面中，该多肽是一种甘露糖苷酶。在另一个方面中，该多肽是一种纤维素诱导蛋白。在另一个方面中，该多肽是一种棒曲霉素。在另一个方面中，该多肽是一种膨胀蛋白。
在本发明的方法中，木霉属菌株的突变体是重组菌株，其包括编码异源多肽的多核苷酸，该突变体有利地用于多肽的重组产生。该菌株优选用包含编码异源多肽的多核苷酸的载体转化，随后将该载体整合入染色体。“转化”意指将包括多核苷酸的载体引入进宿主株中，这样使得该载体被保持为染色体整合体或保持为自主复制的染色体外载体。通常认为整合是有利的，因为多核苷酸更有可能稳定地保持在菌株中。载体整合入染色体可以通过同源重组、非同源重组或转座发生。
编码异源多肽的多核苷酸可以从任何原核、真核或其他来源例如古细菌(archaeabacteria)获得。出于本发明的目的，在此与给定来源结合使用的术语“从……中获得”应意指该多肽由该来源或由其中已经插入来自该来源的基因的菌株产生。
在本发明的方法中，本发明的突变体木霉属菌株还可以用于重组产生对于木霉属菌株是天然的多肽。该天然多肽可以通过重组方式产生，例如将编码多肽的基因置于不同启动子的控制之下以增强物质的表达，通过例如使用信号序列加速其从菌株输出，或增加编码由木霉属菌株通常产生的多肽的基因的拷贝数。
用来分离或克隆编码感兴趣的多肽的多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并且包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)实现从此类基因组DNA中克隆此类多核苷酸。参见例如，英尼斯(Innis)等人，1990，《PCR方案：方法与应用指南》(PCR Protocols:A Guide to Methods and Application)，学术出版社(Academic Press)，纽约。克隆程序可涉及将包括编码多肽的多核苷酸的所希望的核酸片段切除并分离、将片段插入载体分子、以及将重组载体并入本发明的突变体木霉属菌株，其中会复制多核苷酸的多重拷贝或克隆。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的、或其任意组合。
可以按多种方式操纵编码异源多肽的分离的多核苷酸以提供该多肽在本发明的突变体木霉属菌株中的表达。取决于表达载体，在多核苷酸序列插入进载体之前对其进行操作可以是令人希望的或必要的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术在本领域是熟知的。
可以将包括编码多肽的多核苷酸的核酸构建体可操作地连接至一个或多个(例如，若干个)控制序列，这些控制序列能够在与这些控制序列相容的 条件下，指导编码序列在本发明的突变体木霉属菌株中的表达。
控制序列可以是一个适当的启动子、一个由本发明的突变体木霉属菌株所识别的核苷酸序列，用于表达编码该多肽的该多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。启动子可以是在突变体木霉属菌株中显示出转录活性的任何核苷酸序列，包括突变体、截短和杂合启动子，并且可以获得自编码对该突变体木霉属菌株而言天然或异源(外源)的细胞外或细胞内多肽的基因。
用于在本发明的方法中指导核酸构建体转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、里氏木霉甘油醛-6磷酸脱氢酶和里氏木霉翻译延长因子，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。其他启动子描述于美国专利号6,011,147中。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在木霉属菌株中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子。
该控制序列还可以是一个前导子，一种对本发明的突变体木霉属菌株的翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。在突变体木霉属菌株中起作用的任何前导子都可以用于本发明中。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该核苷酸序列的3’末端并且当转录时由突变体木霉属菌株识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。在突变体木霉属菌株中起作用的任何多腺苷酸化序列都可以用于本发明中。
丝状真菌宿主细胞的优选的聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶。
控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通 路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包括在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列5’末端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以在本发明中使用指导表达的多肽进入突变体木霉属菌株分泌途径的任何信号肽编码序列，即被分泌进培养基中。
用于突变体木霉属菌株的有效信号肽编码区是从以下项的基因获得的信号肽编码区：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
该控制序列还可以是编码位于多肽的N端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。可以从酿酒酵母α-因子、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)的漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码区。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N末端。
还可能希望地是添加调控序列，这些调控序列相对于突变体木霉属菌株的生长来调节多肽的表达。调控序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。可以使用丝状真菌中的调节系统，如黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶 启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子、以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
在本发明的方法中，包括编码感兴趣的多肽的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号的重组表达载体可用于重组产生感兴趣的多肽。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
该重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起该核苷酸序列表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与该载体有待引入其中的突变体木霉属菌株的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以 是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph、以及pyrG基因。
选择性标记可以是在W0 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
用于整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸的序列或该载体中通过同源或非同源重组而整合到该基因组中的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至 10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，《基因》(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO 00/24883披露的方法完成。
可以向宿主细胞中插入多于一个拷贝的多核苷酸，以增加多肽的产量。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员所熟知的(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，《分子克隆：实验手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。
包括该核苷酸序列的载体可以通过例如转化引入该突变体木霉属菌株中，这样使得该载体被维持为染色体整合物或被维持为自主复制的染色体外 载体。通常认为整合是有利的，因为核苷酸序列更有可能稳定地保持在菌株中。通过同源重组、非同源重组或转座将载体整合入染色体中。
将表达载体引入突变体木霉属菌株中可能涉及由原生质体形成、原生质体转化和菌株细胞壁再生组成的以本身已知的方式进行的程序。用于转化木霉属菌株的合适程序描述在马拉迪尔(Malardier)等人，1989，《基因》(Gene)78:147-156以及WO 96/00787中。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
菌株
里氏木霉菌株981-O-8(D4)是里氏木霉RutC30(蒙特尼考特(Montenecourt)和伊夫利(Eveleigh)，1979，《化学进展丛书》(Adv.Chem.Ser.)181:289-301的一种诱变菌株。里氏木霉菌株AgJg115-104-7B1是里氏木霉RutC30的ku70破坏的菌株。
培养基和溶液
覆盖PDA培养基由以下各项构成：39g的马铃薯右旋糖琼脂(Difco)和补足至1升的去离子水，每ml补充有100μg的潮霉素B。
PDA板由以下各项构成：39g的马铃薯右旋糖琼脂(Difco)和补足至1升的去离子水。
PEG缓冲液由以下各项构成：500g的PEG 4000、10mM CaCl₂、10mM Tris-HCl pH 7.5，以及补足至1升的去离子水；过滤除菌。
SOC培养基由以下各项构成：20g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、0.5g的NaCl、10ml的20mM KCl、以及补足至1升的去离子水。
STC由以下各项构成：0.8M或1M山梨醇、10mM或25mM CaCl₂、以及10mM或25mM Tris-HCl，pH 7.5或pH 8；过滤除菌。
TAE缓冲液由以下各项构成：4.82g的Tris碱、1.14ml的冰醋酸、2ml的0.5M EDTA(pH 8.0)、以及补足至1升的去离子水。
TBE缓冲液由以下各项构成：10.8g的Tris碱、5.5ml的硼酸、4ml的0.5M EDTA(pH 8.0)、以及补足至1升的去离子水。
TE缓冲液由以下各项构成：10mM Tris-0.1mM EDTA(pH 8.0)。
2XYT加氨比西林平板由以下各项构成：16g的胰蛋白胨、10g的酵母提取物、5g的NaCl、15g的细菌琼脂(Bacto agar)、1ml的100mg/ml氨比西林母液、以及补足至1升的去离子水。
YEG培养基由以下各项构成：5g的酵母提取物、20g的葡萄糖、以及补足至1升的去离子水。
YP培养基由以下各项构成：10g的酵母提取物、20g的细菌蛋白胨、以及补足至1升的去离子水。
实例1：里氏木霉菌株981-O-8基因组DNA提取
将里氏木霉菌株981-O-8在带挡板的摇瓶中的50ml的YEG培养基中在28℃下伴随着以200rpm的搅拌生长2天。通过使用(卡尔生化公司(Calbiochem)，拉荷亚，加州，美国)过滤获得的菌丝体，用去离子水中洗涤两次，并在液氮中冷冻。将冷冻的菌丝体通过研钵及研杵磨成细粉，并使用Plant Maxi试剂盒(凯杰公司(QIAGEN Inc.)，巴伦西亚，加州，美国)来分离总DNA。
实例2：里氏木霉原生质体产生与转化
使用由宾替拉(Penttila)等人，1987，《基因》(Gene)61:155-164所描述的的方案的修改来进行原生质体制备与转化。简而言之，将里氏木霉菌 株AgJg115-104-7B1在25ml的补充有2％(w/v)葡萄糖的YP培养基中在28℃下、伴随着以90rpm进行的温和搅拌培养17小时。将菌丝体通过使用密理博真空驱动一次性过滤系统(密理博公司(Millipore)，贝德福德，马萨诸塞州，美国)过滤来收集，并用去离子水洗涤两次，并用1.2M山梨醇洗涤两次。通过在30ml的每ml含有15mg的200 G(诺维信公司，鲍斯韦，丹麦(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark))和每ml含有0.36单位的壳多糖酶(西格玛化学有限公司，圣路易斯，密苏里州，美国(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA))的1.2M山梨醇中在34℃下伴随着以90rpm的进行的温和震荡来悬浮经洗涤的菌丝体，持续15-25分钟，从而产生原生质体。将原生质体通过在400x g下离心7分钟来收集，并用冷的1.2M山梨醇中洗涤两次。将原生质体使用血球计数器来计数，并重悬于STC中至终浓度为1x 10⁸个原生质体/ml。将过量的原生质体在-80℃下储存于Cryo 1℃冷冻容器(耐洁公司(Nalgene)，罗契斯特，纽约，美国)中。
将大约各2μg的在以下实例中所描述的缺失盒用Pme I消化。将每个消化反应物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳使用TBE缓冲液来纯化，其中将DNA条带从凝胶切出，并使用凝胶和PCR净化试剂盒(马歇雷-格尔公司(Macherey-Nagel GmbH&Co.KG)，迪伦(Düren)，德国)来提取。将所得的经纯化的DNA添加至100μl的原生质体溶液中并轻轻混合。添加PEG缓冲液(250μl)并混合，并且然后将该混合物在34℃下孵育30分钟。然后添加STC(3ml)并混合，并且将该混合物涂布在补充有1M蔗糖的PDA板上。在28℃下孵育16小时后，将15ml的、每ml补充有100μg的潮霉素B的覆层PDA培养基添加至各平板。将这些板在28℃下孵育4-6天。
实例3：哌珀霉素合成酶基因缺失载体的构建
将里氏木霉菌株981-O-8哌珀霉素合成酶基因(Trirre2:123786；针对基因组DNA序列的SEQ ID NO:1，以及针对氨基酸序列的SEQ ID NO:2)的5’侧翼序列使用以下所示的基因特异性正向和反向引物从里氏木霉菌株981-O-8的基因组DNA来扩增。
正向引物(1201181)：
5’-ggcgcgccGACCCGAAAGAACGCAAAAGTCCAT-3’(SEQ ID NO:11)
反向引物(1201182)：
5’-GTGTCAAGAACTTGGATCTCCTAGGAG-3’(SEQ ID NO:12)
下划线部分是引入用于克隆的Asc I位点，并且斜体区域代表对应于用于克隆所必须的载体插入的位点的同源区域的引入的延伸。
该扩增反应由以下各项构成：137ng的里氏木霉981-O-8基因组DNA，200μm dNTP，0.4μM引物，3％DMSO，含有1.5mM MgCl₂的5XHF缓冲液(纽英伦生物技术有限公司(New England Biolabs,Inc.)，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)，以及2单位的热启动高保真DNA聚合酶(纽英伦生物技术有限公司，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)，最终体积为50μl。将该扩增反应在(安捷伦科技，圣克拉拉(Santa Clara)，加州，美国)中进行，其被编程为：1个循环，在98℃持续3分钟；35个循环，每个在98℃持续10秒，55℃持续30秒，和72℃持续1.5分钟；和1个循环，在72℃持续10分钟。将PCR产物通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳使用TBE缓冲液来分离，其中观察到2.4kb产物。将2.4kb PCR产物从凝胶切离，并使用凝胶提取试剂盒(凯杰公司(QIAGEN Inc.)，巴伦西亚，加州，美国)根据制造商的方案进 行纯化。
将2.4kb PCR产物使用HDPCR克隆试剂盒(科隆达公司，帕洛阿尔托，加州，美国(Clontech,Palo Alto,CA,USA))根据制造商的方案插入至Asc I-消化的pJfyS1579-41-ll(WO 2011/075677)。该反应由以下各项构成：在10μl反应体积中100ng的pJfyS1579-41-11，60ng的PCR产物，和2μl的HD酶预混合物(科隆达公司，帕洛阿尔托，加州，美国)。将该反应在50℃下孵育15分钟。使用2.5μl来转化Gold超感受态(安捷伦公司，圣克拉拉市，加州，美国)细胞。将DNA添加至这些细胞并且在冰上孵育30分钟，随后在42℃下热休克30秒。然后添加SOC培养基(250μl)并且在37℃下孵育1小时。将该反应涂布在2XYT加氨比西林平板上并且在37℃下孵育过夜。将质粒DNA使用9600(凯杰公司，巴伦西亚，加州，美国)从若干转化体中纯化并且通过DNA测序使用3130XL遗传分析仪(生命技术公司(Life Technologies)，卡尔巴斯德，加州，美国)分析，以鉴定含有所希望的插入物的质粒。鉴定出含有插入物的一个克隆并命名为质粒pJyHi002A。使用质粒pJyHi002A来插入哌珀霉素合成酶基因的3’侧翼。
将3’哌珀霉素合成酶基因侧翼序列从里氏木霉981-O-8基因组DNA使用热启动高保真DNA聚合酶(纽英伦生物技术有限公司，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)和以下所示的基因-特异性正向和反向引物扩增。
正向引物(1201183)：
5’-cctgcaggTCCTCATCTGTGGCTCATATTAGGT-3’(SEQ ID NO:13)
反向引物(1201524)：
5’-cctgcagggtttaaacCAAGGCGGGATAGTGTCGGTTCTT-3’ (SEQ ID NO:14)
该下划线部分是用于克隆的Sbf I位点，斜体区域代表对应于用于克隆所必须的载体插入的位点的同源区域的引入的延伸，并且粗体部分为用于之后去除质粒的细菌繁殖部分的引入的Pme I位点。
该扩增反应由以下各项构成：137ng的里氏木霉981-O-8基因组DNA，200μm dNTP，0.4μM引物，3％DMSO，含有1.5mM MgCl₂的5XHF缓冲液，以及2单位的热启动高保真DNA聚合酶，最终体积为50μl。将该扩增反应在中进行，其被编程为：1个循环，在98℃持续3分钟；35个循环，每个在98℃持续10秒，55℃持续30秒，和72℃持续1分钟；和1个循环，在72℃持续10分钟。将PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳使用TBE缓冲液分离，其中将2.0kb片段从凝胶中切离，并使用提取II试剂盒(科隆达公司，帕洛阿尔托，加州，美国)根据制造商的方案提取琼脂糖。
使用HDPCR克隆试剂盒根据制造商的方案将2.0kb PCR产物插入Sbf I-消化的pJyHi002A中。该反应由以下各项构成：在10μl反应体积中100ng的pJyHi002A，50ng的2.0kb PCR产物，和2μl的酶(科隆达公司，帕洛阿尔托，加州，美国)。将该反应在50℃下孵育15分钟。向该反应中添加40μl的TE缓冲液，并根据制造商的方案将2.5μl用于转化Gold超感受态细胞。将DNA添加至这些细胞并且在冰上孵育30分钟，随后在42℃下热休克30秒。然后添加SOC培养基(250μl)并且在37℃下孵育1小时。将该反应涂布在2XYT加氨比西林平板上并且在37℃下孵育过夜。使用9600从若干转化体中纯化质粒DNA，并使用3130XL遗传分析仪通过DNA测序进行分析，以鉴定含有所希望的插入物的质粒。鉴定出含有插入物的一个克隆并命 名为质粒pJyHi002(图1)。使用质粒pJyHi002来缺失哌珀霉素合成酶基因。
实例4：哌珀霉素合成酶基因缺失的里氏木霉菌株的生成
将里氏木霉菌株AgJg115-104-7B1如在实例2中所描述的使用质粒pJyHi002进行转化。使用无菌接种环将转化体从补充有1M蔗糖的PDA板转移至新的PDA板，并且在28℃下生长7天。
将在哌珀霉素合成酶基因座中含有pJyHi002缺失载体(由此缺失哌珀霉素合成酶基因)的里氏木霉菌株AgJg115-104-7B1转化体通过真菌孢子PCR使用Plant Direct PCR试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)和以下所示的引物进行筛选。
正向引物(1202690)：
5’-TGCCCCACGATATCTCTCCTTCTCC-3’(SEQ ID NO:15)
反向引物(067947)：
5’-CTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGA-3’(SEQ ID NO:16)
将来自若干转化体的孢子使用1μl环来收集并且转移到由试剂盒提供的15μl的稀释缓冲液中。将这些孢子样品在室温下孵育3分钟并且在2000x g下离心一分钟。将一微升的各孢子样品用作模板。该反应由以下各项构成：1μl的孢子悬浮液，10μl的2XPlant PCR缓冲液(赛默科技公司(Thermo Scientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)，0.5μM引物1202690，0.5μM引物067947，0.4μl的热启动DNA聚合酶(赛默科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)，和8.2μl的水。将该反应在(艾本德股份公司(Eppendorf AG)，汉堡，德国)中进行，编程为：1个循环，在95℃下持续10分钟；35个循环，每个循环在95℃下持续30秒、55℃下持续30秒、以及72℃下持续5 分钟45秒；1个循环，在72℃下持续15分钟；并且4℃保持。因为引物1202690位于5’侧翼区的上游并且引物067947位于hpt标记中，仅仅在正确基因座中具有缺失盒的转化体将会产生一种PCR产物。将PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳使用TBE缓冲液来分离，其中观察到一个3.7kb片段，表明该缺失盒是在正确的基因座中。
然后通过DNA印迹分析根据以下程序来分析这些转化体。将来自每个转化体的基因组DNA使用MASTERPURE^TM酵母DNA纯化试剂盒(中心公司(Epicentre)，麦迪逊，威斯康星州，美国)来提取。将每个转化体在摇瓶中的25ml的补充有2％葡萄糖的YP培养基中伴随着以200rpm进行的搅拌进行培养。将菌丝体通过使用沃特曼(Whatman)1滤纸(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国)从培养物中收集。将滤纸插入在置于侧臂(sidearm)烧瓶中的陶瓷漏斗中。在真空下，将培养液过滤并且用水清洗并且再次过滤。将菌丝体转移至2ml管中并且然后使用浓缩器(赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)干燥过夜。将每个管中的经干燥的菌丝体用金属工具压碎，并且将大约50μl的经干燥的菌丝体转移至新管中。将300微升的酵母细胞裂解溶液(中心公司，麦迪逊，威斯康星州，美国)添加至每个管中并且涡旋。将这些样品在65℃下孵育20分钟，并且然后置于冰上5分钟。将150微升的MPC蛋白沉淀剂(中心公司，麦迪逊，威斯康星州，美国)添加至每个管中，并且然后将这些反应涡旋。将这些管以9300x g离心10分钟。将上清液转移至微量离心管中，随后转移至0.5ml的异丙醇中，并且然后将这些管以9300x g离心10分钟。将上清液丢弃，并且将每个球粒用0.5ml的70％乙醇洗涤。将乙醇去除并且丢弃，并且将这些球粒使用浓缩器短暂地干燥。然后将球粒重悬在60μl的TE缓冲液中。将这些样品在65℃下孵育大约一小时， 以溶解该球粒并且然后添加0.3μl的100mg/ml RNA酶A(凯杰公司(QIAGEN Inc.)，巴伦西亚，加州，美国)，并且将这些样品在37℃下孵育一小时。
将大约两微克的每个基因组DNA样品用30单位的Bcl I和10单位的Swa I消化16小时。使用TAE缓冲液使这些消化物经受0.8％琼脂糖凝胶电泳，并且使用(施莱歇&许尔生物科技公司(Schleicher&Schuell BioScience)，基恩(Keene)，新罕布什尔州，美国)遵循制造商的建议在超负荷印迹膜(Supercharge blotting membrane)(施莱歇&许尔生物科技公司，基恩，新罕布什尔州，美国)上印迹持续大约12-16小时。根据制造商的方案通过使用PCR DIG探针合成试剂盒(罗氏分子生物化学公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)和以下正向和反向引物通过PCR掺入异羟基洋地黄毒苷-11-dUTP，合成一种与哌珀霉素合成酶基因的5’侧翼序列杂交的PCR探针：
正向引物(1201259)：
5’-TAGCTAGCTGTCTTGGATGAATCGAGGTTG-3’(SEQ ID NO:17)
反向引物(1202008)：
5'-TCGTCTTCATGAGCATGTTGTTGGG-3’(SEQ ID NO:18)
该扩增反应(50μl)由以下各项构成：200μm dNTP，0.5μM引物，3％DMSO，含有1.5mM MgCl₂的5XHF缓冲液，以及2单位的热启动高保真DNA聚合酶，最终体积为50μl。将该扩增反应在中进行，其被编程为：1个循环，在98℃持续3分钟；35个循环，每个在98℃持续10秒，55℃持续15秒，和72℃持续1.5分钟；和1个循环，在72℃持续10分钟。将PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳使用TBE缓冲液分离，其中将0.5kb片段从凝胶中切离，并使用 凝胶提取试剂盒根据制造商的方案提取琼脂糖。使用PCR DIG探针合成试剂盒将纯化的片段用作模板，用于使用异羟基洋地黄毒苷进行标记。该反应由以下各项组成：5μl的含有MgCl₂的PCR缓冲液(罗氏公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)、5μl的含有200μM dNTP的PCR DIG探针合成混合物(罗氏分子生物化学公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)、1μM正向引物1201259、1μM反向引物1202008、2.6单位的酶混合物、高保真(罗氏公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)、和100pg的模板DNA，直到50μl的体积。将该扩增反应在中进行，其被编程为：1个循环，在95℃持续2分钟；30个循环，每个在95℃持续30秒，60℃持续30秒，和72℃持续40秒；和1个循环，在72℃持续10分钟。
异羟洋地黄毒苷的掺入通过标记探针的分子量移位来证实，该标记探针以大约0.5kb跑动。杂交在DIG Easy Hyb缓冲液(罗氏分子生物化学公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)中在42℃下进行15-17小时。然后将该膜用2X SSC加上0.1％SDS在室温下洗涤5分钟，随后在65℃下用0.5X SSC加上0.1％SDS洗涤两次，每次各15分钟。通过化学发光分析(罗氏分子生物化学公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)遵循制造商说明书来检测探针-靶杂交
DNA印迹分析表明转化体中的若干个具有处于单拷贝的缺失盒。含有哌珀霉素合成酶基因缺失的一个转化体被命名为里氏木霉JyHi002-26A。
实例5：副胞菌素合成酶基因缺失载体的构建
将里氏木霉菌株981-O-8副胞菌素合成酶基因(Trirre2:23171；针对基因组DNA序列的SEQ ID NO:3以及针对氨基酸序列的SEQ ID NO:4)的5’侧翼序列使用以下所示的基因特异性正向和反向引物从里氏木霉菌株981-O-8 的基因组DNA来扩增。
正向引物(1201177)：
5’-ggcgcgccTACTACCTAGTACAGTGCTTATTTA-3’(SEQ ID NO:19)
反向引物(1201178)：
5’-GTTTTTTCTCCAAATTTGTACAGAATTATCT-3’(SEQ ID NO:20)
下划线部分是引入用于克隆的Asc I位点，并且斜体区域代表对应于用于克隆所必须的载体插入的位点的同源区域的引入的延伸。
该扩增反应由以下各项构成：137ng的里氏木霉981-O-8基因组DNA，200μm dNTP，0.4μM引物，3％DMSO，含有1.5mM MgCl₂的5XHF缓冲液，以及2单位的热启动高保真DNA聚合酶，最终体积为50μl。将该扩增反应在中进行，其被编程为：1个循环，在98℃持续3分钟；35个循环，每个在98℃持续10秒，55℃持续30秒，和72℃持续1分钟；和1个循环，在72℃持续10分钟。将PCR产物通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳使用TBE缓冲液来分离，其中观察到2.0kb PCR产物。将2.0kb PCR产物从凝胶切离，并使用凝胶提取试剂盒根据制造商的方案进行纯化。
将2.0kb PCR产物使用HDPCR克隆试剂盒根据制造商的方案插入至Asc I-消化的pJfyS1579-41-11(WO 2011/075677)。该反应由以下各项构成：在10μl反应体积中200ng的pJfyS1579-41-11，100ng的PCR产物，和2μl的HD酶预混合物。将该反应在50℃下孵育15分钟。使用2.5μl来转化Gold超感受态细胞。将DNA添加至这些细胞并且在冰上孵育30分钟，随后在 42℃下热休克30秒。然后添加SOC培养基(250μl)并且在37℃下孵育1小时。将该反应涂布在2XYT加氨比西林平板上并且在37℃下孵育过夜。使用9600从若干转化体中纯化质粒DNA，并使用3130XL遗传分析仪通过DNA测序进行分析，以鉴定含有所希望的插入物的质粒。鉴定出含有插入物的一个克隆并命名为质粒pJyHi001A。使用质粒pJyHi001A来插入副胞菌素合成酶基因的3’侧翼。
将3’副胞菌素合成酶基因侧翼序列从里氏木霉981-O-8基因组DNA使用热启动高保真DNA聚合酶和以下所示的基因-特异性正向和反向引物扩增。
正向引物(1201179)：
5’-cctgcaggAGGAATTGTGCCTGGCTGTTGAGTT-3’(SEQ ID NO:21)
反向引物(1201523)：
5’-cctgcagggtttaaacGCTTATCGATCCGGCATATCGCTCT-3’(SEQ ID NO:22)
该下划线部分是用于克隆的Sbf I位点，斜体区域代表对应于用于克隆所必须的载体插入的位点的同源区域的引入的延伸，并且粗体部分为用于之后去除质粒的细菌繁殖部分的引入的Pme I位点。
该扩增反应由以下各项构成：137ng的里氏木霉981-O-8基因组DNA，200μm dNTP，0.4μM引物，3％DMSO，含有1.5mM MgCl₂的5XHF缓冲液，以及2单位的热启动高保真DNA聚合酶，最终体积为50μl。将该扩增反应在中进行，其被编程为：1个循环，在98℃持续3分钟；35个循环，每个在98℃持续10秒，55℃持续30秒，和72℃持续1分钟；和1个循环，在72℃持续10分钟。 将PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳使用TBE缓冲液分离，其中将2.0kb片段从凝胶中切离，并使用提取II试剂盒根据制造商的方案提取琼脂糖。
使用HDPCR克隆试剂盒根据制造商的方案将2.0kb PCR产物插入Sbf I-消化的pJyHi001A中。该反应由以下各项构成：在10μl反应体积中200ng的pJyHi001A，50ng的2.0kb PCR产物，和2μl的HD酶。将该反应在50℃下孵育15分钟。向该反应物添加40μl的TE缓冲液，并将2.5μl用于转化Gold超感受态细胞。将DNA添加至这些细胞并且在冰上孵育30分钟，随后在42℃下热休克30秒。然后添加SOC培养基(250μl)并且在37℃下孵育1小时。将该反应涂布在2XYT加氨比西林平板上并且在37℃下孵育过夜。使用9600从若干转化体中纯化质粒DNA，并使用3130XL遗传分析仪通过DNA测序进行分析，以鉴定含有所希望的插入物的质粒。鉴定出含有插入物的一个克隆并命名为质粒pJyHi001(图2)。使用质粒pJyHi001来缺失副胞菌素合成酶基因。
实例6：副胞菌素合成酶基因缺失的里氏木霉菌株的生成
将里氏木霉菌株AgJg115-104-7B1如在实例2中所描述的使用质粒pJyHi001进行转化。使用无菌接种环将转化体从补充有1M蔗糖的PDA板转移至新的PDA板，并且在28℃下生长7天。
将在副胞菌素合成酶基因座中含有pJyHi001缺失载体(由此缺失副胞菌素合成酶基因)的里氏木霉菌株AgJg115-104-7B1转化体通过真菌孢子PCR使用Plant Direct PCR试剂盒和以下所示的引物进行筛选。
正向引物(1202687)：
5’-TACCTTACAGGCCCTCCGCGAGCTA-3’(SEQ ID NO:23)
反向引物(067947)：
5’-CTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGA-3’(SEQ ID NO:24)
将来自若干转化体的孢子使用1μl环来收集并且转移到由试剂盒提供的15μl的稀释缓冲液中。将这些孢子样品在室温下孵育3分钟并且在2000x g下离心一分钟。将一微升的各孢子样品用作模板。该反应物由以下各项构成：1μl的孢子悬浮液，10μl的2XPlant PCR缓冲液，0.5μM引物1202687，0.5μM引物067947，0.4μl的热启动DNA聚合酶，和8.2μl的水。将该反应在中进行，编程为：1个循环，在98℃下持续5分钟；40个循环，每个循环在98℃下持续5秒、和72℃下持续1分钟30秒；1个循环，在72℃下持续1分钟；并且4℃保持。因为引物1202687位于5’侧翼区的上游并且引物067947位于hpt标记中，仅仅在正确基因座中具有缺失盒的转化体将会产生一种PCR产物。将PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳使用TBE缓冲液来分离，其中观察到一个3.2kb片段，表明该缺失盒是在正确的基因座中。
然后通过DNA印迹分析根据以下程序来分析这些转化体。将来自每个转化体的基因组DNA使用MASTERPURE^TM酵母DNA纯化试剂盒来提取。将每个转化体在摇瓶中的25ml的补充有2％葡萄糖的YP培养基中伴随着以200rpm进行的搅拌进行培养。将菌丝体通过使用沃特曼(Whatman)1滤纸过滤从培养物中收集。将滤纸插入在置于侧臂(sidearm)烧瓶中的陶瓷漏斗中。在真空下，将培养液过滤并且用水清洗并且再次过滤。将菌丝体转移至2ml管中并且然后使用浓缩器干燥过夜。将每个管中的经干燥的菌丝体用金属工具压碎，并且将大约50μl的经干燥的菌丝体转移至新管中。将300微升的酵母细胞裂解溶液添加至每个管中并且涡旋。将这些样品在65℃下孵育20分钟，并且然后置于冰上5分钟。将150微升的MPC蛋白沉 淀剂添加至每个管中，并且然后将这些反应涡旋。将这些管以9300x g离心10分钟。将上清液转移至微量离心管中，随后转移至0.5ml的异丙醇中，并且然后将这些管以9300x g离心10分钟。将上清液丢弃，并且将每个球粒用0.5ml的70％乙醇洗涤。将乙醇去除并且丢弃，并且将这些球粒使用浓缩器短暂地干燥。然后将球粒重悬在60μl的TE缓冲液中。将这些样品在65℃下孵育大约一小时，以溶解该球粒并且然后添加0.3μl的100mg/ml RNA酶A，并且将这些样品在37℃下孵育一小时。
将大约两微克的每个基因组DNA样品用20单位的BsiW I消化6小时。使用TAE缓冲液使这些消化物经受0.8％琼脂糖凝胶电泳，并且使用遵循制造商的建议在超负荷印迹膜上印迹持续大约12-16小时。根据制造商的方案通过使用PCR DIG探针合成试剂盒和以下正向和反向引物通过PCR掺入异羟基洋地黄毒苷-11-dUTP，合成一种与副胞菌素合成酶基因的5’侧翼序列杂交的PCR探针：
正向引物(1201253)：
5’-ATGTTGGAGCCTTGCCTCCAGAGTCCTCAC-3’(SEQ ID NO:25)
反向引物(1202005)：
5'-GGGTTCAGTCCAGAAGCAGAACCAGGATCA-3’(SEQ ID NO:26)
该扩增反应(50μl)由以下各项构成：200μm dNTP，0.5μM引物，3％DMSO，含有1.5mM MgCl₂的5XHF缓冲液，以及2单位的热启动高保真DNA聚合酶，最终体积为50μl。将该扩增反应在中进行，其被编程为：1个循环，在98℃持续1分钟；35个循环，每个在98℃持续10秒，55℃持续30秒，和72℃持续15秒；和1个循环，在72℃持续10分钟。将PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳使用TBE缓冲液分离，其中将0.5kb片段从凝胶中切离，并使用凝 胶提取试剂盒提取琼脂糖。使用PCR DIG探针合成试剂盒将纯化的片段用作模板，用于使用异羟基洋地黄毒苷进行标记。该反应由以下各项组成：5μl的含有MgCl₂的PCR缓冲液、5μl的含有200μM dNTP的PCR DIG探针合成混合物、1μM正向引物1201253、1μM反向引物1202005、2.6单位的酶混合物、高保真、和100pg的模板DNA，直到50μl的体积。将该扩增反应在中进行，其被编程为：1个循环，在95℃持续2分钟；30个循环，每个在95℃持续30秒，60℃持续30秒，和72℃持续40秒；和1个循环，在72℃持续10分钟。
异羟洋地黄毒苷的掺入通过标记探针的分子量移位来证实，该标记探针以大约0.5kb跑动。杂交在DIG Easy Hyb缓冲液中在42℃下进行15-17小时。然后将该膜用2X SSC加上0.1％SDS在室温下洗涤5分钟，随后在65℃下用0.5X SSC加上0.1％SDS洗涤两次，每次各15分钟。通过化学发光分析(罗氏分子生物化学公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)遵循制造商说明书来检测探针-靶杂交。
这些转化体还使用热启动高保真DNA聚合酶和以下所示的引物通过PCR来分析。
正向引物(1202689)：
5’-CAGATGAGCCCTACATGACGCCAGC-3’(SEQ ID NO:27)
反向引物(1200592)：
5’-GGCTCCATACCGACGATATGC-3’(SEQ ID NO:28)
该扩增反应由以下各项构成：150ng的基因组DNA，200μm dNTP，0.4μM引物，3％DMSO，含有1.5mM MgCl₂的5XHF缓冲液，以及2单位的热启动高保真DNA聚合酶，最终体积为50μl。将该扩增反应在中进行，其被编程为：1个循环，在98℃持续 30秒；35个循环，每个在98℃持续10秒，70℃持续30秒，和72℃持续2分18秒；和1个循环，在72℃持续10分钟。将PCR产物通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳使用TBE缓冲液来分离，其中如果副胞菌素合成酶缺失盒被整合的话，4.6kb PCR产物是所期望的。
DNA印迹和PCR两者的分析都表明转化体中的若干个具有处于单拷贝的缺失盒。含有副胞菌素合成酶基因缺失的一个转化体被命名为里氏木霉JyHi001-4B。
通过以下编号的段落进一步说明本发明：
[1]一种亲本木霉属菌株的突变体，包括一种编码异源多肽的多核苷酸和一种或多种选自下组的基因，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、以及第三萜烯环化酶基因，其中这些基因的一个或多个是经修饰的，使得该突变株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比在一种或多种选自下组的酶的产生中有缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、第二萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。
[2]如段落1所述的突变体，其包括哌珀霉素合成酶基因的修饰。
[3]如段落1或2所述的突变体，其包括副胞菌素合成酶基因的修饰。
[4]如段落1-3中任一项所述的突变体，其包括第一萜烯环化酶基因的修饰。
[5]如段落1-4中任一项所述的突变体，其包括第二萜烯环化酶基因的修饰。
[6]如段落1-5中任一项所述的突变体，其包括第三萜烯环化酶基因的修饰。
[7]如段落1-6所述的突变体，该突变体包括哌珀霉素合成酶基因、副胞 菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。
[8]如段落1-7中任一项所述的突变体，其中该木霉属菌株选自下组，该组由以下各项组成：哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、以及绿色木霉。
[9]如段落1-8中任一项所述的突变体，其中该木霉属菌株是里氏木霉。
[10]如段落1-9中任一项所述的突变体，该突变体与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比较产生少至少25％的选自下组的酶的一种或多种，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。
[11]如段落1-10中任一项所述的突变体，该突变体与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比较在选自下组的酶的一种或多种中有完全缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。
[12]如段落1-11中任一项所述的突变体，其中该哌珀霉素合成酶基因编码一种具有选自下组的哌珀霉素合成酶活性的多肽，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件、至少中严格条件、至少中-高严格条件、至少高严格条件、或至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:1或其cDNA序列；或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；以及(c)一种多肽，该多肽由包括与 SEQ ID NO:1或其cDNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[13]如段落1-12中任一项所述的突变体，其中该哌珀霉素合成酶基因编码一种具有哌珀霉素合成酶活性多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:2。
[14]如段落1-13中任一项所述的突变体，其中该副胞菌素合成酶基因编码一种具有选自下组的副胞菌素合成酶活性的多肽，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括或其组成为与SEQ ID NO:4具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件、至少中严格条件、至少中-高严格条件、至少高严格条件、或至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:3或其cDNA序列；或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；以及(c)一种多肽，该多肽由包括或其组成为与SEQ ID NO:3或其cDNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[15]如段落1-14中任一项所述的突变体，其中该副胞菌素合成酶基因编码一种具有副胞菌素合成酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:4。
[16]如段落1-15中任一项所述的突变体，其中该第一萜烯环化酶基因编码一种具有选自下组的萜烯环化酶活性的多肽，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:6具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件、至少中严格条件、至少中-高严格条件、至少高严格条件、或至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:5或其基因组DNA序列；或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；以及(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:5或其基因组DNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[17]如段落1-16中任一项所述的突变体，其中该第一萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:6。
[18]如段落1-17中任一项所述的突变体，其中该第二萜烯环化酶基因编码一种具有选自下组的萜烯环化酶活性的多肽，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括或其组成为与SEQ ID NO:8具有至少60％，例如至少65％、至 少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件、至少中严格条件、至少中-高严格条件、至少高严格条件、或至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:7或其基因组DNA序列；或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；以及(c)一种多肽，该多肽由包括或其组成为与SEQ ID NO:7或其基因组DNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[19]如段落1-18中任一项所述的突变体，其中该第二萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:8。
[20]如段落1-19中任一项所述的突变体，其中该第三萜烯环化酶基因编码一种具有选自下组的萜烯环化酶活性的多肽，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:10具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件、至少中严格条件、至少中-高严格条件、至少高严格条件、或至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:9或其基因组DNA序列；或 与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；以及(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:9或其基因组DNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[21]如段落1-20中任一项所述的突变体，其中该第三萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:10。
[22]一种产生异源多肽的方法，该方法包括：在用于产生该异源多肽的培养基中培养亲本木霉属菌株的一种突变体，其中该突变体菌株包括一种编码异源多肽的多核苷酸和一种或多种选自下组的基因，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、以及第三萜烯环化酶基因，其中这些基因的一个或多个是经修饰的，使得该突变株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比在一种或多种选自下组的酶的产生中有缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、第二萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。
[23]如段落22所述的方法，进一步包括从培养基中回收该异源多肽。
[24]如段落22或23所述的方法，其中该突变体包括哌珀霉素合成酶基因的修饰。
[25]如段落22-24中任一项所述的方法，其中该突变体包括副胞菌素合成酶基因的修饰。
[26]如段落22-25中任一项所述的方法，其中该突变体包括第一萜烯环化 酶基因的修饰。
[27]如段落22-26中任一项所述的方法，其中该突变体包括第二萜烯环化酶基因的修饰。
[28]如段落22-27中任一项所述的方法，其中该突变体包括第三萜烯环化酶基因的修饰。
[29]如段落22-28中任一项所述的方法，其中该突变体包括哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。
[30]如段落22-29中任一项所述的方法，其中该木霉属菌株选自下组，该组由以下各项组成：哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、以及绿色木霉。
[31]如段落22-30中任一项所述的方法，其中该木霉属菌株是里氏木霉。
[32]如段落22-31中任一项所述的方法，其中该突变体菌株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比较产生少至少25％的选自下组的酶的一种或多种，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。
[33]如段落22-32中任一项所述的方法，其中该突变体菌株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比较在选自下组的酶的一种或多种中有完全缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。
[34]如段落22-33中任一项所述的方法，其中该哌珀霉素合成酶基因编码一种具有选自下组的哌珀霉素合成酶活性的多肽，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少 85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件、至少中严格条件、至少中-高严格条件、至少高严格条件、或至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:1或其cDNA序列；或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；以及(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:1或其cDNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[35]如段落22-34中任一项所述的方法，其中该哌珀霉素合成酶基因编码一种具有哌珀霉素合成酶活性多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:2。
[36]如段落22-35中任一项所述的方法，其中该副胞菌素合成酶基因编码一种具有选自下组的副胞菌素合成酶活性的多肽，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括或其组成为与SEQ ID NO:4具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件、至少中严格条件、至少中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下，与SEQ ID NO:3或其cDNA序列；或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；以及(c)一种多肽，该多肽由包括或其组成为与SEQ ID NO:3或其cDNA序列具有至少60％，例如至少65％、至 少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[37]如段落22-36中任一项所述的方法，其中该副胞菌素合成酶基因编码一种具有副胞菌素合成酶活性多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:4。
[38]如段落22-37中任一项所述的方法，其中该第一萜烯环化酶基因编码一种具有选自下组的萜烯环化酶活性的多肽，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:6具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件、至少中严格条件、至少中-高严格条件、至少高严格条件、或至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:5或其基因组DNA序列；或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；以及(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:5或其基因组DNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[39]如段落22-38中任一项所述的方法，其中该第一萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:6。
[40]如段落22-39中任一项所述的方法，其中该第二萜烯环化酶基因编码一种具有选自下组的萜烯环化酶活性的多肽，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括或其组成为与SEQ ID NO:8具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件、至少中严格条件、至少中-高严格条件、至少高严格条件、或至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:7或其基因组DNA序列；或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；以及(c)一种多肽，该多肽由包括或其组成为与SEQ ID NO:7或其基因组DNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[41]如段落22-40中任一项所述的方法，其中该第二萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:8。
[42]如段落22-41中任一项所述的方法，其中该第三萜烯环化酶基因编码一种具有选自下组的萜烯环化酶活性的多肽，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:10具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件、至少中严格条件、至少中-高严格条件、至少高严格条件、或至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:9或其基因组DNA序列；或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；以及(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:9或其基因组DNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[43]如段落22-42中任一项所述的方法，其中该第三萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:10。
[44]一种用于获得亲本木霉属菌株的一种突变体的方法，包括：修饰一种或多种选自下组的基因，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因、和第三萜烯环化酶基因；并且鉴定来自步骤(a)的突变体菌株，其中这些基因中的一种或多种是经修饰的，使得该突变体菌株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比在一种或多种选自下组的酶的产生中有缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、第二萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。
[45]如段落44所述的方法，其中该突变体包括哌珀霉素合成酶基因的修饰。
[46]如段落44或45所述的方法，其中该突变体包括副胞菌素合成酶基因的修饰。
[47]如段落44-46中任一项所述的方法，其中该突变体包括第一萜烯环化酶基因的修饰。
[48]如段落44-47中任一项所述的方法，其中该突变体包括第二萜烯环化酶基因的修饰。
[49]如段落44-48中任一项所述的方法，其中该突变体包括第三萜烯环化酶基因的修饰。
[50]如段落44-49中任一项所述的方法，其中该突变体包括哌珀霉素合成酶基因、副胞菌素合成酶基因、第一萜烯环化酶基因、第二萜烯环化酶基因和第三萜烯环化酶基因的修饰。
[51]如段落44-50中任一项所述的方法，其中该木霉属菌株选自下组，该组由以下各项组成：哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、以及绿色木霉。
[52]如段落44-51中任一项所述的方法，其中该木霉属菌株是里氏木霉。
[53]如段落44-52中任一项所述的方法，其中该突变体菌株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比较产生少至少25％的选自下组的酶的一种或多种，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。
[54]如段落44-53中任一项所述的方法，其中该突变体菌株与在相同条件下培养的亲本木霉属菌株相比较在选自下组的酶的一种或多种中有完全缺陷，该组由以下各项组成：哌珀霉素合成酶、副胞菌素合成酶、第一萜烯环化酶、以及第三萜烯环化酶。
[55]如段落44-54中任一项所述的方法，其中该哌珀霉素合成酶基因编码一种具有选自下组的哌珀霉素合成酶活性的多肽，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、 至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件、至少中严格条件、至少中-高严格条件、至少高严格条件、或至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:1或其cDNA序列；或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；以及(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:1或其cDNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[56]如段落44-55中任一项所述的方法，其中该哌珀霉素合成酶基因编码一种具有哌珀霉素合成酶活性多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:2。
[57]如段落44-56中任一项所述的方法，其中该副胞菌素合成酶基因编码一种具有选自下组的副胞菌素合成酶活性的多肽，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括或其组成为与SEQ ID NO:4具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件、至少中严格条件、至少中-高严格条件、至少高严格条件、或至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:3或其cDNA序列；或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；以及(c)一种多肽，该多 肽由包括或其组成为与SEQ ID NO:3或其cDNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[58]如段落44-57中任一项所述的方法，其中该副胞菌素合成酶基因编码一种具有副胞菌素合成酶活性多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:4。
[59]如段落44-58中任一项所述的方法，其中该第一萜烯环化酶基因编码一种具有选自下组的萜烯环化酶活性的多肽，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:6具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件、至少中严格条件、至少中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下，与SEQ ID NO:5或其基因组DNA序列；或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；以及(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:5或其基因组DNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[60]如段落44-59中任一项所述的方法，其中该第一萜烯环化酶基因编码 一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:6。
[61]如段落44-60中任一项所述的方法，其中该第二萜烯环化酶基因编码一种具有选自下组的萜烯环化酶活性的多肽，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括或其组成为与SEQ ID NO:8具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件、至少中严格条件、至少中-高严格条件、至少高严格条件、或至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:7或其基因组DNA序列；或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；以及(c)一种多肽，该多肽由包括或其组成为与SEQ ID NO:7或其基因组DNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[62]如段落44-61中任一项所述的方法，其中该第二萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:8。
[63]如段落44-62中任一项所述的方法，其中该第三萜烯环化酶基因编码一种具有选自下组的萜烯环化酶活性的多肽，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，包括与SEQ ID NO:10具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、 至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的氨基酸序列；(b)一种多肽，该多肽由在至少低严格条件、至少中严格条件、至少中-高严格条件、至少高严格条件、或至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:9或其基因组DNA序列；或与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码；以及(c)一种多肽，该多肽由包括与SEQ ID NO:9或其基因组DNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[64]如段落44-63中任一项所述的方法，其中该第三萜烯环化酶基因编码一种具有萜烯环化酶活性的多肽，该多肽包括或其组成为SEQ ID NO:10。
在此描述并且要求的本发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面意图作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。在此引用了不同的参考，其披露通过引用以其全部内部结合在此。