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1、10申请公布号CN101935238A43申请公布日20110105CN101935238ACN101935238A21申请号200910157223822申请日20090702C05F11/08200601C12N15/01200601C12Q1/04200601C12R1/4120060171申请人甘肃农业大学地址730050甘肃省兰州市安宁区营门村1号72发明人师尚礼李剑峰曹文侠张淑卿刘建荣祁娟74专利代理机构北京中恒高博知识产权代理有限公司11249代理人夏晏平54发明名称一种抗污染根瘤菌剂及其制作方法57摘要本发明公开了一种抗污染根瘤菌剂，包括耐抗生素根瘤菌菌株的发酵菌液及相应的抗生。
2、素，所述的相应的抗生素在发酵菌液中的终浓度为100250MG/L。同时本发明还公开了一种抗污染根瘤菌剂的制备方法，包括根瘤菌的辐照诱变，抗药突变体的筛选，及抗污染根瘤菌剂的生产等步骤，本发明的一种抗污染根瘤菌剂，可以克服现有技术中根瘤菌剂高污染率、目的菌株与土著根瘤菌的低竞争力等缺陷，以实现在降低菌剂污染率、提高菌株竞争力、增大有效活菌数的同时可有效降低菌剂的保存和运输成本。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页CN101935238A1/1页21一种抗污染根瘤菌剂，其特征在于，包括耐抗生素根瘤菌菌株的发酵菌液及相应的抗生素，所述的相应的抗生素在。
3、发酵菌液中的终浓度为100250MG/L。2根据权利要求1所述的抗污染根瘤菌剂，其特征在于，所述的耐抗生素根瘤菌菌株是耐抗生素红豆草根瘤菌菌株或耐抗生素苜蓿根瘤菌菌株。3根据权利要求1所述的抗污染根瘤菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤1根瘤菌的辐照诱变利用微波辐照处理根瘤菌发酵菌液，进行菌种的诱变；2抗药突变菌株的筛选将上述处理后的根瘤菌菌液涂布于含抗生素300MG/L400MG/L的YMA固体培养基上，将在含抗生素培养基上能够正常生长的根瘤菌进行相应根瘤菌植株的回接试验，对结瘤能力和促生效果均强于出发菌株的突变菌株进行传代试验，最终选择耐药特性遗传稳定的菌株作为生产用耐抗生素根瘤菌菌株。
4、；3抗污染根瘤菌剂的生产将上述生产用耐抗生素根瘤菌菌株接入YMA液体培养基，发酵培养至菌液活菌含量达到081010121010CFU/ML时缓慢加入抗生素并逐渐搅拌，使菌液中的抗生素终浓度达到100250MG/L，即可制成抗污染根瘤菌剂。4根据权利要求3所述的抗污染根瘤菌剂的制备方法，其特征在于，所述的根瘤菌是红豆草根瘤菌或苜蓿根瘤菌。5根据权利要求3或4所述的抗污染根瘤菌剂的制备方法，其特征在于，所述的抗污染根瘤菌剂可在1015的温度范围内保存，或在其中加入灭菌泥炭。权利要求书CN101935238A1/4页3一种抗污染根瘤菌剂及其制作方法技术领域0001本发明涉及一种微生物肥料，具体地，涉。
5、及一种抗污染根瘤菌剂及其制作方法。背景技术0002目前，根瘤菌剂作为豆科作物和牧草的微生物促生肥料，已广泛应用于农业生产中，无毒无害，不污染环境，增产作用明显，增产幅度达1030，用于新垦或低产田的增产效果更达712241。国内外都在积极研究和应用。我国的微生物肥料生产应用已有近50年的历史。近几年来不但生产规模扩大，数量增加，还发展了一些新的品种和剂型。0003但是，在实现本发明的过程中，设计人发现现有技术根瘤菌剂生产和应用中面临的主要问题有00041菌剂的污染菌剂中有着适宜微生物繁衍的营养和温度湿度等条件，在生产、运输和贮藏过程中，任何微小的疏忽和破损都极易造成自然环境中杂菌的侵入，往往引。
6、起整批次或整包装菌剂的严重污染。某些杂菌污染后凭肉眼无法识别，只有在施用后才发现失去增产效应甚至造成减产，产生不可挽回的损失，严重地损害了菌剂生产厂家的声誉和农业生产者的经济利益。国家微生物肥料标准GBNY2271994中对菌剂的杂菌率限制在10以下，但目前的根瘤菌剂面临着832的高污染率，故寻求降低污染率的生产工艺和方法成为菌剂生产中的核心问题。0005目前低污染率菌剂制作中的防污染措施主要采取严格控制生产和存储环境净度，提高封装质量，菌剂低营养化低碳源及以用海藻酸钠或其它包埋材料对菌种进行固定化包埋的方法，取得了较为明显的结果。这些方法对于生产的无菌条件要求苛刻，对生产设备和工艺有很高的要。
7、求，菌剂生产成本高，难以为中小型菌剂生产厂家所接受，不便于大范围的推广和应用。00062根瘤菌剂中的根瘤菌株与土著根瘤菌的竞争由于土著根瘤菌完全适应当地的土壤环境，竞争力强，故新接种的根瘤菌难以形成优势群落，使得占瘤率低下，高效固氮根瘤的比率减少，增产效应受到限制和弱化。因此如何提高引入菌株在土壤菌落环境中的竞争能力，一直都是科研机构和菌剂研发部门研究的重点。0007目前提高目的根瘤菌株占瘤率的措施多集中在上游筛选研究阶段，多以基因工程的途经提高菌株结瘤因子的表达强度，由此来提高目的菌株对土著菌株的结瘤竞争力。但由于根瘤菌株种类繁多，作物生境变化多样，不可能就每一种作物在每一个生境下进行相应根。
8、瘤菌株的基因改良。因此多年以来难以利用于实际生产。发明内容0008本发明的目的是针对现有技术根瘤菌剂生产和应用中存在的上述缺陷，提出一种抗污染根瘤菌剂及其制作方法，以达到降低菌剂污染率、提高目的菌株竞争力和有效活菌数，有效降低菌剂的保存和运输成本等作用。0009为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种抗污染根瘤菌剂，包括耐抗说明书CN101935238A2/4页4生素根瘤菌菌株的发酵菌液及相应的抗生素，所述的相应的抗生素在发酵菌液中的终浓度为100250MG/L。0010进一步地，所述的耐抗生素根瘤菌菌株是耐抗生素红豆草根瘤菌菌株或耐抗生素苜蓿根瘤菌菌株。0011为实现上述目的，根据本。
9、发明的另一个方面，提供了一种抗污染根瘤菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤00121根瘤菌的辐照诱变0013利用微波辐照处理根瘤菌发酵菌液，进行菌种的诱变；00142抗药突变菌株的筛选0015将上述处理后的根瘤菌菌液涂布于含抗生素300MG/L400MG/L的YMA固体培养基上，将在含抗生素培养基上能够正常生长的根瘤菌进行相应根瘤菌植株的回接试验，对结瘤能力和促生效果均强于出发菌株的突变菌株进行传代试验，最终选择耐药特性遗传稳定的菌株作为生产用耐抗生素根瘤菌菌株；00163抗污染根瘤菌剂的生产0017将上述生产用耐抗生素根瘤菌菌株接入YMA液体培养基，发酵培养至菌液活菌含量达到081010。
10、121010CFU/M1时缓慢加入抗生素并逐渐搅拌，使菌液中的抗生素终浓度达到100250MG/L，即可制成抗污染根瘤菌剂。0018进一步地，所述的根瘤菌是红豆草根瘤菌或苜蓿根瘤菌。0019进一步地，所述的抗污染根瘤菌剂可在1015的温度范围内保存，或在其中加入灭菌泥炭。0020下面具体阐述本发明与现有技术相比的有益效果，并通过实验数据进一步加以证明。00211、有效降低菌剂的污染率0022由于该方法在菌剂中添加抗生素，在生产和运输途中即使有少量杂菌接触到菌剂，也会由于抗生素的作用无法生存或受到抑制而使杂菌无法大量繁殖。降低了菌剂的污染机率和污染程度。0023试验证明在高杂菌污染环境下放置90。
11、D后，普通固体菌剂的平均杂菌含量为227108CFU/G，杂菌率达1953，而含抗生素的菌剂中杂菌污染率较低，如含200MG/L氨苄青霉素的防污染固体菌剂平均杂菌率仅为0317，杂菌中真菌和细菌的含量比普通菌剂分别降低145倍和1112倍，能够有效降低杂菌的污染。00242、活菌数高0025根瘤菌株经过诱变和筛选后，具备抗生素耐药性，不管在有无抗生素的环境下均生长良好，性质稳定。防污染菌剂在贮藏过程中，随着菌剂水分的散失，抗生素的浓度略有增大，对菌株产生微弱的代谢抑制，可促使菌株快速进入休眠状态，减少了在储存过程中由于菌株代谢旺盛，营养过度消耗而逐渐增大的菌株死亡率，提高了活菌数量。0026试。
12、验证明红豆草和苜蓿抗污染固体根瘤菌剂在保存65D后活菌含量分别达到626109CFU/G和2111010CFU/G，分别是其普通固体菌剂活菌含量的30241和41865，统计分析表明差异极显著P001。00273、抑制土著根瘤菌，提高占瘤率说明书CN101935238A3/4页50028抗污染菌剂在使用时，其中的抗生素在稀释后浓度降低，但仍可对土著根瘤菌起到抑制的作用，为目的菌株创造利于竞争结瘤的环境，使占瘤率增大，菌剂肥效作用更为明显。0029试验证明将筛选出的菌株制备成普通菌剂和添加了200MG/L氨苄青霉素的抗污染菌剂，通过含抗生素平板检测法分别对使用普通菌剂和抗污染菌剂处理的苜蓿或红豆。
13、草植株上的根瘤进行检测，普通菌剂目的菌株的平均占瘤率为5807红豆草和7312苜蓿，而抗污染菌剂处理的植株，目的菌株的占瘤率为6867红豆草和8933苜蓿，差异显著P005。00304、抑制土壤群落中的有害菌，减少农药使用量0031抗生素对很多的土壤病原菌有很好的抑制作用。由于根瘤菌剂多用于拌种和苗期使用，菌剂中抗生素的降解过程与植物的生长过程同步，在降解完成、药效失去作用之前，可以为幼苗期植株根系提供保护，减少农药的使用量，降低了土壤的农药污染。00325、降低菌剂生产过程对无菌环境的要求0033该技术通过菌剂本身的抗污染特性，能够降低菌剂生产过程中对无菌环境的严格要求，使菌剂生产厂家在设备。
14、和厂房上减少了投入，在保证品质的前提下降低了菌剂的生产成本。00346、使用简便，易于掌握0035该技术涉及的耐药性菌株选育方法便于操作，能够适应一般的生产和研发环境。00367、适宜于规模推广和应用0037该方法可直接利用现有常规菌剂的生产设备，不需要进行设备的改造和更新，仅需在工艺流程上做相应的调整，菌株的诱变方法简便易行，抗生素和泥炭等原料易于获得。因此降低了企业的技术改造和生产成本，适宜于规模化生产和大范围的推广应用。具体实施方式0038以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。0039实施例10040通过利用微波照射。
15、800W，1MIN，200ML菌液，菌液600NM光吸收值为05处理高效促生红豆草根瘤菌RHIZOBIUMONOBRYCHISVICILFOLIA和苜蓿根瘤菌RHIZOBIUMMELILOTI的发酵菌液，将处理后的红豆草根瘤菌和苜蓿根瘤菌菌液分别涂布于含氨苄青霉素300MG/L和400MG/L的YMA培养基上，将在含药培养基上能够正常生长的根瘤菌株进行红豆草苜蓿植株的回接试验以测定其结瘤能力和促生效果。对结瘤能力和促生效果均强于出发菌株的突变菌株进行传代试验，最终选择耐药特性遗传稳定的菌株作为生产用耐抗生素根瘤菌菌株；0041诱导产生耐受氨苄青霉素环境300MG/L的红豆草根瘤菌突变菌株和耐受。
16、氨苄青霉素环境400MG/L的苜蓿根瘤菌突变菌株。这一微波诱变条件的正突变率最高，获得的根瘤菌突变菌株性状优良，遗传稳定的正突变菌株数量最多。0042将两种突变菌株接入YMA液体培养基，发酵培养至菌液活菌含量达到11010CFU/ML时缓慢加入氨苄青霉素并逐渐搅拌，使菌液中的氨苄青霉素终浓度达到200MG/L，将此说明书CN101935238A4/4页6菌液在1015的温度范围内保存，或将该菌液添加入灭菌泥炭即可制成防污染菌剂。0043200MG/L氨苄青霉素浓度对环境杂菌的抑制效果达到800MG/L浓度下的97，而抗性菌株的生长正常，菌株繁殖速度与无抗生素培养条件相同，加入灭菌泥炭制成防污染菌剂在储藏120D后的杂菌率仅为市面上购得的普通根瘤菌剂杂菌率的118947，统计分析表明差异极显著P001。0044最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明书。