一种Α鼠李糖苷酶及其制备方法和应用.pdf

一种α-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；该重组酶最适反应温度高、热稳定性好，在优选条件下可高效表达目的蛋白，因此可在选择性水解芦丁、橘皮苷、柚皮苷、樱桃苷、柴胡皂苷及其它连接α-鼠李糖苷的黄酮类化合物或萜类香气前体化合物中的鼠李糖等领域中具有广泛的应用。

1.  一种α-鼠李糖苷酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.  编码权利要求1所述α-鼠李糖苷酶的核苷酸，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.  权利要求1所述α-鼠李糖苷酶的制备方法，其特征在于将SEQ ID NO.2所示的DNA片段插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化宿主菌后诱导表达，并通过后续目的蛋白的纯化而得。

4.  根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤如下：
1）、以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995基因组DNA为模板，用具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的下游引物扩增，PCR扩增得到SEQ ID NO.2所示的DNA片段；
2）、将得到的DNA片段和pET-28b分别用Nhe I和NotI进行双酶切，连接得到含有所述的α-鼠李糖苷酶的核苷酸序列的重组质粒；
3）、将步骤2）得到的重组质粒转化表达宿主菌JM109(DE3)，加入适量浓度的诱导剂IPTG于30℃下诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni²⁺亲和层析柱纯化即得。

5.  包含权利要求2所述的α-鼠李糖苷酶的DNA片段的重组质粒。

6.  权利要求1所述α-鼠李糖苷酶在选择性水解芦丁、橘皮苷、柚皮苷、樱桃苷、柴胡皂苷及其它连接α-鼠李糖苷的黄酮类化合物或萜类香气前体化合物中鼠李糖中的应用。

一种α-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种极耐热α-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用。
背景技术
α-鼠李糖苷酶(α-L-Rhamnosidase)是一种可以水解多种天然化合物糖基末端并释放鼠李糖的糖苷水解酶，包括橙皮苷、芦丁、槲皮苷、柚皮苷及一些萜烯类糖苷等天然化合物。由于α-鼠李糖苷酶广泛地催化多种底物，使得其在众多领域被广泛应用，例如转化柚皮苷、橙皮苷等使其苦味降低，从而改善果汁的口味；转化芦丁生成生物利用度更高、在抑制恶性肿瘤增殖活性、抑制HIV-1和HSV-1/2等方面生物活性更强的异槲皮素；转化人参皂苷Re、Rg2等生成稀有且活性更强的人参皂苷Rg1、Rh1等。这些使得α-鼠李糖苷酶在食品、医药领域具有广泛应用的潜力。
α-鼠李糖苷酶早在1938年即被分离鉴定，经过多年的研究目前已有3000多种不同来源的α-鼠李糖苷酶被分离鉴定、克隆表达，但是至目前为止还没有用于商业化的纯的α-鼠李糖苷酶。仅有两种分别来源于黑曲霉和青霉菌来源的菌株被用于商业化制备富含α-鼠李糖苷酶的酶制剂。我们分析了已有的研究，发现其中存在的问题与局限性，并进行了总结：(1)真菌产α-鼠李糖苷酶大多是发酵后的粗酶液，其中不仅含有α-鼠李糖苷酶还有大量的β－葡萄糖苷酶等其它糖苷水解酶，在使用过程中无法避免的产生副产物而降低目的产物得率。(2)目前报道的大部分α-鼠李糖苷酶活力较低，无法适用于规模化的生产，同时真菌发酵产酶过程中影响因素较多不利于生产调控。(3)目前绝大部分不同来源的α-鼠李糖苷酶普遍为中温酶，反应温度不高，当需要提高催化体系温度转化一些溶解度不高的原料时，大部分酶无法在高温条件下保持较高的热稳定性，影响生产效率。
综合考虑上述问题，申请人认为发掘耐热α-鼠李糖苷酶基因，并通过基因工程手段得到基因重组菌，优化表达条件从而较高地表达高温型α-鼠李糖苷酶可能是有效的解决途径。
                                                                                        
发明内容
解决的技术问题：本发明针对上述局限性，提供一种改良的α-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用，并通过基因工程技术获得催化性能稳定，成分单一的新型重组α-鼠李糖苷酶TPERha，该重组酶TPERha最适反应温度高、具有较高的热稳定性，在优选条件下可高效表达目的蛋白，因此可在选择性水解芦丁、橘皮苷、柚皮苷、樱桃苷、柴胡皂苷及其它连接α-鼠李糖苷的黄酮类化合物或萜类香气前体化合物中的鼠李糖等领域中具有广泛的应用。
技术方案：一种α-鼠李糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码上述α-鼠李糖苷酶的核苷酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述α-鼠李糖苷酶的制备方法，将SEQ ID NO.2所示的DNA片段插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化宿主菌后诱导表达，并通过后续目的蛋白的纯化而得。
所述制备方法的具体步骤如下：
1）、以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995基因组DNA为模板，用具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的下游引物扩增，PCR扩增得到SEQ ID NO.2所示的DNA片段；
2）、将得到的DNA片段和pET-28b分别用Nhe I和NotI进行双酶切，连接得到含有所述的α-鼠李糖苷酶的核苷酸序列的重组质粒；
3）、将步骤2）得到的重组质粒转化表达宿主菌JM109(DE3)，加入适量浓度的诱导剂IPTG于30℃下诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni²⁺亲和层析柱纯化即得。
包含上述α-鼠李糖苷酶的DNA片段的重组质粒。
上述α-鼠李糖苷酶在选择性水解芦丁、橘皮苷、柚皮苷、樱桃苷、柴胡皂苷及其它连接α-鼠李糖苷的黄酮类化合物或萜类香气前体化合物中鼠李糖中的应用。
有益效果：(1)本发明所述的α-鼠李糖苷酶TPERha最适反应温度高，热稳定性优异；(2)本发明所述α-鼠李糖苷酶TPERha的优选制备方法可达到目的蛋白的较高表达。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例2纯化的α-鼠李糖苷酶的纯度鉴定结果图；其中泳道M为蛋白Marker(购自Thermo scientific公司，货号2661)，泳道1为纯酶蛋白；泳道2为PET-20b转化宿主菌空白对照的全细胞裂解液；泳道3为诱导表达后全细胞裂解液。
图2为实施例3本发明所述α-鼠李糖苷酶的定性测定结果（图a, b, c, d）及黑曲霉来源的α-鼠李糖苷酶最适温度及温度稳定性的测定结果图(图e, f)，其中a为本发明所述α-鼠李糖苷酶的最适反应pH的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位%；b为本发明所述α-鼠李糖苷酶的最适反应温度的测定结果图，横坐标为温度，单位摄氏度（℃），纵坐标为相对酶活力，单位%； c为本发明所述α-鼠李糖苷酶的pH稳定性的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位%； d为本发明所述α-鼠李糖苷酶的温度稳定性的测定结果图，横坐标为保温时间，单位小时（min），纵坐标为相对酶活力，单位%。e为黑曲霉来源的α-鼠李糖苷酶最适反应温度的测定结果图，横坐标为温度，单位摄氏度（℃），纵坐标为相对酶活力，单位%；f为黑曲霉来源的α-鼠李糖苷酶温度稳定性的测定结果图，横坐标为保温时间，单位小时（min），纵坐标为相对酶活力，单位%。
图3为实施例4本发明所述α-鼠李糖苷酶诱导表达结果图，其中纵坐标为相对酶活力，单位为%；横坐标为诱导条件的编号，其中1-5分别表示：1, 30℃不加IPTG; 2, 30℃加IPTG至终浓度0.01mM; 3，30℃加IPTG至终浓度0.05mM；4，30℃加IPTG至终浓度0.1mM；5，30℃加IPTG至终浓度0.5mM。
图4 为实施例5本发明所述α-鼠李糖苷酶的产酶曲线图，其中横坐标为诱导时间，单位（h）；纵坐标为α-鼠李糖苷酶活力，单位U/mL。
图5为实施例6本发明所述α-鼠李糖苷酶水解橘皮苷的HPLC图谱。图5-a是灭活的重组α-L-鼠李糖苷酶酶液处理的橘皮苷的HPLC图谱，图5-b是重组α-L-鼠李糖苷酶处理的橘皮苷的HPLC图谱。橘皮苷保留时间为4.830 min，而橘皮苷经黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶水解产物橘皮素单糖苷保留时间为5.457 min。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种新型α-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为TPERha。
本发明也提供了编码本发明所述α-鼠李糖苷酶的DNA分子片段。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的α-鼠李糖苷酶的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了可以编码所述的α-鼠李糖苷酶TPERha的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
为了制备本发明所述酶蛋白，本发明还提供了本发明所述的α-鼠李糖苷酶的制备方法
在一些实施方案中，本发明所述的α-鼠李糖苷酶的制备方法，为获得本发明所述的α-鼠李糖苷酶的DNA分子片段，将该DNA分子插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化表达宿主菌，加入诱导量浓度的诱导剂IPTG后进行诱导表达，获得目的蛋白。
本发明同时还提供了一种包含本发明所述的α-鼠李糖苷酶的DNA分子的重组质粒，所述的重组质粒为pET-TPERha。
本发明所述转化表达宿主菌为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系列和BL21、JM109系列菌株。在一个优选实施方案中，宿主细胞为JM109(DE3)菌株。
本发明所述α-鼠李糖苷酶的制备方法所述诱导表达分离纯化具体为不加IPTG于37℃下诱导培养含重组质粒的表达宿主菌，收集菌体超声波破碎，取上清亲和层析得到融合蛋白。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细阐述，其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南 第三版》。
实施例1：本发明所述α-鼠李糖苷酶基因的获得及重组质粒pET-TPERha的构建
1.1 Thermotoga petrophila DSM 13995的培养
Thermotoga petrophila DSM 13995购于DSMZ菌种保藏中心（www.dsmz.de）编号为13995，其培养基配方为：10 g/L淀粉、5 g/L胰蛋白胨、3 g/L酵母提取物、5 g/L肉浸液、10 g/L 2-马啉乙磺酸、10 mg/L 七水合硫酸铁、1 mg/L 刃天青, 调整pH为7.2。用注射器按照0.5wt.% 培养基的接种量接种，85℃静止培养24 h，收集细胞。
1.2 基因组DNA的提取
（1）静置培养Thermotoga petrophila DSM 13995 约24小时，取30 mL菌液4,000 g离心10 min收集细胞。
（2）用9.5 mL TE缓冲液重悬菌体，加入0.5 mL 10 wt.％十二烷基硫酸钠（SDS）和50 μL蛋白酶K（20 mg/mL），混合均匀，37℃保温1 h。
（3）加入1.8 mL 5 mol/L NaCl，1.5 mL 十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）/NaCl，混匀，65℃温育20 min。
（4）加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6,000 g离心10 min。
（5）为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6,000 g离心10 min。
（6）另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见。
（7）用吸管将DNA缠绕其上，在70 wt.％酒精中清洗。
（8）用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5 mL离心管中。
（9）室温下风干，加500 μL TE 缓冲液溶解。
（10）取50 μL用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。
1.3 重组质粒pET-BGL的构建
按照已知的Thermotoga petrophila DSM 13995耐高糖α-鼠李糖苷酶基因（登录号：YP_001244492.1）设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列如下：
P1: CGGCTAGCATGATACAGGCCTGTGATCTTCGCTGT，下划线表示Nde I 位点（SEQ ID NO.3）。
P2: TATAGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACA，下划线表示Not I 位点，并去除终止密码子（SEQ ID NO.4）。
以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，5 min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40 μL石蜡油密封；28次循环（ 94℃，30 s；58℃，30 s；72℃，2.9 min ）；72℃，10 min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对 PCR 扩增产物进行纯化。得到α-鼠李糖苷酶TPERha的DNA分子。
将得到的α-鼠李糖苷酶TPERha的DNA分子和pET-20b分别用Nde I和NotI进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有新型α-鼠李糖苷酶DNA分子的重组质粒pET-TPERha，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2：本发明所述α-鼠李糖苷酶的制备
将重组质粒pET-TPERha转化大肠杆菌JM109(DE3) 宿主菌（购自Novagen公司），在含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板（LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 15 g/L）上经过37℃培养过夜，挑转化子到200 mL的LB培养基中（50 μg/mL 卡那霉素）37℃，200 rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.5 mM 异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导剂，30℃培养6 h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000 rpm离心15 min，收集菌体。
由于重组质粒pET-TPERha中含有His-tag标签，通过His·Bind Purification Kit（购自Novagen公司）进行纯化，得到纯化的重组酶。具体操作过程：
A.样品的处理
（1）将洗涤过的菌体，用1×Binding Buffer 8mL重悬，超声波破壁。
（2）破壁后，13,000 g离心30 min，取上清即为样品。
B.处理柱子
（1）取1 mL填料装柱。
（2）用3mL的无菌水洗柱子。
（3）用5mL的1×Charge Buffer洗柱子。
（4）用3mL的1×Binding Buffer洗柱子。
C.上样
（1）将样品加入柱子，控制流速约每分钟6滴。
（2）用3 mL 1×Binding Buffer洗柱子，除去未结合的蛋白质。
（3）用4 mL含有20 mM咪唑的洗脱液洗柱子，除去杂蛋白。
（4）用80 mmol/L咪唑的洗脱液洗柱子，将目的蛋白洗脱下来。
（5）用4 mL 1×Strip Buffer洗柱子。
通过此过程得到纯化的α-鼠李糖苷酶，通过SDS-PAGE电泳后染色鉴定α-鼠李糖苷酶的纯度，结果如图1所示。
由图1结果可见，TPERha基因在宿主菌JM109(DE3)中表达量较高，目的蛋白通过HisTag标签纯化后，其洗脱液中α-鼠李糖苷酶TPERha纯度较高，在55kDa处有单一的条带，达到电泳纯级别。
实施例3：本发明所述α-鼠李糖苷酶的定性测定
1、酶活的测定方法
反应体系100 μL，5 μL 20 mmol/L 对硝基苯-α-L-鼠李糖苷（pNPR）中加入85 μL 100 mmol/L 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH 6.0），先在90℃孵育3 min，再加入10 μL酶液（稀释到合适的倍数）反应10 min，显色后再加入1 mol/L的碳酸钠溶液600 μL终止反应。在405 nm下测定吸光值。酶活力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟产生1 μmol p-硝基苯酚所需要的酶量为1个酶活力单位。
2、最适反应pH的测定
在不同的pH（3.5-7.5，100 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液）条件下，90℃分别测定酶活，结果如图2-a所示。
由图2-a结果可见，本发明所述α-鼠李糖苷酶的最适反应pH为4.5。
3、最适反应温度的测定
在60-100℃范围内，每隔5℃，分别测定酶活。缓冲溶液为100 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH 4.5，结果如图2-b所示。
由图2-b结果可见，本发明所述α-鼠李糖苷酶的最适反应温度为90℃。
4、pH稳定性的测定
将纯化的重组酶TPERha在不同的pH（3.5-7.5，100 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液）下70℃处理1 h，与不保温酶的酶相比，结果如图2-c所示。
由图2-c结果可见，本发明所述α-鼠李糖苷酶在pH3.5-7.5条件下75℃保温1h后仍能具有80%以上的残余酶活力。
5、温度稳定性的测定
在pH 6.0下，使酶在70℃，80℃，90℃温度下分别保温不同的时间（0，10，30，60，90，120 min），再测定相对酶活，以未保温（4℃保存）的酶活性为100%，结果如图2-d所示：菱形表示70℃；正方形表示80℃；三角形表示90℃。
由图2-d结果可见，本发明所述α-鼠李糖苷酶在70℃下保温2h残余酶活力高于85%。
6、与黑曲霉来源的α-鼠李糖苷酶最适温度及温度稳定性比较
黑曲霉来源的重组α-L-鼠李糖苷酶的最适温度：分别研究了20℃到45℃条件下的相对酶活。结果如图2-e所示：黑曲霉来源的重组α-L-鼠李糖苷酶的最适温度为35℃。该酶在30℃到35℃的范围之间相对酶活均在50%以上，但当温度高于40℃时酶的活力就急剧下降。
将黑曲霉来源的重组α-L-鼠李糖苷酶在30℃、40℃的温度下孵育不同的时间后，测定该酶的剩余的酶活力。结果如图2-f所示：黑曲霉来源的重组α-L-鼠李糖苷酶在30℃表现出较高的稳定性，孵育2h后仍有80%以上的相对酶活力；在40℃时，酶的活性急剧下降。
从以上结果可知，本发明所述α-鼠李糖苷酶最适反应温度显著高于黑曲霉来源的重组α-L-鼠李糖苷酶的最适温度，也是国内外至目前报导的α-L-鼠李糖苷酶最高的最适反应温度；本发明所述α-鼠李糖苷酶温度稳定性显著高于黑曲霉来源的重组α-L-鼠李糖苷酶的温度稳定性。
实施例4：本发明所述α-鼠李糖苷酶优选制备方法
将重组质粒pET-TPERha转化大肠杆菌JM109(DE3) 宿主菌（购自Novagen公司），在含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板（LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 15 g/L）上经过37℃培养过夜，挑转化子到200 mL的LB培养基中（50 μg/mL 卡那霉素）37℃，200 rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度分别为0mM, 0.01 mM, 0.05 mM，0.1 mM，0.5 mM 异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导剂，30℃培养7 h；以及不加诱导剂IPTG在30℃培养7h，用高速冷冻离心机分别将2mL培养液在4℃下，以13,000 rpm离心15 min，收集菌体。在菌体中加入一定体积缓冲溶液，重悬后，超声波破碎细胞，获得全细胞裂解液，去一定体积全细胞裂解液以13,000 rpm离心15 min，获得上清液可溶性蛋白溶液，沉淀即为不溶性蛋白—包涵体。我们通过测定上清液中α-鼠李糖苷酶活力来评价不同表达条件的效果，结果如图3所示。
图3所示1-5分别表示： 1, 30℃不加IPTG; 2, 30℃加IPTG至终浓度0.01mM; 3, 30℃加IPTG至终浓度0.05mM；4, 30℃加IPTG至终浓度0.1mM；5, 30℃加IPTG至终浓度0.5mM。由图3可见，在30℃诱导下，不加IPTG时，重组酶几乎无表达；但是随着IPTG添加浓度越大，酶产率越低，可能是高浓度的诱导剂对菌体生长造成影响。由此可见，本发明所述表达α-鼠李糖苷酶的基因重组菌在30℃下加入0.01mM诱导剂IPTG即可达到高效表达。
实施例5：本发明所述α-鼠李糖苷酶的产酶曲线。
将实施例2中所述，转化后得到的带有表达质粒的重组菌转化子转接到30mL含有卡那霉素50 μg/mL的LB培养基中，经过37℃，180prm培养过夜，以此作为种子液，接种到50mL含有卡那霉素50 μg/mL的LB培养基至OD₆₀₀ 0.1左右，37℃，180prm培养至OD₆₀₀0.8，加入诱导剂IPTG至0.01mM，之后每2h取样一次，收集菌体，破碎测定酶活力。
结果如图4所示，重组菌在诱导表达前期酶活力偏低，一直到诱导至6h后，其α-鼠李糖苷酶活力达到最高，至4.5U/mL，继续延长诱导时间至8h后酶活力开始下降，可能是培养时间延长之后菌体生长环境变化导致其对异源蛋白的表达能力减弱，所以诱导6h较优。
实施例6：本发明所述α-鼠李糖苷酶对橘皮苷的水解
取纯化后的α-L-鼠李糖苷酶0.5U，加入100 μL 100 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，10μL 50 mmoL/L的橘皮苷（甲醇溶解），添加去离子水至200μL，在90℃条件下孵育30min，取出12000rpm 离心2min，加入200 μL甲醇（分析纯）混匀，经0.22 μm的有机滤膜过滤到色谱瓶中，使用HPLC分析，分析条件为：柱温，30℃；流速，1.0 mL/min；进样量，5 μL；检测波长，270 nm；流动相，甲醇：超纯水=50:50 (V:V) 。结果如图5所示。
图5-a是灭活的重组α-L-鼠李糖苷酶酶液处理的橘皮苷的HPLC图谱。结果表明，本发明所述α-鼠李糖苷酶能在高温条件下水解橘皮苷等含α-1,6-鼠李糖苷键的黄酮类化合物。
                         序列表
 
<110>  南京林业大学
 
<120>  一种α-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用
 
<130> 
 
<160>  4    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  876
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<400>  1
 
Met Ile Gln Ala Cys Asp Leu Arg Cys Glu Tyr Leu Thr Ser Pro Val
1               5                   10                  15     
 
 
Leu Gly Leu Asp Val Ile Pro Arg Phe Ser Trp Arg Leu Lys Gly Asn
            20                  25                  30          
 
 
Gly Lys Lys Gln Thr Arg Tyr Lys Ile Ile Val Ser Asp Asn Phe Asp
        35                  40                  45             
 
 
Asp Ile Glu Arg Gly Ile Gly Asn Val Trp Glu Ser Glu Lys Asp Ser
    50                  55                  60                  
 
 
Ser Lys Asn Leu Asn Ile Glu Tyr Glu Gly Pro Lys Leu Lys Ala Tyr
65                  70                  75                  80 
 
 
Lys Gly Tyr Tyr Trp Arg Val Lys Leu Trp Asp Glu Lys Glu Asn Gly
                85                  90                  95     
 
 
Pro Trp Ser Glu Thr Ala Tyr Phe Glu Met Gly Pro Leu Glu Asp Trp
            100                 105                 110        
 
 
Arg Gly Lys Trp Ile Thr Met Pro Ser Pro Leu Ser Phe Lys Asp Pro
        115                 120                 125            
 
 
Ala His Arg His Glu Leu Phe Tyr Ala Met Tyr Phe Arg Lys Glu Phe
    130                 135                 140                
 
 
Leu Leu Asn Lys Glu Val Glu Lys Ala Arg Val Tyr Val Ser Gly Leu
145                 150                 155                 160
 
 
Gly Val Tyr Glu Leu His Leu Asn Gly Lys Arg Val Gly Asn Asn Val
                165                 170                 175    
 
 
Leu Asp Pro Ala Pro Thr Asp Tyr Asn Lys Val Ala Leu Tyr Ser Thr
            180                 185                 190        
 
 
Tyr Asp Val Thr Gln Tyr Leu Thr Thr Gly Lys Asn Thr Ile Gly Val
        195                 200                 205            
 
 
Ile Leu Gly Asn Gly Arg His Ile Arg Asp Tyr Gly Tyr Ser Lys Pro
    210                 215                 220                
 
 
Lys Leu Tyr Leu Gln Leu Leu Val Phe Tyr Lys Asp Gly Ser Arg Glu
225                 230                 235                 240
 
 
Phe Ile Cys Ser Asp Glu Thr Trp Lys Val Ser His Gly Pro Leu Lys
                245                 250                 255    
 
 
Glu Asn Gly Ile Tyr Phe Gly Glu Val Tyr Asp Ala Arg Asp Glu Ile
            260                 265                 270         
 
 
Ser Gly Trp Asp Ser Pro Gly Phe Asp Asp Arg Asn Trp Ser Glu Val
        275                 280                 285            
 
 
Glu Ile Val Glu Gly Pro Ser Leu Lys Ala Gln Leu Ile Pro Val Ile
    290                 295                 300                 
 
 
Arg Val Cys Glu Val Ile Lys Pro Lys Arg Leu Trp Leu Ser Ser Arg
305                 310                 315                 320
 
 
Gly Thr Phe Ile Val Asp Phe Gly Lys Asn Ile Ser Gly Trp Val Lys
                325                 330                 335    
 
 
Leu Arg Val Asn Asn Gly Lys Arg Gly Glu Lys Ile Ile Ile Arg Tyr
            340                 345                 350        
 
 
Ala Glu Val Leu Asp Pro Ser Met Asp Arg Leu Asp Thr Arg Asn Leu
        355                 360                 365            
 
 
Arg Leu Ala Arg Ala Thr Asp Glu Tyr Ile Leu Lys Gly Gln Gly Val
    370                 375                 380                
 
 
Glu Ile Tyr Glu Pro Arg Phe Thr Tyr His Gly Phe Arg Tyr Val Glu
385                 390                 395                 400
 
 
Val Glu Asp Tyr Pro Gly Thr Leu Thr Ser Asp Asn Ile Glu Ala Met
                405                 410                 415    
 
 
Phe Val His Thr Asp Val Glu Lys Val Gly Asp Phe Ala Cys Ser Ser
            420                 425                 430        
 
 
Glu Leu Leu Asn Lys Ile His Ser Cys Val Val Asn Ser Gln Leu Ala
        435                 440                 445            
 
 
Asn Leu Met Gly Ile Pro Thr Asp Cys Pro Gln Arg Asp Glu Arg Met
    450                 455                 460                
 
 
Gly Trp Leu Gly Asp Ala Gln Leu Thr Val Glu Glu Ala Met Tyr Asn
465                 470                 475                 480
 
 
Phe Asp Met Ala Ala Phe Tyr Thr Lys Tyr Leu Met Asp Ile Lys Leu
                485                 490                 495    
 
 
Ser Gln Lys Glu Asp Gly Ser Ile Ser Asp Val Ala Pro Pro Tyr Trp
            500                 505                 510        
 
 
Lys Arg Tyr Pro Ser Asp Pro Ala Trp Gly Thr Ala Tyr Ala Thr Ile
        515                 520                 525            
 
 
Leu Trp Tyr Leu Tyr Phe Phe Tyr Glu Asp Arg Arg Val Leu Glu Glu
    530                 535                 540                
 
 
His Tyr Asp Ser Leu Lys Arg Tyr Val Glu Phe Leu Arg Lys Asn Ser
545                 550                 555                 560
 
 
Pro Asn His Leu Thr Lys Leu Gly Gln His Gly Asp Trp Cys Pro Pro
                565                 570                 575    
 
 
Gly Asp Lys Phe Pro Lys Arg Thr Pro Leu Ile Leu Thr Ser Thr Trp
            580                 585                 590        
 
 
Tyr Tyr Tyr His Asp Thr Leu Ile Leu Ser Glu Ile Ala Lys Ile Leu
        595                 600                 605            
 
 
Gly Lys Lys Glu Asp Glu His Glu Tyr Arg Lys Leu Ala Gly Glu Ile
    610                 615                 620                
 
 
Lys Glu Ala Phe Asn Arg His Phe Leu Arg Lys Val Glu Asp His Thr
625                 630                 635                 640
 
 
Gly Arg Ile Val Cys Phe Tyr Arg Gly Ile Lys Leu Ser Pro Lys Asp
                645                 650                 655    
 
 
Arg Ile Pro Thr Thr Gln Thr Cys Asn Val Leu Pro Leu Trp Asn Lys
            660                 665                 670        
 
 
Met Val Pro Glu Glu Cys Arg Glu Asp Val Phe Lys Val Leu Glu Arg
        675                 680                 685            
 
 
Leu Ile Glu Val Asp Asn Asp Thr His Phe Asp Thr Gly Ile Val Gly
    690                 695                 700                
 
 
Thr Arg Tyr Ile Leu Glu Val Leu Ser Glu Asn Gly Arg Lys Asp Leu
705                 710                 715                 720
 
 
Ala Leu Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp Tyr Pro Ser Phe Gly Tyr Met
                725                 730                 735    
 
 
Ile Lys Asn Gly Ala Thr Thr Leu Trp Glu Arg Trp Glu Lys Leu Glu
            740                 745                 750        
 
 
Gly Thr Gly Met Asn Ser His Asn His Val Met Leu Gly Ser Val Asp
        755                 760                 765            
 
 
Thr Trp Phe Tyr Lys Tyr Leu Ser Gly Ile Lys Pro Val Ala Pro Gly
    770                 775                 780                
 
 
Trp Lys Lys Ile Arg Ile Glu Pro Tyr Phe Ala Asp Gln Ile Asp Phe
785                 790                 795                 800
 
 
Val Ser Ala Lys Ile Lys Thr Pro Asn Gly Ser Leu Glu Val Ser Trp
                805                 810                 815    
 
 
Lys Lys Gln Asn Lys Glu Tyr Glu Ile Gln Ile Ile Ile Pro Val Asn
            820                 825                 830        
 
 
Thr Val Gly Ile Phe Ala Val Pro Glu Ser Phe Lys Val Ser Ala Ile
        835                 840                 845            
 
 
Asn Ser Lys Gln Val Ser Tyr Pro Ser Glu Phe Glu Leu Glu Pro Gly
    850                 855                 860                
 
 
Ala Tyr Asn Ile Val Leu Glu Arg Val Arg Glu Cys
865                 870                 875    
 
 
<210>  2
<211>  2631
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
atgatacagg cctgtgatct tcgctgtgaa tatttgacgt ctcctgtcct tggactcgat     60
 
gtgattcctc gattttcttg gagattaaag ggtaatggaa agaaacaaac acgatacaaa    120
 
attatcgttt cggacaattt cgatgatatc gaaagaggaa taggaaatgt gtgggagagc    180
 
gaaaaagatt cttcaaaaaa cctgaacata gaatatgaag ggccaaaatt gaaagcttac    240
 
aagggctact attggcgcgt gaaactttgg gatgaaaaag aaaatggacc gtggagtgag    300
 
acagcttact tcgaaatggg ccctttagag gattggagag gaaaatggat aaccatgcct    360
 
tctccgctct cttttaagga tccagcccat cgccatgaac tcttctacgc tatgtacttt    420
 
cgaaaggagt ttctcttaaa caaagaggta gaaaaagcac gggtttatgt gagcgggctg    480
 
ggagtctatg aactccattt gaacggaaaa agagtgggaa acaatgttct cgatcctgca    540
 
ccaacggatt acaacaaggt agcactctat tcaacatacg atgtcacaca atatctaaca    600
 
acgggaaaaa atacaatagg tgtgattctt ggtaacggcc gccatatcag agattatggg    660
 
tattcaaaac caaaacttta tcttcaactg cttgtgttct acaaagatgg atcgcgggaa    720
 
ttcatttgct ccgacgaaac atggaaggtt tcacatggac ctctgaagga aaatggcatc    780
 
tattttggcg aagtctacga tgcccgcgac gaaatatctg gatgggattc acccggtttc    840
 
gacgatagga actggtcaga agtagaaatc gtagaaggtc cttctctgaa agcacaactg    900
 
attcctgtca tacgtgtttg tgaggttatt aaaccaaaga ggttgtggtt gtcttccaga    960
 
ggaactttca tagttgattt tggcaaaaat atttccgggt gggtgaagct gagagtaaat   1020
 
aacggtaaaa gaggggagaa aattatcata cgctatgcgg aagtactgga tccctccatg   1080
 
gatcggctgg atacgagaaa tcttcgtcta gcacgtgcta cagacgaata cattctgaag   1140
 
ggacagggag tggaaatcta cgaaccaaga ttcacatacc atgggtttcg ttatgtcgaa   1200
 
gtggaagact atcctggcac tttaacctcc gataacatag aagcaatgtt tgtccacaca   1260
 
gatgttgaaa aagttggaga ttttgcctgc tcgagtgaac ttttgaacaa aatccactca   1320
 
tgtgttgtga acagtcagtt agctaacctg atgggaattc ctacagattg cccccagaga   1380
 
gatgaaagaa tgggatggtt gggtgatgcc caattaacgg ttgaagaggc gatgtacaac   1440
 
ttcgacatgg cagctttcta cacgaaatat ctcatggaca taaagctttc ccagaaagaa   1500
 
gatggaagta tatcagatgt tgctcctccc tactggaaga gatacccgtc agatccagct   1560
 
tggggaaccg cctatgcgac gattttgtgg tatctctatt tcttctatga agacagaaga   1620
 
gtactggaag aacactatga ttcgctgaaa cgttacgtag agtttctcag aaagaattcc   1680
 
cctaatcatt taacaaaatt aggacagcat ggtgattggt gtcctccagg tgataaattc   1740
 
ccaaagcgca ctcctttgat tctaacttcc acatggtatt actatcacga taccctcatt   1800
 
ttgagcgaga tagcgaaaat actcggaaaa aaggaagacg aacatgagta tagaaaactt   1860
 
gccggagaaa taaaagaagc cttcaaccgt cattttctca ggaaagttga ggatcacacg   1920
 
ggtcggattg tgtgcttcta cagaggaata aagttgagcc ccaaagatag aattcccacc   1980
 
actcagacgt gtaatgttct gcctctctgg aacaagatgg ttccggaaga gtgtagagag   2040
 
gatgtgttca aagtccttga gagactgata gaagtggata acgatacgca ttttgacacc   2100
 
ggaatcgtgg gtactcgtta catactcgag gttttatcgg aaaatggcag gaaagacctt   2160
 
gcattgaaac ttcttttgaa agaagattat ccaagctttg gctacatgat aaagaacggt   2220
 
gcaacaacac tgtgggagag atgggagaag ctggaaggta ctggcatgaa ttcacataat   2280
 
catgtcatgc tgggtagcgt cgacacatgg ttctataagt atctttcggg aataaaaccg   2340
 
gttgctcccg gttggaagaa gataaggata gaaccatact tcgctgatca aatagatttc   2400
 
gtttcggcca aaataaaaac cccaaatgga tcacttgagg ttagttggaa aaagcagaat   2460
 
aaagaatatg aaatccagat tattataccg gtgaatacgg ttggtatttt cgctgttccg   2520
 
gaaagtttca aagtatctgc aataaacagc aaacaagtga gttatccttc tgagtttgaa   2580
 
cttgaaccag gtgcctacaa catcgttctc gaaagggtga gagaatgtta g            2631
 
 
<210>  3
<211>  35
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
cggctagcat gatacaggcc tgtgatcttc gctgt                                35
 
 
<210>  4
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
tatagcggcc gcttagtggt ggtggtggtg gtgaca                               36