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1、(10)授权公告号 CN 101870971 B (45)授权公告日 2012.09.26 CN 101870971 B *CN101870971B* (21)申请号 201010169353.6 (22)申请日 2010.04.21 10-2009-0035638 2009.04.23 KR C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (73)专利权人 株式会社 LG 生命科学 地址 韩国首尔市 (72)发明人 李东焕 姜镇锡 朴荣石 金东铉 (74)专利代理机构 隆天国际知识产权。
2、代理有限 公司 72003 代理人 吴小瑛 吕俊清 CN 1626677 A,2005.06.15, WO 03106714 A1,2003.12.24, WO 2008044129 A2,2008.04.17, WO 03093797 A2,2003.11.13, 全文 . JinRong Zhao et al.Detection of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using Taqman-MGB probe technology.World Journal Of Gastroenterology .2005, 第 11 卷 ( 第 4 期 。
3、),508-512. Qingrun Zhang et al.Universal primers for HBV genome DNA amplification across subtypes: a case study for designing more effective viral primers.Virology Journal .2007, 第 4 卷 ( 第 1 期 ),92. (54) 发明名称 使用实时 PCR 检测 HBV 的方法 (57) 摘要 本发明涉及乙肝病毒 (HBV) 基因的检测。更 具体地， 本发明涉及与 HBV 基因互补的引物对， 包 含与 HBV 基因互补。
4、的引物对和探针的 HBV 检测用 组合物， 包括所述组合物的 HBV 检测试剂盒， 以及 用于检测 HBV 基因的方法。 (30)优先权数据 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 吕小蒙 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 3 页 附图 2 页 1/1 页 2 1.用于通过实时PCR检测HBV基因的组合物， 其包含两组引物对和探针， 其中一组引物 对和探针由 SEQ ID NO.7 所示的探针以及 SEQ ID NO.1 和 2 所示的引物对组成， 另一。
5、组引 物对和探针由 SEQ ID NO.8 所示的探针以及 SEQ ID NO.3 和 4 所示的引物对组成。 2. 如权利要求 1 所述的组合物， 其中所述组合物还包含作为内标且没有显示出竞争性 抑制的 SEQ ID NO.5 和 6 所示的引物对和 SEQ ID NO.9 所示的探针。 3. 如权利要求 1 所述的组合物， 其还包含 HS-Taq、 缓冲液、 dNTP 或蒸馏水。 4. 如权利要求 3 所述的组合物， 其包含各为 100M 的 SEQ ID NO.1-4 的引物、 各为 100M 的 SEQ ID NO.7 和 8 的探针、 2.5U HS-Taq 和 2mMdUTP。 5。
6、. 如权利要求 1 所述的组合物， 其中所述探针包含在 5 和 3 端的荧光分子。 6. 如权利要求 5 所述的组合物， 其中所述在 5 端的荧光分子为选自由 6- 羧基荧光 素、 六氯 -6- 羧基荧光素、 四氯 -6- 羧基荧光素、 5- 羧基荧光素、 2 ， 4 ， 5 ， 7 - 四氯 -6- 羧 基 -4， 7- 二氯荧光素和花菁 -5 组成的组中的任意一种。 7. 如权利要求 5 所述的组合物， 其中所述在 3 端的荧光分子为选自由 6- 羧基四甲 基 - 罗丹明、 5- 羧基四甲基罗丹明以及黑洞淬灭剂 1、 2 和 3 组成的组中的任意一种。 8. 用于检测 HBV 的试剂盒， 。
7、其包含权利要求 1-7 中任一项所述的组合物。 权 利 要 求 书 CN 101870971 B 2 1/9 页 3 使用实时 PCR 检测 HBV 的方法 技术领域 0001 本发明涉及乙肝病毒基因的检测。更具体地， 本发明涉及与 HBV 基因互补的引物 对， 包含与 HBV 基因互补的引物对和探针的 HBV 检测用组合物， 包含所述组合物的 HBV 检测 试剂盒， 以及用于检测 HBV 基因的方法。 背景技术 0002 已知乙肝病毒(下文称为HBV)是病毒性肝炎的主要原因， 据估计在世界范围内有 20 亿人感染 HBV。在这些感染人群中， 约 3.5 亿人是慢性携带者， 且大多数人有逐渐发。
8、展 为肝硬化和肝细胞癌的风险。HBV 包膜基因由 preS 区 ( 包含 preS1 和 preS2) 以及 S 区组 成。在全部包膜基因转录后， 分别通过在三个区中每一个的可变翻译来合成三个包膜蛋白 (L 蛋白、 M 蛋白和 S 蛋白 )。翻译起始于 preS1 区的 L 蛋白由约 400 个氨基酸组成， 所述氨 基酸包含全部的 preS1 域、 preS2 域和 S 域。翻译起始于 preS2 区的 M 蛋白由约 281 个氨 基酸组成， 所述氨基酸包含 preS2 域和 S 域。S 蛋白由约 226 个氨基酸组成， 所述氨基酸仅 包含 S 域， 其表达量最大， 从而成为病毒颗粒的主要组分。
9、。包膜蛋白的 S 域彼此结合以形成 作为 S 抗原的颗粒。M 蛋白和 L 蛋白中包含的 preS1 和 preS2 域位于所述颗粒的外侧， 且起 到诱导高免疫应答的 preS 抗原的作用。 0003 HBV感染的诊断可通过检测样品中存在的抗HBV抗体， 检测HBV抗原或检测HBV基 因来进行。 0004 HBV 抗原的检测方法通常使用 HBV 表面抗原 (HBsAg) 或 HBV e 抗原 (HBeAg) 作为 诊断标记物来检测其是否存在于血液中。然而， 病毒的生命周期会妨碍 HBV 感染的早期诊 断。在治疗期间， HBV 感染患者血液中 HBsAg 或 HBeAg 的减少或缺失也会妨碍对患者。
10、体内 HBV 的正确诊断。 0005 HBV基因检测可通过核酸扩增技术(NPT)或DNA探针法进行。 目前， 这些方法广泛 地用在临床实践中。特别地， PCR 是选择性地将少量靶基因扩增到可检测水平的方法， 因此 得到广泛的应用。然而， 问题在于 DNA 提取方法不可避免地导致 DNA 损失。例如， 即使样品 包含足量的靶 DNA 以作为扩增模板， 但由于提取过程中的损失， 无法回收到适合用于扩增 的量的 DNA， 导致模板扩增效率降低。因此， 难以充分扩增并检测样品中的靶 DNA。因此， 此 技术产生假阴性结果， 且由此而难以保证结果的正确性。 即使使用相同的样品， 提取过程中 DNA 产量。
11、的变化也会产生不同的结果， 导致缺乏重复性。也就是说， DNA 扩增技术的问题在 于其要求 DNA 提取过程引起样品中痕量靶 DNA 损失， 从而使检测灵敏度降低。此外， 当样品 液体中包含扩增抑制剂(如肝素、 表面活性剂、 蛋白变性剂、 有机溶剂等)时， 扩增效率也降 低， 从而使检测灵敏度减小。 0006 此外， 遗传变异极低的区， 如 S 蛋白区、 前核心区 (pre-Core region) 或包膜蛋白 可用于通过 PCR 的 HBV 检测。然而， 这些区也具有低概率的变异， 如突变。如果在碱基序列 中发生遗传变异， 使用 PCR 引物和 / 或探针的扩增步骤失败。因此， 由于扩增效率。
12、的降低导 致获得假阴性的结果或降低检测灵敏度。因此， 难以保证准确的定量。 说 明 书 CN 101870971 B 3 2/9 页 4 发明内容 0007 技术问题 0008 本发明的发明人已进行了许多努力来解决这些问题。 本发明的发明人已经开发出 使用样品中包含的痕量靶 HBV 基因来准确且快速地检测并定量 HBV 基因的方法， 以及同时 检测并定量具有极小遗传变异 ( 如突变 ) 的 HBV 基因两个区的方法。根据这些方法， 即使 在基因的一个区中发生通过突变的遗传变异， 也能够检测此基因的其它区， 从而高灵敏度 和特异性地完成疑似感染 HBV 患者的正确诊断， 从而完成本发明。 000。
13、9 技术方案 0010 本发明的目的是提供与HBV基因互补的引物对， 其碱基序列如SEQ IDNO.1和2， 或 SEQ ID NO.3 和 4 所示。 0011 本发明的另一个目的是提供用于检测 HBV 基因的组合物， 其包含具有碱基序列 SEQ ID NO.1 和 2 的引物对、 具有碱基序列 SEQ ID NO.3 和 4 的引物对和具有 SEQ ID NO.7 和 8 所示碱基序列的探针。 0012 本发明的另一个目的是提供 HBV 检测试剂盒， 其包含所述用于检测 HBV 基因的组 合物。 0013 本发明的另一个目的是提供使用所述用于检测HBV基因的组合物来检测HBV基因 的方法。。
14、 附图说明 0014 图1是显示能够进行阳性检测和定量而没有内标对HBV特异性引物和探针竞争性 抑制的结果 ； 0015 图 2 显示 HBV 定量标准的线性 ； 0016 图 3 显示 PCR 结果， 其中分别进行 HBV S 蛋白和前核心区的扩增 ； 和 0017 图 4 显示 PCR 结果， 其中同时进行 HBV S 蛋白和前核心区的扩增。在该情况下， 检 测中同样没有竞争性抑制， 且定量中无显著差异。 0018 有益效果 0019 如上所述， 当通过本发明的实时PCR进行HBV感染的检测和定量时， 能够获得等于 或大于已知方法的灵敏度和特异性。 具体实施方式 0020 因此， 根据一个。
15、方面， 本发明涉及与 HBV 基因互补的引物对。优选地， 引物为具有 SEQ ID NO.1 和 2， 或 SEQ ID NO.3 和 4 所示碱基序列的引物对。 0021 如本文所用， 术语 “引物” 是指具有游离 3 羟基的短核酸序列， 其与互补的模板形 成碱基对， 并充当模板链复制的起点。在存在四种不同三磷酸核苷和聚合试剂的适合缓冲 液时， 引物能够在适合温度下启动 DNA 合成。根据本发明的一个方面， 引物为特异性扩增 HBV S 蛋白或 HBV 前核心区的引物。因此， 本发明的引物包含正向引物和反向引物的引物 对， 其与基因互补且具有 7-50 个碱基的序列， 优选 10-30 个碱。
16、基的序列。特别地， 可通过具 有碱基序列 SEQ ID NO.1 和 2 的引物对来特异性扩增 HBV S 基因区， 且可通过具有碱基序 说 明 书 CN 101870971 B 4 3/9 页 5 列 SEQ ID NO.3 和 4 的引物对来特异性扩增 HBV 前核心区。 0022 本发明的引物可通过亚磷酰胺 (phosphoramidite) 固相支持法或其它公知方法 来化学合成。也可使用许多本领域的公知方法修饰这些核酸序列。此类修饰的非限定性 实例包括甲基化、 包囊化 (capsulation)、 通过天然核苷酸类似物取代一个或多个天然核苷 酸， 和核苷酸间的修饰， 例如对不带电荷的结。
17、合物 ( 膦酸甲酯、 磷酸三酯、 氨基磷酸酯、 氨基 甲酸酯等 ) 或带电荷的结合物 ( 如硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯等 ) 的修饰。核酸可包含一 个或多个其它共价结合的残基， 其实例为蛋白质(如核酸酶、 毒素、 抗体、 信号肽、 聚L-赖氨 酸等 )、 插入剂 ( 如吖啶、 proralene 等 )、 螯合剂 ( 如金属、 放射性金属、 铁、 氧化性金属等 ) 和烷基化剂。也可使用能够直接或间接提供可检测信号的标记物来改变本发明的核酸序 列。标记物的实例包括放射性同位素、 荧光分子和生物素。 0023 当使用本发明提供的具有碱基序列 SEQ ID NO.1 和 2 以及 SEQ ID NO。
18、.3 和 4 的引 物进行 PCR 时， 可以高特异性且高灵敏度检测各个 HBV 基因型。在本文中， 术语 “灵敏度” 是 指患病者中经测试为阳性的比例， 即识别患者中存在特定疾病的测试能力。术语 “特异性” 是指无病个体中经测试为阴性的比例， 即识别健康个体的测试能力。 0024 因此， 所述引物可用于诊断 HBV 感染、 分析感染型 HBV 基因型、 HBV 的流行病学分 析， 以及评估 HBV 疫苗的功效和安全性。 0025 根据另一个实施方式， 本发明涉及用于检测 HBV 基因的组合物， 其包含具有碱基 序列 SEQ ID NO.1 和 2 的引物对、 具有碱基序列 SEQ ID NO。
19、.3 和 4 的引物对和具有碱基序 列 SEQ ID NO.7 和 8 的探针。 0026 具体地， 本发明提供了用于HBV检测的组合物， 其包含特异于HBV S蛋白区的新型 引物和具有碱基序列SEQ ID NO.7的探针， 所述新型引物由具有碱基序列SEQ ID NO.1的正 向引物和/或具有碱基序列SEQ ID NO.2的反向引物组成。 此外， 本发明提供了用于HBV检 测的组合物， 其包含特异于HBV前核心区的新型引物和具有碱基序列SEQ ID NO.8的探针， 所述新型引物由具有碱基序列 SEQ ID NO.3 的正向引物和 / 或具有碱基序列 SEQ IDNO.4 的反向引物组成。 。
20、0027 此外， 本发明提供了用于检测内标的组合物， 其包含特异于不存在于人和 HBV 基 因中且作为内标以检测假阴性反应的新型引物和具有碱基序列 SEQ ID NO.9 的探针组成， 其中所述新型引物由具有碱基序列 SEQ ID NO.5 的正向引物和 / 或具有碱基序列 SEQ ID NO.6 的反向引物组成。 0028 与使用特异于单个基因碱基序列的引物和探针的技术相比， 在本发明中优选通过 使用 S 蛋白特异性引物和探针以及前核心蛋白特异性引物和探针来实现较高灵敏度和特 异性地检测血液中的 HBV。引物的具体序列描述在下表 1 中。 0029 表 1 0030 名称 引物碱基序列 长度。
21、 SEQ ID No. BSFOR GTR TCT GCG GCG TTY TAT CA 20 1 BSREV GGA CAA ACG GGC AAC ATA CC 20 2 说 明 书 CN 101870971 B 5 4/9 页 6 BCFOR AAA TGC CCC TAT CYT ATC AAC ACT 24 3 BCREV CCG AGA TTK AGA TCT TCT GCG A 22 4 ICFOR CGA TGG CCC TGT CCT TTT ACA TTT A 25 5 ICREV CTT TTC GTT GGG ATC TTT GAT TAA A 25 6 0031 如本。
22、文所用， 术语 “HBV( 乙肝病毒 )” 是一类病毒且导致通常通过输血传播的乙 肝。其大体分为急性和慢性肝炎。急性乙肝的症状与甲肝或丙肝的症状类似。大多数人无 症状， 或一些人经历流感样症状但无需任何治疗即可痊愈。慢性乙肝的症状也与丙肝的症 状类似， 包括疲劳、 发热、 呕吐、 肌肉和关节痛。症状持续时间较长， 增加了向肝硬化和肝细 胞癌发展的风险。因此， 需要不断的检查。PCR 通常用于乙肝的诊断， 但是已知的 PCR 诊断 方法的问题在于这些方法扩增并检测单个区， 因此， 此区中的突变会导致低灵敏度和特异 性， 从而提供假阳性和假阴性结果。在本发明的诊断方法中， 将 S 蛋白特异性引物和。
23、探针连 同前核心区特异性引物和探针一起使用， 并将它们的扩增产物用在单一检测步骤中， 从而 提供便利、 高特异性和灵敏度以及更高准确性的定量测定。 0032 在优选实施方式中， 本发明的组合物进一步包含用于检测由所述引物序列扩增的 核酸的探针序列。 0033 如本文所用， 术语 “探针” 是指能够与另一目标寡核苷酸杂交的寡核苷酸， 无论其 或为天然存在或为合成制备， 或为重组或为 PCR 扩增的寡核苷酸。探针可为单链或双链。 探针可用于检测、 鉴定和分离特定的基因序列。在优选实施方式中， 可使用任何 “报告物分 子” 标记用于本发明的任何探针， 使其在包括荧光、 放射性和发光系统在内的任何检测。
24、系统 中都是可检测的。不希望本发明受限于任何特定检测系统或标记物。优选地， 本发明的探 针为 SEQ ID NO.7 或 8 所示的探针。在本发明的优选实施例中， 发现所述引物和探针可用 于高灵敏度且特异性地检测是否存在 HBV， 且无交叉反应性。 0034 在一个优选实施方式中， 本发明的探针可为在其 5 和 3 端具有荧光分子的探针。 在一个优选实施方式中， 所述探针包含分别位于其 5 和 3 端的荧光报告物和淬灭剂， 其中 它们可显示出相互干扰。因此， 当探针与样品中存在的 S 蛋白或前核心区结合时， 荧光信号 的产生受限。在进行聚合酶链式反应时， 探针被降解， 5 端的荧光报告物被释放。
25、与 3 端的 淬灭剂分离， 从而产生荧光信号。可通过荧光信号检测样品中存在的 HBV。 0035 可在 5 端标记相关领域中常用的任何荧光分子， 如 6- 羧基荧光素、 六氯 -6- 羧基 荧光素、 四氯 -6- 羧基荧光素、 FAM(5- 羧基荧光素 )、 HEX(2 ， 4 ， 5 ， 7 - 四氯 -6- 羧基 -4， 7- 二氯荧光素 ) 和 Cy5( 花菁 -5)， 但不限于此。 0036 也可在 3 端标记相关领域中常用的任何荧光分子， 非限制性标记如 6- 羧基四甲 基 - 罗丹明、 TAMRA(5- 羧基四甲基罗丹明 ) 以及 BHQ 1、 2 和 3( 黑洞淬灭剂 (blac。
26、k hole quencher)1、 2、 3)， 但不限于此。 0037 在本发明中， 探针的碱基序列 SEQ ID NO.7-9 描述在下表 2 中。 0038 表 2 0039 说 明 书 CN 101870971 B 6 5/9 页 7 名称 5 探针碱基序列 (5 - 3 ) 3 长度 SEQ ID No. BSFAM FAM CAT CCT GCT GCTATG CCT CAT CTT C TAMRA 25 7 BCFAM FAM CCC CTA GAA GAA AGA ACT CCC TCG CC TAMRA 26 8 ICCy5 Cy5 ATT ACC TGT CCA CAC 。
27、AAT CTG CCC TT BHQ3 26 9 0040 本发明的 HBV 特异性引物和探针能够产生长度为 100bp 的 PCR 产物， 其适用于实 时 PCR。特别地， 特异于 S 蛋白和前核心蛋白的探针可用于通过 taqman 测定或分子信标测 定的 PCR 定量分析。 0041 本发明的发明人已经通过碱基序列分析检验了假阳性和假阴性结果的风险。 本发 明的发明人发现本发明的引物和探针为能够仅扩增 HBV 基因的引物碱基序列， 且在使用由 BBI 所提供的基因型套组 (Genotype Panel)(PHD201(M) 的测试中显示出 100的阳性预 测值， 表明假阳性和假阴性结果的风。
28、险很低。此外， 还使用基因型套组来评估其定量结果。 结果， 套组间在定量结果上无显著差异 ( 表 5)。因此， 使用 SEQ ID NO.1 和 2 的引物， 以及 SEQID NO.3 和 4 和 SEQ ID NO.7 和 8 的探针来进行血液中 HBV 的高可靠性检测和定量。 0042 在优选实施方式中， 本发明可包括作为内标的其它引物和探针序列， 以使假阳性 和假阴性结果最小化。以内标组作为直接比较的标记物， 从而防止假阳性和假阴性结果。 0043 优选地， 内标组可以为来自植物的 GFP( 绿色荧光蛋白 )。更优选地， GFP 引物序列 可包含 SEQ ID NO.5 和 6 所示的。
29、引物 ( 见表 1)。 0044 作为防止假阴性结果的内标组的引物和探针为这样的引物和探针， 其特异于来自 于植物的GFP(绿色荧光蛋白)基因， 且不抑制HBV特异性引物和探针的实时PCR， 且单独形 成 PCR 产物。特别地， 在检测低水平 HBV 时， HBV PCR 产物的形成不受内标的 PCR 产物的抑 制， 由此能够有效地防止假阴性结果， 改进定量结果的可靠性， 并还可在较低的检测水平下 获得定量。同时， 在检测高水平 HBV 时， 内标的 PCR 产物形成不受 HBV 基因的 PCR 产物的抑 制， 因此有效地保持测试可靠性， 以降低由于内标反应抑制所导致的再次测试的可能性， 从 。
30、而提供了方便性和高效率， 以及允许在宽泛的水平上定量测定。如表 2 所述， 内标的探针碱 基序列为 SEQ ID NO.9。 0045 在一个优选实施方式中， 本发明的组合物可为用于 HBV 检测和定量的组合物， 其 进一步包含缓冲液、 DNA 聚合物、 dNTP 和蒸馏水。此外， 缓冲液、 DNA 聚合物、 dNTP 和蒸馏水 可为相关领域中常用的任何溶液和酶， 而没有特别限制。优选地， 用于 HBV 检测的组合物可 具有表 3 所示的组成。 0046 优选地， 其它酶可为 HS-Taq。HS-Taq 为 Taq DNA 聚合酶的修饰形式， 其通过热处 理而活化。将化学部分连接到酶的活性位点。
31、， 从而使得酶在室温下无活性。因此， 在扩增期 间， 错启动的引物 (misprimed primer) 不延伸。与标准 DNA 聚合酶相比， 结果具有更高的 特异性和更大的产率。 0047 本发明的引物、 探针、 HS-Taq 和缓冲液的具体组成描述在下表 3 中。 0048 表 3 说 明 书 CN 101870971 B 7 6/9 页 8 0049 0050 在本发明中， 靶扩增反应可优选为 PCR， 且 PCR 条件描述在下表 4 中。 0051 表 4 0052 实时 PCR 的反应条件 0053 温度 / 时间 循环 50 /2 分钟 1 95 /10 分钟 1 95 /15 秒。
32、 57 /60 秒 72 /20 秒 40 0054 在另一实施方式中， 本发明涉及用于检测 HBV 基因的方法， 该方法包括以下步骤 ： 从受试者中获得样品， 和使用用于检测 HBV 的组合物检测生物样品中的 HBV 基因。 0055 本文所用的术语 “生物样品” 包括得自于 HBV 感染个体、 疑似感染的 HBV 个体或接 种 HBV 疫苗个体的组织、 细胞、 全血、 血清、 血浆、 唾液、 痰液、 脑脊液或尿液， 但不限于此。优 选得自于疑似感染 HBV 的个体的血液的样品。 0056 对用于鉴定 HBV 存在和基因型的方法没有特别限制， 只要此方法使用上述引物。 说 明 书 CN 10。
33、1870971 B 8 7/9 页 9 此类方法的实例包括使用具有特定链的引物作为探针直接鉴定HBV DNA、 Southern印迹、 斑 点印迹和 FISH( 荧光原位杂交 )。其它方法包括基于使用引物对扩增 HBV DNA 的方法、 基 因型特异性聚合酶链式反应 ( 下文称为 PCR) 和通用引物 PCR。更优选 PCR， 且最优选实时 PCR。 0057 本文所用的术语 “聚合酶链式反应 (PCR)” 是代表性的核酸扩增技术 (NAT)， 其在 体外通过酶促扩增感兴趣的特异 DNA 区域。如果已知 DNA 分子片段的边界序列， 由 Mullis 等在 1985 年开发的 PCR 方法可扩。
34、增 DNA 分子的任何片段。PCR 基本上由三个主要步骤组 成 ： 变性、 退火和延长。 在重复这三个步骤时， 特异DNA序列得到扩增。 在PCR的第一步(变 性 ) 中， 双链模板 DNA 变性为两条单链。在第二步 ( 退火 ) 中， 引物与两类单链 DNA 退火， 其中待扩增的序列介于引物结合区域之间。在第三步中， 耐热性 DNA 聚合酶延长引物并合 成互补链。此循环重复 25-30 次。 0058 优选地， 使用本发明的组合物来扩增由临床样品提取的 DNA， 并对产物进行实时 PCR。 此类实时PCR分析可通过任何商购的实时PCR反应器进行， 如SLAN实时PCR检测系统 (LG Lif。
35、e Science， 韩国)、 LightCyclerTM(Roche， 德国)、 ABI PRISMTM 7000/7700(Applied Biosystems， 美国 )、 iCyclerTM(Bio-Rad， 美国 )、 Rotor-GeneTM(Corbett， 澳大利亚 ) 和 OpticonTM(PharmaTech， 美国 )， 但不限于此。 0059 引物是决定 PCR 结果可靠性的最重要因素。一些引物序列可引起非特异性扩增， 从而导致错误的结果。 在此方面， 本发明提供了可靠的引物对。 使用本发明引物对进行PCR 能够进行 HBV 基因型的准确检测和极低量的灵敏定量分析。此。
36、外， 当使用本发明的引物对 进行 PCR 时， 能够基于重复的 PCR 性能获得一致的结果。也就是说， 因为本发明的引物对是 高度有效和可靠的， 所以使用本发明引物对获得的结果是高度可靠的。 0060 在另一个实施方式中， 本发明涉及用于 HBV 检测和定量的试剂盒， 其包含用于检 测 HBV 的组合物。 0061 优选地， 可通过包含具有本发明序列的引物和探针， 以及内标引物和探针序列来 制备所述试剂盒。所述试剂盒可包括用于 HBV 检测和定量的缓冲液、 KCl、 MgCl2和 dNTP。更 优选地， 使用具有表 3 组成的试剂盒来制备用于 HBV 扩增和检测的试剂盒。在本发明的优 选实施例。
37、中， 制备具有上述组成的试剂盒， 从而高灵敏性且特异性地检测和定量 HBV。 0062 实施例 0063 以下， 将参照实施例来更详细地描述本发明。然而， 这些实施例仅用于说明， 且不 用于限制本发明的范围。 0064 实施例 1. 引物和探针的构建 0065 本发明所用的 HBV 特异性引物和探针为仅能够扩增 HBV 病毒基因的引物序列， 这 通过使用来自Hitachi Software的DNAsis程序分析GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)(由 美国国立卫生研究院 (NIH) 的生物技术信息国家中心 (NCBI) 管理 ) 中的 DNA 序列， 对此 DNA 序列进。
38、行测序， 并随后使用 BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 再次分析此 DNA 序 列确认的。 0066 在获得碱基序列后， 使用 HS-Taq 来测定对 HBV 检测用组合物中的 HBV 特异性引物 和探针无竞争性抑制的植物源基因的特异性引物和探针。 0067 实施例 2. 引物的合成 说 明 书 CN 101870971 B 9 8/9 页 10 0068 使用例如第三版分子克隆 (Molecular cloning 3rd， Sambrook and Rusell， Cold Spring Harbor Laboratory Press， New York。
39、， USA， 2001) 中 10.42 节中所述的 “寡核苷酸 的合成” 的方法由 Metabion( 德国 ) 合成实施例 1 中所分析的引物。 0069 实施例 3. 从临床样品中提取 HBV RNA 0070 从疑似HBV感染患者的血液分离血清或EDTA-血浆， 并使用基于硅胶膜的离心柱， 如 QIAamp MineElute 病毒离心柱 (Qiagen) 进行提取。 0071 实施例 4. 使用所述引物和探针的多重实时 PCR 分析 0072 根据表 3 的组成制备 PCR 反应溶液， 并在表 4 所示的条件下在 SLAN 实时 PCR 检测 系统(LG Life Science， 。
40、韩国)中进行PCR。 实时测定反应产物， 并在完成反应后使用SLAN 8.0 程序分析结果。 0073 在使用 PCR 的 HBV DNA 定量方法中， Cobas Amplicor HBV MonitorTM测试 (Roche Diagnostics Systems， Meylan， 法国)具有高灵敏度， 但具有2.0102至2.0105拷贝/mL 的窄动态范围。 因此， 为了在准确定量的线性范围内测定， 需要将样品稀释。 此外， bDNA方法 是基于信号扩增的 DNA 定量方法， 其中使用各个病毒 DNA 特异性探针来捕获存在于患者血 清中的病毒基因， 并随后使捕获的基因与探针和扩增子(a。
41、mplifier)反应以定量DNA。 此方 法已经在病毒感染的诊断和疗效评估中使用了一些年。在本发明中， 通过本发明的发明人 发明的实时PCR测量韩国疑似慢性HBV感染患者的血清HBVDNA水平， 并与Cobas Amplicor HBV MonitorTM测试和 bDNA 方法比较， 以评估其正确性。 0074 如表 5 和图 3 所示， 发现在使用 BBI 提供的基因型套组 (PHD201(M) 的测试中， 阳 性预测值为 100， 说明假阳性和假阴性结果的风险极低。此外， 图 1 显示能够进行阳性检 测和定量而无内标对 HBV 特异性引物和探针的竞争性抑制。 0075 表 5 0076 。
42、0077 说 明 书 CN 101870971 B 10 9/9 页 11 0078 实施例 5. 本发明试剂盒的 HBV 检测极限的试验 0079 使用本发明的试剂盒来测试其对HBV感染的检测极限。 测试结果显示在下表6中。 0080 表 6 0081 检测极限的测试 0082 0083 为测定 HBV 检测的下限， 应用 HBV 国际标准， NIBSC 97/746 来补偿用于标准化的 基质效应， 随后从无药物血清 (Bio-rad) 稀释的 6 种不同浓度的 HBV 血清中提取 DNA， 用 AdvanSure HBV 实时 PCR 定量， 并随后进行概率值分析和计算 95检测区间。结果。
43、， 95检 测极限为 2.6IU/mL。 说 明 书 CN 101870971 B 11 1/3 页 12 序列表 株式会社 LG 生命科学 使用实时 PCR 检测 HBV 的方法 OPA10026 KR10-2009-0035638 2009-04-23 9 KopatentIn 1.71 1 20 DNA 人工序列 用于扩增 HBV S 蛋白的正向引物 1 gtrtctgcgg cgttytatca 20 2 20 DNA 人工序列 用于扩增 HBV S 蛋白区的反向引物 2 ggacaaacgg gcaacatacc 20 3 24 序 列 表 CN 101870971 B 12 2/3。
44、 页 13 DNA 人工序列 用于扩增 HBV 前核心区的正向引物 3 aaatgcccct atcytatcaa cact 24 4 22 DNA 人工序列 用于扩增 HBV 前核心区的反向引物 4 ccgagattka gatcttctgc ga 22 5 25 DNA 人工序列 用于扩增 GFP 的正向引物 5 cgatggccct gtccttttac attta 25 6 25 DNA 人工序列 用于扩增 GFP 的反向引物 6 序 列 表 CN 101870971 B 13 3/3 页 14 cttttcgttg ggatctttga ttaaa 25 7 25 DNA 人工序列 用于 HBV S 蛋白区的探针 7 catcctgctg ctatgcctca tcttc 25 8 26 DNA 人工序列 用于 HBV 前核心区的探针 8 cccctagaag aaagaactcc ctcgcc 26 9 26 DNA 人工序列 用于 GFP 的探针 9 attacctgtc cacacaatct gccctt 26 序 列 表 CN 101870971 B 14 1/2 页 15 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101870971 B 15 2/2 页 16 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101870971 B 16 。