本发明涉及用于检测体液样品中血清碳酸氢盐浓度的酶方法 中的试剂。本发明尤其涉及用于其中反应样品中氧化辅酶的量直接 相当于样品中存在的碳酸氢盐浓度的方法中的试剂。本发明也涉及 测定碳酸氢盐浓度的改进方法。
体液样品中待分析物(特别是碳酸氢盐)的定量可包括将空白 样品与发生待分析物酶转化的样品进行对照。
欲完成碳酸氢盐的酶转化，让底物特异酶作用于已知用于血清 碳酸盐定量的酶底物。相对空白而言，反应混合物中的变化可通过 用不同方法测定混合物吸收度的变化来计算出。吸收度的变化与样 品中存在的碳酸氢盐的数量直接相关。
虽然包括比色法测定、分压分析和电极测试在内的传统方法已 证明令人满意，但酶分析法在测定血清碳酸氢盐水平方面比其它这 些方法更精确、可靠和简单。
样品中总CO2的常用定量方法要求将病人的样品与底物磷酸 烯醇丙酮酸盐(PEP)混合，在此时读取空白读数。然后向混合物 中加入底物特异酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)，引起PEP 转化成草酰乙酸盐(OAA)和磷酸盐。
尽管随后可有不同方法使草酰乙酸盐与样品中总CO2相关 联，但最常用的方法要求草酰乙酸盐与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸(NADH)和苹果酸脱氢酶(MDH)偶合，此反应结果是烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸氧化和苹果酸盐的生成。
产生的NAD+浓度与最初样品中存在的总CO2浓度相关。
从历史上来看，碳酸氢盐酶试剂重构稳定性差。不稳定的原因 归于溶液中内源性成份的破坏，加之试剂摄入空气中的CO2。通常 来自玉米叶的PEPC(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)特别易受氧化降解 作用的影响，通过内源性污染物如NADH氧化酶和蛋白酶缓慢地降 低PEPC的效力。尽管将NADH贮存在碱性的PH环境中能明显改 善其重构稳定性，但NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)在溶 液中特别是在酸性介质中仍将迅速降解。
大多数测定血清碳酸氢盐的试剂是在PH约为8.0的碱性条件 下配制。在此PH值时，空气中的CO2就成问题了。外源性CO2的吸收引发一连串酶反应，导致后来的NADH损失和吸收度及试剂 稳定性的必然降低。用劣质的实验用水进行试剂配制具有与上述相 同的危害效应。
因此，即使是很大程度地减少试剂与空气中CO2的接触，试剂 也只有非常短的有效寿命。
克服以这一困难的一种方法是在用此试剂前生成还原型辅 酶。
在F.Hoffmann La Roche AG的澳大利亚专利申请Au-A- 61906/90中述及一种这样的方法。所披露的方法中，还原型的辅酶 就地生成于辅酶被待分析物、底物和特异酶再氧化的同时或之前。 此步是通过包括酶和酶底物的反应混合物米实现的，使空气氧化的 辅酶能够还原。F.Hoftmann La Roche AG披露且优选的这一特异 反应是：
此反应能使烟酰胺腺苷二核苷酸还原。
这种生成NADH的方法的问题是不可能有稳定的单一瓶装的 试剂形式。
F.Hoffmann La Roche AG通过将试剂分成2瓶在一定程度上 克服这一问题。第一类试剂含底物特异酶，就CO2定量而言为 PEPC、MDH和G-6-P-DH。第二类试剂为酶底物和辅酶， 就CO2测定而言为PEP、G-6-P和NAD+(氧化状态)。因 此检测反应按如下进行：
其中(A)和(B)代表可选择的相等同的途径。
然而，这种试剂系统仍有困难。除两种试剂瓶装造价高、分列 目录和浪费外，要求6-磷酸葡萄糖水平非常精确，而且此试剂系 统限用于特定的化学分析仪。只要两种试剂一结合，通过6-磷酸 葡萄糖的耗竭，就由NAD+生成NADH。如果两种试剂结合而没 有立即使用，因为6-磷酸葡萄糖这样被耗竭，结合的试剂的稳定 性可能受到很大影响。如果6-磷酸葡萄糖量不精确或过量，则试 剂的保温时间选择很关键。结果可以是假象性低吸收度变化和总体 不精确的结果。
Modrovich的美国专利4,394,449中描述的一种早期方案 用底物/酶对产生还原型辅酶，如同Roche的方案，然而，此例中6 -磷酸葡萄糖是按下式由葡萄糖生成的。
然后在有酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶存在下，NAD+与生成的6 -磷酸葡萄糖反应形成NADH。Modrovich配方中也同时包括 NADH和NAD+以便当NADH被氧化或降解时，试剂中的NAD+将有助于产生NADH。这也是一种两瓶装试剂。
第三种方法是Crowther等在美国专利5,116,728中描述 的方法。此发明中利用酶/底物对的概念再生成NADH。此发明与 Roche和Modrovich的不同，再生成反应由于用很低水平的酶而降 低至约最大反应速率的2％。另外包括一种稳定剂，实际上是加入 NAD+，其加入量是理论上预先确定的、将建立NADH和NAD+之间平衡的量，以控制生成速率。该体系中既有NADH的生成也有 再生。系统更依赖哪个还不清楚。此体系的不足是溶液中很低水平 的酶很不稳定，将影响试剂的长期稳定性。从ALT试剂声称的稳 定性可清楚向出这一点，即在冷冻环境中存放22天。另外它也要 求试剂分为两部分。
与上文所述每个发明采纳的NADH产生机制，即
相关的总的问题是：此反应不可能是用单一瓶的一步反应，因 为只要一加入病人血清，就同时发生两种反应：
(a)由于NADH转化为NAD+而致的吸收度的降低，
(b)由NAD+生成NADH导致吸收度的升高。
这两个反应以相似的速度进行，结果是假象性低吸收度变化和 总体不精确的结果。
因而，本发明的一个目的就是提供一种可用于血清碳酸氢盐水 平检测的试剂系统，其基本上改进了那些用于依赖于辅酶氧化而检 测血清碳酸氢盐的酶分析法中的现有技术试剂系统所存在的问 题，特别是那些与试剂的内源性和外源性污染有关的问题。本发明 的更进一步目的是提供一种检测病人样品中碳酸氢盐浓度的改进 方法，这种方法克服了那些包括辅酶的过早氧化和为最大限度减低 试剂污染需要多种瓶系统在内的与现有技术有关的问题。
为此，提供了一种用于通过测定辅酶的氧化程度来进行病人血 清碳酸氢盐浓度酶检测的试剂，其特征在于通过选择包括酶/底物对 的辅酶还原系统来抗氧化、使所述试剂的整个贮存过程中能持续再 生所述辅酶，从而稳定所述试剂。
优选的是辅酶还原系统包括一种酶和一种底物，所述酶对所述 底物有不完全特异性，因而导致交叉反应速率降低。
该试剂优选是单一瓶装剂型。
整个此说明书中用的术语“不完全特异性”是就酶/底物对而言 的，其中所选的底物不是所述酶的天然底物，因此对相关酶的交叉 特异性小于100％。
本发明是基于通过彼此有不完全特异性的酶与底物结合，辅酶 还原速度明显减慢这一发现的。通过减慢还原反应，试剂的必要组 分可存放于一个贮存瓶内，内容物通过低水平持续的辅酶再生来抗 污染维持稳定。通过减慢此过程，NADH的再生可在不影响血清碳 酸氢盐测定的情况下进行。在试剂没被应用时，这种再生就可进 行，再生的速率可通过调节选择的酶/底物对的种类和水平而进行精 细的调节。
在本发明的一个可选择的实施方案中，提供了一种用于通过测 定辅酶的氧化程度来测定病人血清碳酸氢盐浓度的酶方法中的试 剂，其特征在于通过包含酶/底物对的辅酶还原系统来抗氧化稳定所 述试剂，选择酶/底物对使所述辅酶在20-25℃时以0.10-0.90m Abs/min的速率再生。
根据本发明这一方面，试剂中再生速率优选为20-25℃时0.20 -0.80mAbs/min。
本发明的一个优选实施方案中，辅酶还原系统的底物和酶间等 摩尔基础上的特异性程度优选小于100％，更优选小于50％，最优选 小于10％。使用等摩尔基础的交叉反应性小于5％的酶/底物对为 最佳。
优选用于本发明试剂中的辅酶是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸(NADH)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)， 但烟酰胺次黄嘌呤二苷酸磷酸或硫代-NADH这些辅酶类似物也 可是合适的。
在检测血清样品中的CO2含量时，辅酶还原系统中优选应用的 酶是6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-P-DH)和葡萄糖脱氢酶。
诸如甲酸脱氢酶、甘油脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、L-丙氨酸脱 氢酶、3α-羟基-类固醇脱氢酶、L-乳酸脱氢酶(产自乳杆酶 菌种)或3-磷酸甘油脱氢酶也是合适的。优选用于总CO2测定的 试剂中的酶是6-磷酸葡萄糖脱氢酶。这可从任何合适的来源得 到，如肠膜明串珠菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、Zymomonas Mobilus 或酵母。
这类酶优选源于微生物。已经发现，试剂中加入来自微生物的 酶能消除象NADH氧化酶和蛋白酶这类以前严重影响试剂稳定性 的内源性污染物的出现。微生物酶还有热稳定性更高的附加优点， 因此可提高其在溶液中的长期稳定性。
6-磷酸葡萄糖脱氢酶的更优选来源是肠膜明串珠菌。如果使 用来自嗜热脂肪芽孢杆菌或Zymomonas Mobilus的6-磷酸葡萄糖 脱氢酶，反应速率降低。与此相似，如果用酵母作为6-磷酸葡萄 糖脱氢酶的来源，必须用辅酶NADPH作为NADH的替代物，因为 酵母6-磷酸葡萄糖脱氢酶仅作用于NADP+。
要注意的是，辅酶还原系统中底物和酶的选择必须是二者彼此 有不完全特异性，用于本发明试剂中的合适的底物包括：5-磷酸 核糖、1-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖酸、6-磷酸-2-脱氧 葡萄糖、6-磷酸-2-脱氧-2-氟葡萄糖、6-磷酸-2-脱 氧-2-氯葡萄糖、6-磷酸-2-脱氧-2，2-二氟葡萄糖、 6-磷酸-2-O-甲基葡萄糖、6-磷酸甘露糖、6-磷酸葡糖 胺、6-磷酸-3-脱氧葡萄糖、6-磷酸-3-脱氧-3-氟葡 萄糖、6-磷酸-3-O-甲基葡萄糖、6-磷酸阿洛糖、6-磷 酸ahrose、6-磷酸-4-脱氧-4-氟葡萄糖、6-磷酸半乳 糖、6-磷酸-5-硫-葡萄糖、膦酸酯类似物、6-stallate 葡萄糖、β-D-葡萄糖、D-半乳糖、2-脱氧葡萄糖、阿拉伯 糖、木糖、1-山梨糖、D-甘露糖、D-果糖、D-乳糖、D -山梨醇、D-甘露醇、蔗糖、肌醇、麦芽糖。
用NAD+作为试剂中优选的辅酶，优选的酶/底物组合是6- 磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-P-DH)/D-葡萄糖。优选的D -葡萄糖的替代底物是那些，相对6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 和G-6-P-DH间的特异性，G-6-P-DH酶与所选择 的底物间反应的速率小于50％，更优选小于10％，最优选小于5 ％。
D-葡萄糖/G-6-P-DH的一个优选的替代物是根据下述 D-葡萄糖为100％反应底物的反应应用葡萄糖脱氢酶(GLD)。
如果将葡萄糖脱氢酶作为酶，用于NAD辅酶还原的优选的底 物和它们与D-葡萄糖相比交叉反应的相对程度如下：
底物 相对活性
木糖 8.9％
L-山梨糖 0.3％
D-甘露糖 2.4％
D-果糖 0.8％
D-半乳糖 0.1％
D-乳糖 1.2％
D-山梨醇 0.1％
肌醇 0.2％
麦芽糖 3.9％
栏中的数字代表相对葡萄糖脱氢酶1β-D-葡萄糖与1β- D-葡萄糖的反应速率的反应速率。
或者，用甘油脱氢酶(GLY.DH)作为酶，在反应 中合适的底物和其相对于甘油(100％)的活性为： 底物 相对活性 α-氯乙醇甘油 48.5％ 乙二醇 7.8％ 2，3-丁二醇 52.6％ 亮氨酸脱氢酶(L.D)作为酶时，根据下述反应
合适的底物和它们相对于L-亮氨酸(100％)的活性为：
底物 相对活性
L-缬氨酸 74％
L-异亮氨酸 58％
L-正缬氨酸 41％
L-正亮氨酸 10％
L-蛋氨酸 0.6％
L-半胱氨酸 0.3％
如果L-丙氨酸脱氢酶(A.D)类似亮氨酸脱氢酶那样作为酶 用于反应系统中，合适的底物和其相对于L-丙氨酸(100％)的 活性是：
底物 相对活性
L-丝氨酸 5％
3α-羟基类固醇脱氢酶(H.DH)与可用作酶与下列底物结 合，这些底物相对于胆酸的活性也被列出：
底物 相对活性
石胆酸 96％
本胆酸 60％
来自乳杆菌菌种的L-乳酸脱氢酶(LDH)在下述反应中作 为酶： 合适的底物和它们相对于L-乳酸的活性为：
底物 相对活性
α-氧代戊二酸 0.09％
草酰乙酸 36％
例如来自酵母的NADP为辅酶，优选的底物/酶组合为：
G-6-P-DH/6-磷酸半乳糖 25％
G-6-P-DH/6-磷酸-2-脱氧葡萄糖 18％
G-6-P-DH/6-磷酸葡糖胺 2％
右边的数字代表相对G-6-P-DH/G-6-P对的相对反 应性。
还可用NADP作为辅酶结合酶/底物对：3-磷酸甘油脱氢酶 和磷酸二羟丙酮。
如本说明书前言中所述及的，用于测定血清碳酸氢盐水平的根 据本发明试剂的其它需求为磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，磷酸烯醇丙 酮酸羧化酶(PEPC)，还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)和苹果酸脱氢酶(MDH)。
为使试剂达到最佳性能状态，必须选择PEP的水平。这可根据 试剂选用的其它成分而变，然而，已经发现在本发明中1.5mmol/l 到至少15mmol/L的浓度范围是合适的。低于1.5mmol/L出现底物 耗竭从而影响试剂的稳定性。用PEP的不同盐并不危及试剂的稳定 性。应注意的是PEP水平越高，试剂的PH值越低。因此缓冲水平 需调至最适PH水平。
试剂中辅酶的水平将根据下列因素变动：
·测定中的线性要求
·选择的波长
·样品与试剂的体积比率
·所选分析仪的光度系统
总的来说，增大样品体积增进敏感性但降低所得读数的线性， 而降低样品体积在损害灵敏度的情况下提高线性。
优选的测量波长是320-400nm，然而应调节所用辅酶的水平 以便吸收度不超过2.0A。根据本发明，吸收度的优选波长是 380nm。
最好选择PEPC的水平以便反应终点能在要求的时间内完成。 例如，37℃下50mmol样品，如果要求的完成时间为5分钟，可选 择380U/L的水平。PEPC优选得自微生物来源，以便降低试剂内 源性污染的危险。
MDH也优选得自微生物来源以便限制内源性污染的危害。合 适的水平是150-1500U/L，更优选200-400U/L。
本发明的试剂除包括辅酶还原系统、其它必需底物和测定待分 析物浓度必需的酶外，还可包括防腐剂、螯合剂、表面活性剂、蛋 白酶抑制剂、缓冲剂，辅助因子、LDH抑制剂、抗菌剂和具有增 强稳定性功能但实质上不影响本发明特征的其它成分。
选择缓冲液的基本原则是在选择的PH内结合二价阳离子最少 且缓冲能力好。根据经验作法，若一种缓冲液的pKa值是所选的 PH±1.0PH单位则认为它是有效的。20℃根据时本发明试剂优选 的PH是7-9，更优选8.0。在此优选PH时，在溶液中最佳酶活 性与酶和辅酶的稳定性间达成平衡。较低的PH可导致辅酶的降 解。
合适的缓冲液有HEPES，4-吗啉丙磺酸(MOPS)或2 〔三(羟甲基)甲氨基〕-1-乙烷磺酸(TES)或其它好的缓冲 液，TRICINE、BICINE、TEA和TAPS。根据本发明，优选的 缓冲液是总离子强度优选为30-100mmol/L，更优选为约 58mmol/L的TRIS和/或HEPES。待检测的样品用合适的稀释剂 如去离子水或盐水进行稀释。
在本说明书别处所述的PEPC反应中要求镁离子作为辅助因 子。4-20mmol/L的浓度是合适的。镁离子的合适来源包括硫酸 镁(无水的)、氧化镁和醋酸镁以及其它合适的镁盐。
防腐剂如叠氮化钠(NaN3)、羟苯甲酸、庆大霉素、麝香草 酚和来自Boehringer Mannheim的无汞防腐剂是合适的。防腐剂的 适当用量是其在2-8℃贮存至少6-8个月仍保持防腐能力而不 抑制试剂中的酶。要达这一标准，合适的范围为0.1-1.0g/L。
诸如辛基苯氧基聚乙氧基乙醇或聚氧乙烯脂肪醇醚的非离子 表面活性剂是合适的。PMSF或抑蛋白酶肽(Aprotinin)是已知 的蛋白酶抑制剂，草氨酸钠，草酸或棉子酚将抑制由乳酸脱氢酶造 成的干扰。对丙酮酸盐水平高的病人来说，需要最后这种成份，因 丙酮酸盐可干扰碳酸氢盐酶反应。例如，草氨酸钠合适的水平为 1.0g/L。其它酶稳定剂包括牛血清白蛋白、牛γ球蛋白、N-乙酰 半胱氨酸和甘油。
还可用许多螯合剂，如EDTA、EGTA、N-(2-羟乙基) -乙二胺三乙酸(HEDTA)等等。若需要的话，也可以加入合适 的消泡剂。
本发明的一个优选实施方案中，试剂基本含有：
G-6-P-DH 辅酶还原
D-葡萄糖 系统
PEP 底物
PEPC 底物特异性
MDH 酶
NADH 辅酶
另外，优选还包括TRIS缓冲液、HEPES游离酸、草氨酸钠、 叠氮化钠、牛血清白蛋白、硫酸镁(无水的)。
根据本发明配制的一种试剂如下： 原料 分子量 浓度 量/升 TRIS缓冲剂 21.14 40mM 3.5-5.5g HEPES游离酸 238.3 18mM 3.5-5.3g PEP·MCHA盐 267.1 6.0mM 1.0-2.2g 草氨酸钠 111.03 9mM 0.5-1.5g 叠氮化钠 65.01 7.7mM 0.25-0.75g 牛血清白蛋白 0.1％ 0.5-1.5g NADH.Na23H2O 763.5 1.6mM 0.6-1.80g 硫酸镁(无水) 120.4 8mM 0.5-1.3g D-葡萄糖 180.16 0.25mM 40.0-50.0g G-6-PDH (肠膜明串珠菌) 3000-4000U PEPC(微生物) 380-440U MDH(微生物) 220-290U
本发明的另一方面，提供了通过测定辅酶氧化程度检测体液样 品中碳酸氢盐浓度的酶检测方法的改进，这种改进包括通过选择一 种含酶/底物对的辅酶还原系统，使在整个试剂贮存过程中能持续 再生辅酶采对抗辅酶的氧化，从而稳定所述试剂。
本发明在这方面的一个优选的方法中，酶/底物对的酶对所说的 底物具有不完全特异性，因而降低酶和底物间的交叉反应速率。
本发明这方面的一个优选的实施方案中，辅酶还原系统包含彼 此间特异性如下的一种酶和底物：相对于该酶与其天然底物的特异 性，小于100％，优选小于50％，最优选小于10％。最合适的是 酶/底物对相互间的特异性相对于该酶与其天然底物的特异性小于 5％，最好大约为2％。
辅酶、底物和酶可根据待分析物从上文提到的与本发明试剂 相关的那些物质中选出。
本发明中此方面的一个实施方案中，用于测定总CO2浓度的辅 酶还原系统的优选成分为NADH、G-6-P-DH和D-葡萄 糖以发生下述稳定化反应：
由于G-6-P-DH对D-葡萄糖的特异性低，该稳定化 反应慢因而不与主要反应发生竞争： 当加入体液样品时发生这些反应。
实施例 一种按本发明配制的具体CO2试剂的稳定性测试如下： 配方 TRIS缓冲剂 4.86g/L HEPES游离酸 4.31g/L PEP-MCHA盐 1.60g/L 草氨酸钠 1.00g/L 叠氮化钠 0.50g/L 牛血清白蛋白 1.00g/L NADH.Na23H2O 1.20g/L 硫酸镁(无水) 0.96g/L D-葡萄糖 45.04g/L G-6-PDH(肠膜明串珠菌) 3500U/L PEPC(微生物) 410U/L MDH(微生物) 250U/L
D-葡萄糖和G-6-P-DH的最佳水平是通过测试在D -葡萄糖和G-6-PDH浓度改变时NADH的再生速率来决定 的。由NAD+到NADH的再生速率与酶G-6-PDH的量及在 较小程度上与D-葡萄糖水平成比例。将2ml(每份)含 250U/LMDII、400U/LPEPC、6mmol/LPEP和50mmol/L D- 葡萄糖的碳酸氢盐PH8.0的配制液加入石英杯中，并加入20μL 50mmol/L碳酸氢盐样品。石英杯用封口膜密封防止CO2进一步污 染。NADH再生的时间过程用Shimadzu分光光度计在25℃、 380nm波长下监测48小时。由这些结果确定优选使用250mmol/L 的D-葡萄糖，以使用较少的G-6-P-DH达到相似的再生速率。 G-6-PDH的最适范围确定为2.5-5.0KU/L，因为这不会影 响主要反应达稳定的终点。选择G-6-PDH的水平为3.5KU/L， 因为此浓度下试剂加盖贮存在4℃时能供合适的NADH再生速率达 6个多月。认为合适的再生速率为20-25℃时0.10- 0.90mAbs/min。
贮存条件：
加盖且冷藏(2-8℃)
分光检测的参数(Shimadzu PC2101)
·反应温度 37℃
·试剂与样品体积比 100∶1
·波长 380nm
·杯道长 1cm
这些分光检测参数用于检测下述指标：
·380nm处试剂的初始吸收度
·380nm处无试剂空白速率
·反应Δ吸收度)
·37℃时完成时间)用50mmol/L的标准品去检测
·20℃时的再生速率(用mAbs/min表示)
得到下列结果 在2-8℃储存时间(周) 6 9 12 16 21 24 28 新鲜试剂 原始吸收度 1.81 1.83 1.76 1.69 1.65 1.61 1.56 1.68 空白速率 (ΔAbs/10min) 0.02 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 完成时间 (min) 4′ 4′ 5′ 5′ 5′ 5′ 5′ 4′ Δ吸收度 0.67 0.7 0.69 0.68 - 0.68 0.7 0.68 再生速率 0.41 0.38 0.35 0.31 0.28 0.25 0.2 0.47
相关性研究
用新鲜试剂、2-8℃贮存达6个月的试剂和新鲜的常规试剂 (不含再生系统)检测病人血清中碳酸氢盐水平。结果 (mmol/L)如下： 常规新鲜试剂 再生技术(6个月) 再生技术(新鲜) 0 0 0 15 17 15 20 22 20 21 22 21 22 23 22 23 25 23 23 24 22 23 24 23 24 26 24 24 24 23 28 29 27 28 29 28 28 29 28 29 32 30 29 29 28 30 31 30 30 32 30 30 31 30 31 32 30 33 34 33 33 33 33 33 33 33 35 36 35 35 36 36 36 37 36 37 38 37 39 40 39 40 41 40 44 44 44 44 45 44 29 30 29
从上述列出的结果看，试剂加盖贮存在2-8℃情况下，再生 性CO2试剂显示出至少6-7个月的稳定性。试剂必须有1.0A的 初始吸收度才起作用。7个月后，试剂仍有至少1.5A的吸收度。 完成时间为4-5分钟，几乎没有改变，因为在测试时间内灵敏度保 持在0.67-0.7A，表明良好的稳定性。线性关系的研究表明在新 鲜试剂和28周的样品中，线性关系都保持在至少40mmol/L处。
病人的相关资料进一步证实，比较新鲜试剂与在2-8℃情况 下贮存6个月的试剂在功能上没有显著性差异(r2＝0.997)。
根据本发明，与再生系统的联合导致血清碳酸氢盐检测试剂在 2-8℃加盖时，重构稳定性从一个月提高到6-8个月。在室温 下、不加盖的试剂的稳定性从1天提高到大约7天。根据本发明的 试剂和方法的其它优点是试剂为单一瓶装，从而减少了与现有技术 试剂有关的空间和目录问题，并且适合各种测试设备系统。
应认识到有许多合适的“非天然”底物/酶对可用以减慢本发明 中的试剂和方法中的辅酶的再生。除文中提到的那些外，还有其它 非市售的或价格昂贵的这种酶/底物。