蛋白质AGGF1及其FHA多肽在制备抗炎药物中的应用.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310157027.7 (22)申请日 2013.04.28 C07K 14/00(2006.01) A61K 38/16(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 7/01(2006.01) C12N 5/078(2010.01) A61P 31/00(2006.01) (73)专利权人 田小利 地址 100871 北京市海淀区颐和园路 5 号英 杰交流中心 316N (72)发明人 田小利 胡方园 张勇 (74)专利代理机构 。

2、北京三高永信知识产权代理 有限责任公司 11138 代理人 王惠 CN 102755638 A1,2012.10.31, CA 2535976 A1,2005.03.03, Li,M.H. 等 .GenBank ： NP_060516.2.GenBank .2012, Xiao-Li Tian 等 .Identification of an angiogenic factor that when mutated causes susceptibility to KlippelTrenaunay syndrome.Nature .2004, 第 427 卷第 640-645 页 . (54) 发。

3、明名称 蛋白质 AGGF1 及其 FHA 多肽在制备抗炎药物 中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种新的具有强烈抗炎蛋白质 AGGF1及其FHA多肽， 包括在制备抗炎药物中的应 用， 属于生物医药领域。本发明通过克隆、 表达如 序列表中 SEQ ID NO:1 所示的 FHA 多肽和如序列 表中SEQ ID NO:2所示的蛋白质AGGF1， 并检验所 述FHA多肽、 蛋白质AGGF1在内皮细胞HUVEC与单 核细胞 U937 细胞粘附过程中的作用、 对内皮细胞 HUVEC中炎症因子E-Selectin、 ICAM、 IL-8的表达 作用以及对 NF-B 启动子活性的抑制作用， 发现 所述F。

4、HA多肽、 所述蛋白质AGGF1能够抑制血管内 皮的激活， 进而抑制血管炎症的发生。因此， 本发 明提供的氨基酸序列含有或由如序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO ： 2所示序列组成的多肽可有效 用于制备抗炎药物， 为制备广谱抗炎药物、 为预防 或治疗炎症相关疾病奠定了基础。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘新蕾 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书12页 序列表12页 附图2页 (10)授权公告号 CN 103254296 B (45)授权公告日 2015.03.25 CN 103254296 B 1/1 页 2 1。

5、.一种多肽在制备抗炎药物中的应用， 所述多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO ： 2 所示。 2. 多核苷酸在制备抗炎药物中的应用， 所述多核苷酸编码氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO ： 2 所示的多肽。 3. 含有权利要求 2 的多核苷酸的载体在制备抗炎药物中的应用。 4. 如权利要求 3 所述的载体在制备抗炎药物中的应用， 所述载体为质粒载体或腺病毒 载体。 5. 一种含有权利要求 3 或 4 所述的载体的宿主细胞在制备抗炎药物中的应用。 6. 如权利要求 5 所述的宿主细胞在制备抗炎药物中的应用， 其中所述的宿主细胞为微 生物。 7. 一种携带权利要求 4 所述的腺病毒载。

6、体的血管内皮细胞在制备抗炎药物中的应用。 8. 药物组合物在制备抗炎药物中的应用， 所述药物组合物含有氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO ： 2 所示的多肽以及药学上可接受的载体。 权 利 要 求 书 CN 103254296 B 2 1/12 页 3 蛋白质 AGGF1 及其 FHA 多肽在制备抗炎药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医药领域， 特别涉及一种蛋白质 AGGF1 及其 FHA 多肽在制备抗炎 药物中的应用。 背景技术 0002 炎症是指具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应， 炎症对机体损 伤的局部组织所呈现的反应称为炎症反应。血管炎症反应是炎症反应。

7、的中心环节。炎症反 应可以导致多种人类疾病的发生， 如心血管疾病、 神经退行性疾病、 代谢疾病、 肿瘤以及衰 老等。而在炎症疾病的发展过程中， 血管炎症反应是炎症反应的必然反应。而血管炎症会 导致心血管疾病如动脉粥样硬化与急性冠脉综合症等疾病的发生， 严重影响着人们的生活 质量， 甚至给患者带来生命危险。 0003 血管内皮细胞的激活是驱动血管炎症反应的重要步骤之一。血管内皮细胞的激 活表现为内皮细胞与单核细胞之间的黏附增加 ； 黏附因子如 E-Selectin、 ICAM， 趋化因 子 IL-8 等表达增加。因此抑制内皮细胞与单核细胞之间的黏附反应， 减少黏附因子如 E-Selectin、 。

8、ICAM， 趋化因子 IL-8 等表达， 从而抑制血管内皮的激活， 可以有效地抑制血管 炎症的发生， 有效地预防和 / 或治疗炎症相关疾病。 0004 已有研究表明， 通过抑制炎症相关因子， 如 E-Selectin、 ICAM-1、 IL-8 等的表达， 或是抑制 NF-KB 活性来实现抵抗炎症的作用， 同时， 抑制 E-Selectin、 ICAM-1、 IL-8 或其相 关的受体， 或是 NF-KB 信号通路也可以抑制炎症疾病的发生。以 Selectin 为例， 现在已有 多种抑制 E-Selectin 的化合物并用作药物试验的研究 （如表 1 所示） ， 以期达到抑制炎症相 关疾病的作。

9、用。 但是由于炎症疾病的异质性， 现有的抗炎药物只能特异性的治疗炎症疾病， 严重的限制了抗炎药物的应用和炎症疾病的治疗。 0005 0006 蛋白质 AGGF1， 又名 VG5Q， 在物种间高度保守， 含有 4 个结构域， 即 Coiled-coil， OCRE， FHA， G-patch。AGGF1 表达较广泛， 在血管内皮、 平滑肌以及肿瘤细胞中具有较高的 表达。AGGF1 具有强烈的促进血管新生的功能， 这在体外的 matrigel 成管模型与体内小鼠 后肢缺血模型中都得到了很好的验证。AGGF1 基因敲除的小鼠在胚胎 E8.5 天死亡。但是 说 明 书 CN 103254296 B 3。

10、 2/12 页 4 AGGF1 与血管炎症的关系目前尚无报道。 0007 FHA由65-100个氨基酸构成， 是一个物种间保守的结构域， 其结构示意图如图1所 示。尽管 FHA 的核心氨基酸在不同的物种中高度保守， 但其他氨基酸序列却高度异质。FHA 结构域存在于多种蛋白中， 如激酶， 磷酸化酶， 转录因子， 代谢酶等， 参与 DNA 损伤、 信号转 导、 蛋白降解等细胞内重要生理过程。另外， FHA 能够识别磷酸化的苏氨酸残基而与该磷酸 化蛋白结合。而关于 FHA 与血管炎症之间的关系目前尚无报道。 0008 AGGF1 核苷酸序列可用 pcDNA3.1-AGGF1 质粒为模板， 采用 PC。

11、R 扩增技术获得。 AGGF1 核苷酸序列如 SEQ ID NO:3 所示。 发明内容 0009 为了解决现有抗炎药物只能特异性治疗炎症疾病的问题， 本发明实施例提供了一 种蛋白质 AGGF1 及其 FHA 多肽的新用途， 具体是在制备抗炎药物中的应用。所述技术方案 如下 ： 0010 本发明的第一方面提供了一种多肽， 其氨基酸序列含有或由如序列表中 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO ： 2 所示序列组成。具体的， 如本发明实施例中所述， 一种 FHA 多肽， 其氨 基酸序列如序列表中 SEQ ID NO:1 所示， 由 74 个氨基酸构成 ； 如本发明实施例所述， 一种 AGG。

12、F1 蛋白质， 其氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO:2 所示。 0011 本发明的第二方面提供了与本发明第一方面提供的多肽氨基酸序列有 80%、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95%、 96、 97、 98、 99或 100同源性的多肽。 0012 本发明的第三方面提供了如本发明第一方面提供的多肽在制备抗炎药物中的应 用。具体的， 在本发明实施例中， 提供了如序列表中 SEQ ID NO:1 所示的 FHA 多肽和如序 列表中 SEQ ID NO:2 所示的 AGGF1 蛋白质在制备抗炎药物中的应用。如本。

13、发明实施例中 所述， 发明人比较了含有空病毒载体 （GFP） 的血管内皮细胞 HUVEC、 携带 AGGF1 序列病毒载 体 （AGGF1） 的血管内皮细胞 HUVEC、 携带 FHA 结构域缺失的 AGGF1 核苷酸序列的病毒载体 (d FHA-AGGF1)的血管内皮细胞HUVEC与单核白细胞U937的粘附作用， 发现与GFP组相比， AGGF1 蛋白可以明显抑制 HUVEC 与 U937 细胞之间的粘附， AGGF1 的 FHA 结构域缺失之后， AGGF1 的抑制作用减弱， 说明 FHA 结构域参与了抑制内皮细胞 HUVEC 与单核细胞 U937 细胞 粘附的过程， 具有抑制内皮细胞 H。

14、UVEC 与单核细胞 U937 细胞粘附的作用。 0013 同时， 本发明实施例中， 用空病毒载体 （GFP） 、 携带 AGGF1 序列病毒载体 （AGGF1） 、 携带 FHA 结构域缺失的 AGGF1 核苷酸序列的病毒载体 (d FHA-AGGF1) 检测所述 FHA 多肽、 所述蛋白质 AGGF1 对内皮细胞 HUVEC 中黏附因子 E-Selectin、 ICAM、 IL-8 表达的作用， 发 现， 蛋白质 AGGF1 可以明显减少内皮细胞 HUVEC 中黏附因子 E-Selectin、 ICAM 和趋化因子 IL-8 的表达， AGGF1 缺失 FHA 结构域之后， 对炎症分子的抑。

15、制作用明显减弱。说明 FHA 结构 域参与了抑制内皮细胞炎症因子表达的过程， 从而抑制血管内皮的激活， 可以有效地抑制 血管炎症的发生。 0014 另外， 本发明实施例中， 用空病毒载体 （GFP） 、 携带 AGGF1 序列病毒载体 （AGGF1） 、 携带FHA结构域缺失的AGGF1核苷酸序列的病毒载体(d FHA-AGGF1)检测所述FHA多肽、 所 述蛋白质 AGGF1 对 NF-B 启动子活性的抑制作用， 发现， 与 GFP 组相比， 所述蛋白质 AGGF1 说 明 书 CN 103254296 B 4 3/12 页 5 可以显著减弱 NF-B 启动子的活性， 从而抑制血管内皮的激活。

16、， 可有效的抑制血管炎症的 发生， 而缺失 FHA 结构域之后， AGGF1 对 NF-B 启动子活性的抑制作用明显减弱。 0015 综上所述， 本发明的如 SEQ ID NO:1 所示的 FHA 多肽和如 SEQ ID NO:2 所示的蛋 白质 AGGF1 可以明显抑制 HUVEC 与 U937 细胞之间的粘附、 减少内皮细胞 HUVEC 中黏附因子 E-Selectin、 ICAM 和趋化因子 IL-8 表达、 抑制 NF-B 启动子活性， 从而抑制血管内皮的激 活， 因此， 如 SEQ ID NO:1 所示的 FHA 多肽和如 SEQ ID NO:2 所示的蛋白质 AGGF1 可有效用 。

17、于制备抗炎药物， 氨基酸序列含有或由如序列表中 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO ： 2 所示序列 组成的多肽可有效用于制备抗炎药物。 0016 本发明第四方面提供了编码本发明第一方面提供的多肽的多核苷酸。 0017 本发明的第五方面提供了含有编码本发明第一方面提供的多肽的多核苷酸的载 体。在本发明实施例中， 具体为含有编码 FHA 多肽的多核苷酸的质粒载体 p-shuttle-FHA ； 以及含有编码所述蛋白质 AGGF1 的多核苷酸的质粒载体 p-shuttle-AGGF1。如本发明实 施例中所述， 分别将 AGGF1、 FHA 的多核苷酸插入 p-shuttle-IRES-。

18、GFP 质粒载体， 获取含 有 AGGF1 多核苷酸的质粒载体 p-shuttle-AGGF1 以及含有 FHA 的多核苷酸的质粒载体 p-shuttle-FHA。 0018 本发明的第六方面提供了含有所述质粒载体 p-shuttle-FHA 的宿主细胞或腺病 毒载体， 以及含有所述质粒载体 p-shuttle-AGGF1 的宿主细胞或腺病毒载体。正如本领域 技术人员能够想到的， 所述宿主细胞为微生物。 0019 具体的， 在本发明实施例中， 将所述质粒载体 p-shuttle-FHA 转入到腺病毒中， 构 建含有上述质粒载体的腺病毒载体 Adv-FHA， 将所述腺病毒载体 Adv-FHA 感。

19、染人胚胎肾细 胞， 对所述腺病毒载体进行扩增 ； 将所述质粒载体 p-shuttle-AGGF1 转入到腺病毒中， 构建 含有上述质粒载体的腺病毒载体 Adv-AGGF1， 将所述腺病毒载体 Adv-FHA 感染人胚胎肾细 胞， 对所述腺病毒载体进行扩增。 0020 本发明的第七方面提供了含有所述腺病毒载体 Adv-FHA 的血管内皮细胞 ； 含有所 述腺病毒载体 Adv-AGGF1 的血管内皮细胞。 0021 如本发明实施例中所述， 将构建的含有目的基因的腺病毒载体 Adv-FHA 转入到血 管内皮细胞HUVEC中， 使多肽FHA在血管内皮细胞HUVEC中进行表达 ； 将构建的含有目的基 因。

20、的腺病毒载体 Adv-AGGF1 转入到血管内皮细胞 HUVEC 中， 使目的蛋白 AGGF1 在血管内皮 细胞 HUVEC 中进行表达。 0022 本发明的第八方面提供了一种药物组合物， 所述药物组合物含有本发明第一方面 和第二发明提供的多肽以及药学上可接受的载体。 0023 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是 ： 0024 通过克隆、 表达如 SEQ ID NO:1 所示的 FHA 多肽和如 SEQ ID NO:2 所示的蛋白质 AGGF1， 并检验所述 FHA 多肽在内皮细胞 HUVEC 与单核细胞 U937 细胞粘附过程中的作用以 及检测所述 FHA 多肽对内皮细胞 HUVEC。

21、 中 E-Selectin、 ICAM、 IL-8 的表达的抑制作用以 及对 NF-B 启动子活性的抑制作用， 检验所述蛋白质 AGGF1 在内皮细胞 HUVEC 与单核细 胞 U937 细胞粘附过程中的作用以及检测所述蛋白质 AGGF1 对内皮细胞 HUVEC 中黏附因子 E-Selectin、 ICAM和趋化因子IL-8表达的抑制作用以及对NF-B启动子活性的抑制作用， 发现所述 FHA 多肽、 所述蛋白质 AGGF1 具有抑制内皮细胞 HUVEC 与单核细胞 U937 细胞粘附 说 明 书 CN 103254296 B 5 4/12 页 6 的作用、 减少内皮细胞 HUVEC 中黏附因子。

22、 E-Selectin、 ICAM 和趋化因子 IL-8 表达的作用以 及抑制 NF-B 启动子活性的作用， 从而抑制血管内皮的激活， 可以有效地抑制血管炎症的 发生。因此， 本发明提供的如 SEQ ID NO:1 所示的 FHA 多肽和如 SEQ ID NO:2 所示的蛋白 质 AGGF1 可有效用于制备抗炎药物， 氨基酸序列含有或由如序列表中 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO ： 2所示序列组成的多肽可有效用于制备抗炎药物， 为制备广谱抗炎药物、 为预防或治 疗炎症相关疾病奠定了基础。 。 附图说明 0025 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案， 下面将对实施例描述中所。

23、需要使 用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例， 对于 本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其他 的附图。 0026 图 1 是本发明实施例提供的 FHA 结构域结构示意图 ； 0027 图 2A 是本发明实施例提供的 western blot 检测结果 ： AGGF1 与 d FHA-AGGF1 的 表达结果示意图 ； 0028 图 2B 是本发明实施例提供的 western blot 检测结果 ： FHA 的表达结果示意图 ； 0029 图 3A 是本发明实施例提供的血管内皮细胞与单核白细胞粘附结果显微镜照片。

24、示 意图 ； 0030 图 3B 是本发明实施例提供的单核白细胞粘附数目统计结果直方图 ； 0031 图 4A 是本发明实施例提供的粘附因子 E-Selectin 表达结果示意图 ； 0032 图 4B 是本发明实施例提供的粘附因子 ICAM 表达结果示意图 ； 0033 图 4C 是本发明实施例提供的趋化因子 IL-8 表达结果示意图 ； 0034 图 5 是本发明实施例提供的 NF-B 启动子活性双荧光素酶报告基因检测结果。 具体实施方式 0035 为使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合附图对本发明实施方 式作进一步地详细描述。 0036 实施例 1 ： 获取 AGGF1。

25、、 d FHA-AGGF1、 FHA 的核苷酸序列。 0037 方法 ： 用pcDNA3.1-AGGF1质粒为模板， 采用PCR技术扩增AGGF1， d FHA-AGGF1， FHA 核苷酸序列。 0038 材 料 ： pcDNA3.1-AGGF1 质 粒 （获 取 方 法 参 见 Tian XL,Kadaba R,You SA,Liu M,Timur AA,Yang L,Chen Q,Szafranski P,Rao S,Wu L,Housman DE,DiCorleto PE,Driscoll DJ,Borrow J,Wang Q.Identifi cation of an angioge。

26、nic factor that when mutated causes susceptibility to Klippel-Trenaunay syndrome.Nature.2004Feb12;4 27(6975):640-645.） ， 常规 PCR 试剂， 正向引物和反向引物 （由北京奥科鼎盛生物科技有限 公司合成） ,PCR 产物纯化试剂盒 ( 由博迈德公司提供 )。 0039 步骤 ： 0040 1、 PCR 反应 （聚合酶链式反应） 0041 1） 引物包括 ： 说 明 书 CN 103254296 B 6 5/12 页 7 0042 AGGF1-subclone-F ： 如 SE。

27、Q ID NO:4 所示 ； 0043 AGGF1-subcloneR ： 如 SEQ ID NO:5 所示 ； 0044 dFHA-AGGF1-cloneF ： 如 SEQ ID NO:6 所示 ； 0045 dFHA-AGGF1-cloneR ： 如 SEQ ID NO:7 所示 ； 0046 FHA-cloneF ： 如 SEQ ID NO:8 所示 ； 0047 FHA-cloneR ： 如 SEQ ID NO:9 所示。 0048 2） PCR 反应体系 （25L） 0049 0050 3） PCR 反应条件 0051 0052 2)4) 共进行 35 个循环。 0053 2、 PC。

28、R 产物的纯化 ： 使用博迈德公司提供的 PCR 产物纯化试剂盒对产物进行纯化， 包括如下步骤 ： 0054 （1）通过 PCR 反应得到 25L PCR 反应产物， 加入 75L ddH2O 与其混合， 加入 500L 结合液， 混合均匀后转入离心纯化柱内结合数分钟。室温， 13000rpm， 离心 2min， 倒 掉废液。 0055 （2） 加入500L漂洗液， 室温， 13000rpm， 离心30s， 倒掉废液。 重复此步操作一次。 0056 （3） 不加入液体， 室温， 13000rpm， 离心 2min。 0057 （4） 将纯化柱套入干净的 1.5mL EP 管内， 加入 40L 。

29、ddH2O（55预热） 于 DNA 吸 附膜上， 不能沾附在管壁。放置 2min 后， 室温， 13000rpm， 离心 1min， 得到的即为纯化后 PCR 产物。 0058 （5） 取纯化后 PCR 产物进行 0.8% 琼脂糖凝胶电泳， 使用 NanoDrop. 紫外可见分光 光度计 （由 Thermo Fisher 公司提供） 测浓度。 0059 3、 PCR 产物测序 说 明 书 CN 103254296 B 7 6/12 页 8 0060 1） PCR 产物测序反应体系 （10L） 0061 0062 0063 2） PCR 产物测序反应条件 0064 0065 2)-4) 共进行 。

30、35 个循环。 0066 3） 纯化 PCR 测序产物 0067 （1） 对每管测序产物加入 1L125mM EDTA 和 1L3M NaAc， 瞬离 ； 0068 （2） 加入 25L 无水乙醇， 吹吸混匀， 室温放置 15min ； 0069 （3） 4， 4000rpm， 离心 30min， 马上倒置， 离心到 300rpm 即停 ； 0070 （4） 加入 35L70% 乙醇， 4， 4000rpm， 离心 15min， 马上倒置， 300rpm， 离心 30s ； 0071 （5）等残余的乙醇挥发后， 加入 10L Hi-Di 甲酰胺， 95变性 4min， 马上冰置 5min， 样。

31、品上 ABI3130XL 基因分析仪电泳。 0072 4、 PCR 产物分析 0073 将步骤 3 测序得到的核苷酸序列与 NCBI 数据库中记录的 AGGF1 序列进行对比分 析。所用核苷酸参考序列如 SEQ ID NO:3 所示。 0074 结果 ： 经过将测序后得到的序列与 NCBI 中的序列相对比， 证实成功获得 AGGF1， d FHA-AGGF1（去掉 FHA 的 AGGF1） ， FHA 的核苷酸序列。 0075 实施例二 ： 制备含有实施例一所得的核苷酸序列的质粒载体 0076 方法 ： 将实施例一所得的 AGGF1， d FHA-AGGF1， FHA 的核苷酸序列分别插入 p。

32、-shuttle-IRES-GFP质粒载体， 获取含有AGGF1核苷酸序列的质粒载体， 含有d FHA-AGGF1 核苷酸序列的质粒载体， 含有 FHA 核苷酸序列的质粒载体。 0077 材料 ： p-shuttle-IRES-GFP 质粒 （由 stratagene 公司提供） ， 限制性内切酶、 T4DNA 连接酶 （由 NEB 公司提供） ， DH5a 感受态细胞 （由天根生化 （北京） 科技有限公司提供） ， 质粒 提取试剂盒 （由博迈德公司提供） 。 0078 步骤 ： 说 明 书 CN 103254296 B 8 7/12 页 9 0079 1将实施例一获得的 3 种 PCR 产物。

33、与 p-shuttle-IRES-GFP 质粒酶切 6 小时， 使 用博迈德公司 PCR 产物纯化试剂盒分别回收 PCR 产物的酶切产物和 p-shuttle-IRES-GFP 质粒的酶切产物， 方法同实施例一中的 PCR 产物纯化的过程 ； 0080 2将 PCR 产物的酶切产物分别与 p-shuttle-IRES-GFP 质粒的酶切产物在 10ul 反应体系中进行连接反应， 加入 T4DNA 连接酶， 16连接 12 个小时， 获得连接产物 ； 0081 3将 150ng 连接产物加入到 DH5a 感受态细胞 （2X107个） 溶液中， 于 42 度热激 90s， 得到含有连接产物的 DH。

34、5a 感受态细胞 ； 0082 4将上述步骤 3 得到的细胞溶液加入到无抗性 LB 培养基中， 常温下摇床培养 40 分钟 ； 0083 5将上述步骤 4 得到的菌液加入到卡那霉素抗性的细菌培养皿上， 于 37培养 18 个小时 ； 0084 6挑取菌落， 接种到无抗性 LB 培养基中， 常温下摇床培养 18 小时， 采用质粒提取 试剂盒从菌液中提取质粒 p-shuttle-AGGF1， p-shuttle-d FHA-AGGF1， p-shuttle-FHA ； 0085 7 将步骤 6 所得质粒进行测序， 方法同实施例一中步骤 3PCR 产物测序方法 ； 0086 8 将测序得到的核苷酸序。

35、列与 NCBI 数据库中记录的 AGGF1 序列进行对比分析， 所 用核苷酸参考序列如 SEQ ID NO:3 所示。 0087 结果 ： 经过将测序后得到的序列与 NCBI 中的序列相对比， 证实成功获得含有含有 AGGF1核苷酸序列的质粒载体p-shuttle-AGGF1， 含有d FHA-AGGF1核苷酸序列的质粒载体 p-shuttle-d FHA-AGGF1， 含有 FHA 核苷酸序列的质粒载体 p-shuttle-FHA。 0088 实施例三 ： 腺病毒载体的构建与纯化 0089 目的 ： 构建含有实施例二所得质粒载体的腺病毒载体， 并进行扩增与纯化。 0090 材料 ： p-sh。

36、uttle-AGGF1， p-shuttle-d FHA-AGGF1， p-shuttle-FHA， HEK293A （购买 于 ATCC） 、 HUVEC 细胞 （购买于 ATCC） ， CsCl（1.4g/ml 与 1.2g/ml） ， PmeI 内切酶 （由 NEB 公 司提供） ， PacI 内切酶 （由 NEB 公司提供） ， BJ5183 感受态细菌 （由 addgene 公司提供） ， 病毒 纯化柱 （GE healthcare CaptoTMDeVirS.Capto DeVirS） 。 0091 步骤 ： 0092 1. 将 p-shuttle-AGGF1、 p-shuttle。

37、-d FHA-AGGF1、 p-shuttle-FHA 进行 PmeI 线性 化酶切， 回收酶切片段 ； 0093 2.shuttle 质粒和 pAdeasy-1Vector（由 Stratagene 公司提供） 共电转 BJ5183 感 受态细菌 ； 0094 3. 提取卡那霉素阳性质粒， PacI 酶切后转染 HEK293A 细胞 ； 0095 转染方法 0096 （1） 将 HEK293A 细胞传代至 6 孔板中， 24 小时后 （细胞密度达到 70%-80%） ， 进行转 染 ； 0097 （2） 吸取培养液， 加入新鲜 DMEM（10%FBS） 2mL， 37， 5%CO2 条件下培。

38、养 ； 0098 （3） 配制转染试剂 ： 取 2L VigoFect 转染试剂加入到 98L 生理盐水中， 柔和混 匀， 放置 5min ； 取待转染质粒 5ng， 加入生理盐水将其稀释到 100L ； 将稀释好的转染试剂 缓慢加入到质粒稀释液中， 混合均匀， 放置 20min ； 0099 （4） 将反应好的 200L 转染溶液加入到 6 孔板中的 1 孔细胞中。 说 明 书 CN 103254296 B 9 8/12 页 10 0100 4.7 天后收取细胞， 并继续感染 HEK293A 细胞进行病毒扩增 ； 0101 5. 最后将 20 盘 150mm 培养皿中所有的细胞离心收集到 3。

39、ml 病毒保存液 （10mm tris-Hcl） ； 0102 6. 将细胞反复冻融 3 次， 离心取上清， 即为所获得的病毒。 0103 7.CsCl 密度梯度离心病毒 ； 0104 8. 纯化病毒， 最终病毒溶解于 10mm Tris-Hcl 中 ； 0105 9. 分装病毒， -80 度冰箱保存 ； 0106 10. 用逐级稀释法感染 HEK293A 细胞， 估测病毒滴度。 0107 结果 ： 获得纯化的含有目的基因的腺病毒载体 ： Adv-AGGF1、 Adv-d FHA-AGGF1、 Adv-FHA。 0108 实施例四 ： 实施例三获得的腺病毒载体在 HUVEC 细胞中表达蛋白 A。

40、GGF1 和 FHA 多 肽 0109 目的 ： 检测实施例三获得的腺病毒是否可以在内皮细胞中表达目的蛋白。 0110 材料 ： PBS， 蛋白裂解液， 蛋白酶抑制剂， 磷酸酶抑制剂， BCA 试剂盒， 丙烯酰胺， 聚丙烯酰胺， 过硫酸铵， TEMED， 蛋白电泳系统， NC 模， flag 与 GAPDH 抗体 （上述试剂均由 santacruz 公司提供） 。 0111 方法 ： 0112 1使用时， 将上述病毒在冰上融化， 按病毒滴度为50MOI感染HUVEC细胞， 并将感染 HUVEC 细胞培养于含有 5% 血清 （ScienCell) 的 ECM 培养基上， 于 37 度， 5% 二。

41、氧化碳浓度下 进行培养 ； 0113 2感染HUVEC细胞培养24小时后， 提取细胞蛋白， western blot检测AGGF1和FHA 的表达。 0114 western blot 检测方法如下 ： 0115 1） 蛋白质提取 0116 细 胞 用 PBS 洗 两 次， 置 冰 上， 加 1ml PBS（含 1%PI） ， 用 细 胞 刮 将 细 胞 刮 下 4 13000rpm 离心 5min 沉淀加入 200l PBS（含 1%PI） 及 50l5 蛋白裂解液， 冰 浴 10min 60% 功率超声破碎 30s （(5s+5s)6） 冰浴过夜 4 13000rpm 离心 10min 上。

42、清用 BCA 试剂盒测定浓度保存于 -20。 0117 2） SDS-PAGE 胶蛋白质电泳 0118 依次配置浓缩胶与分离胶40ug蛋白样品与5上样缓冲液按4 ： 1体积比混合， 100 3min 冰浴上样， 于 1 电泳缓冲液中 150V 恒压电泳 70min。 0119 不同浓度浓缩胶与 4% 分离胶配方如下 ： 0120 说 明 书 CN 103254296 B 10 9/12 页 11 0121 3） 转膜和杂交 0122 使用转膜装置， 在转膜缓冲液中将 SDS-PAGE 胶上的蛋白质用湿转法电转到 PVDF 膜上， 恒流 250mA2h 膜浸泡在 5%BSA 中封闭 1h 用封闭。

43、液适当稀释的一抗于 4孵育过 夜TBST洗15min3次用封闭液适当稀释的二抗于室温孵育30minTBST洗10min3 次 Odyssey 扫描。 0123 结果 ： 如图 2 所示， 图 2A 为 AGGF1 与 d FHA-AGGF1 的表达结果， 图 2B 为 FHA 的表 达结果。 由于克隆的AGGF1、 d FHA-AGGF1、 FHA均含有flag标签序列， 在进行western blot 时采用 flag 抗体， 可以检测到阳性条带， 条带大小与预期相符合。因此， 本发明实施例成功 获得腺病毒载体 Adv-AGGF1、 Adv-d FHA-AGGF1、 Adv-FHA， 并在内。

44、皮细胞中成功表达出蛋白。 0124 实施例五、 蛋白质 AGGF1、 FHA 多肽在抗血管炎症方面的应用。 0125 1、 AGGF1 与 FHA 抑制内皮细胞 HUVEC 与单核白细胞 U937 之间的粘附作用。 0126 目的 ： 检测AGGF1、 FHA对内皮细胞HUVEC与单核白细胞U937之间的粘附反应的作 用。 0127 材料 ： Adv-AGGF1、 Adv-d FHA-AGGF1、 Adv-FHA， 血管内皮细胞HUVEC （购买于ATCC） ， 单核白细胞 U937（购买于 ATCC） ， TNF-a（由 peprotech 公司提供） ， 显微镜 (Olympus)。 01。

45、28 步骤 ： 0129 1） 将 Adv-GFP（空病毒载体） 、 Adv-AGGF1、 Adv-d FHA-AGGF1、 Adv-FHA， 分别感染血 管内皮细胞 HUVEC， 处理 18 小时， 使蛋白在细胞中可以表达 ； 0130 2） 将血管内皮细胞 HUVEC 进行无血清饥饿培养 6 小时 （0.5% 血清） ； 0131 3） 加入终浓度为 20ng/ml 的 TNF-a 因子处理细胞 ； 0132 4） 6 小时后， 加入单核白细胞 U937， 与 HUVEC 细胞共培养 ； 0133 5） 1 小时后， 用 PBS 缓冲液清洗掉没有粘附到 HUVEC 上面的 U937， 显微。

46、镜拍照并统 计粘附的 U937 细胞数目。 0134 结果 ： 0135 如图3所示， 其中， 图3A中， 贴壁的卵石状底层细胞为HUVEC， 而圆形的上层细胞为 粘附的 U937 细胞。图 3B 中， 与 GFP 组相比， AGGF1 蛋白可以明显抑制 HUVEC 与 U937 细胞 之间的粘附， 而去掉 FHA 结构域之后， AGGF1 的抑制作用减弱。说明 FHA 参与了抑制内皮细 胞 HUVEC 与单核白细胞 U937 细胞之间粘附的过程。 0136 2、 AGGF1、 FHA 抑制炎症因子 E-Selectin、 ICAM、 IL-8 的表达 0137 目的 ： 检测 AGGF1 与。

47、 FHA 是否参与抑制炎症因子 E-Selectin、 ICAM、 IL-8 的表达。 0138 材料 ： TRIzol， PBS, 氯仿 , 异丙醇 , 去离子甲酰胺 ,3M NaAc， Adv-AGGF1、 Adv-d 说 明 书 CN 103254296 B 11 10/12 页 12 FHA-AGGF1、 Adv-FHA， 血管内皮细胞 HUVEC （购买于 ATCC） ， 单核白细胞 U937 （购买于 ATCC） ， TNF-a（由 peprotech 公司提供） ， 引物 （由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成） 。 0139 步骤 ： 0140 1） 将 Adv-GFP（空病毒载。

48、体） 、 Adv-AGGF1、 Adv-d FHA-AGGF1、 Adv-FHA， 分别感染血 管内皮细胞 HUVEC， 处理 18 小时， 使蛋白在细胞中可以表达 ； 0141 2） HUVEC 进行无血清饥饿培养 6 小时 ； 0142 3） 加入 TNF-a 因子处理细胞， 使 TNF-a 最终的浓度为 20ng/ml ； 0143 4） 6 小时后， 去掉培养基， PBS 清洗细胞 ； 0144 5） 用 Trizol 裂解细胞， 酚氯仿法提取细胞 RNA。之后进行反转录。 0145 6） RNA 提取 ： 0146 a) 细胞处理 ： 将 6 孔板细胞的培养基吸弃， 用 1mL PB。

49、S 缓冲液洗两遍后， 加入 1mL TRIzol， 将所有细胞吹打下来， 随 TRIzol 溶液一起转入新鲜灭菌的 1.5mL EP 管中， 室温放 置数分钟， 使核酸蛋白复合物完全分离。 0147 b)氯仿抽提 ： 每使用1mL TRIzol加入0.2mL氯仿， 剧烈震荡15秒， 4， 13000rpm， 离心 5-10min。样品分为三层 ： RNA 主要在最上层水相中， 水相体积约为所用 TRIzol 试剂的 60 。 0148 c) 异丙醇沉淀 RNA ： 用微量移液器将水相转移到新鲜灭菌的 1.5mL Ep 管中， 加入 等体积的异丙醇沉淀水相中的 RNA， -20放置 20-30 分钟。4， 13000rpm， 离心 15min， 吸 弃上清。 0149 d) 溶解保存 RNA ： RNA 用 200L100 的去离子甲酰胺震荡溶解， 65溶解 30 分 钟， 测浓度， -80保存。 0150 e)RNA 重沉淀 ： 取 10g 溶有 RNA 的甲酰胺溶液， 加入 3 倍以上体积的新鲜灭菌 ddH2O。加入 1/10 体积的 3M NaAc （pH5.2） ， 再加入等体积的异丙醇， 颠倒混匀， 。