用于体细胞核重编程的先天免疫激活
政府权利
本发明是在政府支持下根据国家卫生研究所授予的合同 HL100397和HL103400完成的。政府对本发明享有某些权利。
发明背景
Yamanaka和同事进行的开创性研究显示某些转录因子的异位表 达可能会诱导体细胞的多能性。这些诱导性多能干细胞(iPSC)自我更 新并且分化成多种细胞类型，从而使其成为用于疾病和患者特定性再 生医学疗法的一种有吸引力的选择。它们已被用于成功地模型化人类 疾病并且具有极大的用于药物筛选和患者特定性细胞疗法的潜能。此 外，从患病细胞产生的iPSC可充当适用于研究疾病机制和潜在疗法 的工具。然而，仍应对有关体细胞重编程为iPSC的潜在机制有更多 了解，并且要关注在没有机制性深入理解的情况下的潜在临床应用。
用于重编程为多能细胞的因子(RF)组包括Oct3/4、Sox2、c-Myc、 Klf4、Lin28和Nanog。Oct3/4和Sox2是在胚胎干(ES)细胞中保持多 能性的转录因子，而Klf4和c-Myc被认为是提高iPSC产生效率的转 录因子。据信转录因子c-Myc修饰染色质结构以允许Oct3/4和Sox2 较有效地接近为重编程所必需的基因，而Klf4通过Oct3/4和Sox2 增强某些基因的激活。Nanog(像Oct3/4和Sox2一样)是在ES细胞中 保持多能性的转录因子，而Lin28是被认为影响在分化期间特异性 mRNA的转译或稳定性的mRNA结合蛋白。最近，已证实Oct3/4和 Sox2的逆转录病毒表达与丙戊酸、染色质去稳定剂和组蛋白脱乙酰 基酶抑制剂的共施用一起足以使成纤维细胞重编程为iPSC。
为从体细胞产生iPSC，已使用病毒载体或质粒来过表达这些重 编程因子的一些组合。然而，这些方法产生低重编程效率并且未能提 供对重编程过程的精确控制。此外，这些用于核重编程的方法固有地 引起关于由DNA整合所引起的潜在致瘤性和基因沉默突变的担忧。 因逆转录病毒感染造成的外来DNA整合到宿主基因组中引起对外来 DNA可使必需基因沉默或诱导这些基因调节异常的担忧。虽然 Cre-LoxP位点基因递送或PiggyBac转座子途径已用于在基因递送之 后从宿主基因组上去除外来DNA，但没有一种策略消除诱变的危险， 因为其留下小的残余外来DNA插入物。
作为基因修饰的替代方案，已产生用于无整合核重编程的细胞穿 透蛋白(CPP)，其中重编程因子融合到为蛋白质膜运输到核中而提供 的结构域中。已通过使用纯化重组蛋白在鼠胚胎成纤维细胞中实现成 功重编程为多能细胞。尽管已使用来自胚胎干细胞(ESC)以及过表达 四种转录因子的HEK293细胞的细胞提取物重编程人类细胞，但尚未 使用纯化CPP重编程人类细胞。并且甚至在小鼠细胞情况下，使用 CPP的重编程效率(约0.001％)比使用逆转录病毒载体实现的重编程 效率(0.1％-1％)低大于10倍。
用于iPSC产生或转分化成不同体细胞类型的基于CPP和/或小分 子的途径避免了关于外来DNA整合的所有担忧，并且提供对浓度、 时间和因子刺激顺序的较大控制，然而此类方法在实际操作中仍存在 重大问题。本发明解决了这个问题。
发明概述
提供用于使用非整合方法有效产生诱导性多能细胞或转分化细 胞的组合物和方法。在本发明的方法中，需要重编程为多能细胞或转 分化的体细胞与有效剂量的toll样受体(TLR)激动剂接触，所述TLR 包括但不限于TLR3。接触步骤可在细胞与非整合重编程因子接触之 前、与其同时或在其之后进行，通常同时进行。非整合重编程因子是 核作用多肽或改变转录的小分子，并且其可诱导靶细胞重编程。在一 些实施方案中，重编程因子是融合到多肽穿透结构域中的多肽，例如 如本领域中已知的九精氨酸、tat等。在一些实施方案中，重编程因 子是Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28和Nanog中的一者或多者。
在一些实施方案中，提供重编程细胞群，其中初始体细胞群重编 程为诱导性多能或转分化细胞群。此类细胞在本领域中已知的各种方 法(包括药物筛选、自体或异体移植治疗性细胞施用等)中获得应用。 重编程细胞群因不存在整合遗传因子而提供优势。
在其它实施方案中，提供用于体细胞核重编程的试剂盒。此类试 剂盒可包含先天免疫激活剂，例如一种或多种TLR激动剂，包括但 不限于双链核酸，诸如聚I:C。此类试剂盒可进一步包含用于多能细 胞的非整合诱导的试剂，例如一种细胞穿透蛋白(例如SOX2、OCT4、 Nanog、KLF4、cMYC等)或其混合物。此类试剂盒可作为另外一种 选择或以组合形式提供一种适用于将细胞转分化为所关注谱系的因 子或其混合物。举例来说，内皮细胞转分化试剂盒可包含BMP4、 VEGF、bFGF、8-Br-cAMP、SB431542等中的一者或多者。此类试 剂盒可进一步包含为进行本发明方法所必需的适合的缓冲剂、细胞生 长培养基、说明书等。
还提供用于体内使用本发明方法的试剂盒和方法，其中治疗剂包 含先天免疫激活剂，并且体内施用一种或多种细胞穿透肽和/或小分 子用于治疗性调节细胞和/或组织表型。
附图简述
图1：由病毒载体表达或以细胞穿透肽形式递送的重编程因子诱 导的基因表达的不同模式：(A)经逆转录病毒表达载体(红线)或细胞 穿透肽(蓝线)感染之后Nanog的倍数表达。与病毒载体pMX-Sox2相 比，细胞穿透CPP-SOX2引起下游目标和多能性基因的迟延表达。基 因表达的相对倍数变化是在每天用200nM CPPSOX2处理之后或在 第0天单一pMXSox2感染之后测定。所有数据以平均值±标准偏差 表示，n＝3，*P<0.005。(B)因为各处理条件下所选基因(Jarid2、Zic2、 bMyb、Oct4、Sox2和Nanog)的时间表达模式显著类似，所以其随时 间推移的倍数表达的变化以所有六种基因的平均倍数增加显示。注意 到与Sox2以CPP形式存在时相比，当Sox2以病毒载体形式存在时， 目标基因表达快速增加。(C)与病毒载体pMXOct4相比，细胞穿透 CPPOCT4引起下游目标和多能性基因的迟延表达。Nanog基因表达 是此不同基因时间表达模式的代表。基因表达的相对倍数变化是在每 天用200nM CPPOCT4处理之后或在第0天单一pMOct4感染之后测 定。所有数据以平均值±标准偏差表示，n＝3，*P<0.005。(D)显示各 条件下所选基因(即Tcf4、Gap43、Nanog、Sox2和Oct4)随时间推移 的平均倍数变化的概括图。注意到与Oct4以CPP形式存在时相比， 当Oct4以病毒载体形式存在时，目标基因表达快速增加。
图2：不相关逆转录病毒载体促进CPP诱导的基因表达：(A)在 pMX-Sox2(红线)、CPP-SOX2(蓝线)或pMX-GFP+CPP-SOX2(绿线) 处理之后，Nanog基因表达水平的相对倍数变化。(B)显示各条件下 所选基因(即Jarid2、Zic2、bMyb、Oct4、Sox2和Nanog)随时间推移 的平均倍数变化的概括图。当Sox2以CPP形式提供时，下游目标基 因的激活延迟。然而，在不相关逆转录病毒载体存在下，目标基因表 达快速增加，并且与pMX-Sox2相似。(C)在pMX-Oct4、CPP-OCT4 或pMX-GFP+CPP-OCT4处理之后Nanog的基因表达水平的相对倍数 变化。(D)显示各条件下所选基因(即Tcf4、Gap43、Nanog、Sox2和 Oct4)随时间推移的平均倍数变化的概括图。所有数据以平均值±标准 偏差表示，n＝3，*P<0.005。
图3：TLR3途径的基因敲低抑制编码Oct4的逆转录病毒载体的 作用：(A)在用TRIF-抑制肽(肽抑制剂-TRIF)处理的成纤维细胞中， 在逆转录病毒-Oct4(pMX-Oct4)感染之后，Oct4的基因表达降低。下 方图显示在四种条件下，所选多能基因(Oct4、Sox2和Nanog)随时间 推移的平均倍数变化的概括图。(B)在TRIF shRNA基因敲低成纤维 细胞中，在逆转录病毒-Oct4(pMX-Oct4)感染之后Oct4的基因表达 降低。下方图显示在四种条件下，所选多能基因(Oct4、Sox2和Nanog) 随时间推移的平均倍数变化的概括图。(C)在TLR3shRNA-基因敲低 成纤维细胞中，在逆转录病毒-Oct4(pMX-Oct4)感染之后Oct4的基因 表达降低。下方图(D-F)显示在四种条件下，所选多能基因(Oct4、Sox2 和Nanog)随时间推移的平均倍数变化的概括图。所有数据以平均值± 标准偏差表示，n＝3，*P<0.005。
图4：TLR3-TRIF基因敲低成纤维细胞展现削弱的核重编程：(A) 用于使用以逆转录病毒载体形式递送的重编程因子产生iPSC的方 案。(B)在错义、MyD88、TRIF和TLR3shRNA基因敲低成纤维细胞 的逆转录病毒核重编程起始之后第30天iPSC的代表性图像。在TLR3 信号传导途径的元件被基因敲低的成纤维细胞(即TRIF shRNA或 TLR3shRNA细胞系)中，人类iPSC集落的发展显著延迟。相比之下， 在所有其它TLR的衔接子被基因敲低的成纤维细胞(MyD88shRNA) 中，或在用错义shRNA处理的成纤维细胞中，未注意到hiPSC发展 延迟。(C)在由通过逆转录病毒转染递送的重编程因子转导的错义、 MyD88、TRIF和TLR3shRNA基因敲低成纤维细胞系中，第35天 hiPSC集落的总数目。hiPSC集落的产量因TLR3信号传导途径的基 因敲低元件而降低。*P<0.05；错义细胞与TRIF或TLR3shRNA基 因敲低成纤维细胞相比较。(D)第35天在错义、MyD88、TRIF和TLR3 shRNA基因敲低成纤维细胞中，Oct4基因表达的倍数变化。
图5：聚I:C促进CPP诱导的目标基因表达：(A)在pMX-Sox2(红 线)、CPP-SOX2(蓝线)或聚I:C+CPPSOX2(绿线)处理之后Jarid2的基 因表达水平的相对倍数变化。(B)这些所选基因(即Jarid2、Zic2、bMyb、 Oct4、Sox2和Nanog)在各处理之后展现平均基因时间表达模式的概 括图。聚I:C使CPPSOX2对下游基因的表达显著增强。(C)在 pMX-Oct4、CPPOCT4或聚I:C+CPPOCT4处理之后Nanog的基因表 达水平的相对倍数变化。(D)这些所选基因(即Tcf4、Gap43、Nanog、 Sox2和Oct4)在各处理之后展现基因时间表达模式的概括图。聚I:C 使CPPOct4对下游基因的表达显著增强。所有数据以平均值±标准偏 差表示，n＝3，*P<0.005。
图6.TLR3激活使强力霉素诱导型系统中的重编程增强：(A)在 暴露于强力霉素4周后，显示从表达编码四种重编程因子的dox诱导 型多顺反子转基因构筑体的MEF衍生的iPSC集落的SSEA-1活染。 在一些孔中，MEF还暴露于编码GFP的逆转录病毒构筑体或聚I:C。 (B)显示第2周和第3周原始培养板中的SSEA-1+集落的直方图。聚 I:C或编码GFP的逆转录病毒构筑体的共施用使强力霉素诱导的重编 程的产量显著增加。(C)聚I:C或编码GFP的逆转录病毒构筑体的共 施用促进Oct4和Sox2的基因表达。
图7.TLR3激活刺激CPP诱导的人类成纤维细胞重编程：(A)用 于使用四种CPP-TF(OCT4-R11、SOX2-R11、KLF4-R11和cMYC-R11) 产生人类iPSC的方案。(B)在第30-45天，聚I:C的共施用使Oct4的 基因表达增加。(C)在第30天和第40天，在存在和不存在聚I:C的情 况下数到的TRA-1-81阳性集落。聚I:C的共施用使CPP诱导的重编 程的产量显著增加。(D)CPP诱导的反式激活在第32天的ES样集落 形成(10倍)
图8.由从病毒载体表达或以细胞穿透肽形式递送的个别重编程 因子诱导的下游基因表达模式的差异：(A)显示与媒介物相比，在逆 转录病毒或CPP-SOX2处理之后，所选多能基因(Sox2、Oct4、Nanog) 和Sox2相关基因(Jarid2、Zic2、bMyb)随时间推移(第0-6天)的表达 强度的热图。媒介物或不相关逆转录病毒构筑体(pMX-GFP)对基因表 达无影响。逆转录病毒Sox2使得六种基因中每一者的表达早期增加 随后降低。CPP-SOX2使得基因表达增加延迟。(B)显示所选多能基 因(Sox2、Oct4、Nanog)和Oct4相关基因(Tcf4、GAP43)随时间推移(第 0-6天)的表达强度的热图。
图9.不相关逆转录病毒载体促进CPP诱导的基因表达：(A-B) 在pMX-Sox2(红线)、CPP-SOX2(蓝线)或pMX-GFP+CPP-SOX2(绿 线)处理之后，Jarid2和Zic2的基因表达水平的相对倍数变化。(C)显 示在各条件下所选基因随时间推移的平均倍数变化的概括图。(D-E) 在pMX-Oct4、CPP-OCT4或pMX-GFP+CPP-OCT4处理之后，Tcf4 和GAP43的基因表达水平的相对倍数变化。
图10.非整合pMX-GFP促进CPP-OCT4诱导的基因表达：(A) 经pMX-GFP突变体(上)或pMX-GFP wt(下)感染的BJ成纤维细胞的 免疫荧光图像。(B-E)在pMX-GFP(红线)，pMX-GFP+CPP-OCT4(蓝 线)，pMX-GFP突变体(绿线)或pMX-GFP突变体+CPP-OCT4(紫线) 处理之后，Oct4、Sox2、Nanog和TLR3的基因表达水平的相对倍数 变化。
图11.逆转录病毒GFP/OCT4/SOX2感染刺激先天免疫。在pM X-Oct4、pMX-Sox2、pMX-GFP、pMX-GFP+CPP-OCT4、pMX-GFP +CPP-SOX2、CPP-OCT4或CPP-SOX2之后，先天免疫相关基因ST AT1、STAT2、IFNβ、NF-κB、TLR3和TLR4的基因表达水平的相对 倍数变化。
图12.TLR3信号传导的基因敲低使多能基因表达降低(与图3相 关)：(A)在用TRIF-抑制肽(肽抑制剂-TRIF)处理的成纤维细胞中，在 逆转录病毒-Oct4(pMX-Oct4)感染之后，Tcf4、NF-κB或TLR3的基 因表达降低。(B)在TRIF shRNA基因敲低成纤维细胞中，在pMX-Oct4 感染之后，Tcf4、NF-κB或TLR3的基因表达降低。(C)在TLR3shRNA 基因敲低成纤维细胞中，在pMX-Oct4感染之后，Tcf4、NF-κB或TLR3 的基因表达降低。
图13.MyD88的抑制不影响pMX-Oct4诱导的基因表达：(A)在 用MyD88-抑制肽(肽抑制剂-MyD88)处理的成纤维细胞中，在逆转录 病毒-Oct4(pMX-Oct4)感染之后，Oct4、Tcf4、NF-κB或TLR3的基 因表达保持不变。(B)在MyD88 shRNA基因敲低成纤维细胞中，在 pMX-Oct4感染之后，Oct4、Tcf4、NF-κB或TLR3的基因表达保持 不变。
图14.聚I:C使先天免疫基因的表达增强。在聚I:C、聚 I:C+CPP-OCT4或聚I:C+CPP-SOX2之后，先天免疫相关基因STAT1、 STAT2、IFNβ、NF-κB、TLR3和TLR4的基因表达水平的相对倍数 变化。
图15.聚I:C通过TLR3使CPP诱导的基因表达增强：(A-B)在 pMX-Sox2(红线)、CPP-SOX2(蓝线)或聚I:C+CPP-SOX2(绿线)处理 之后，Zic2和Nanog的基因表达水平的相对倍数变化。(C)显示在各 条件下所选基因随时间推移的平均倍数变化的概括图。(D、E)在 pMX-Oct4、CPPOCT4或聚I:C+CPP-OCT4处理之后，Tcf4和GAP43 的基因表达水平的相对倍数变化。
图16.在强力霉素诱导的次级MEF系统中的重编程。强力霉素 处理的MEF的形态变化。聚I:C以及pMX-GFP促进在第3天孔中聚 集小而紧密的圆形细胞的变化。用pMX-GFP感染促进集落形成，因 为在病毒粒子感染组中第7天观察到许多小集落。在第14天，典型 mES样集落出现，其中许多具有激活的SSEA-1。
图17.聚I:C/病毒粒子早期促进表观遗传修饰(第2天)：(A)用于 评估在暴露于各种处理条件第2天Oct4启动子的H3K4me3的芯片分 析。用pMX-GFP或用聚I:C刺激TLR3没有效果，CPP-SOX2也没 有效果。然而，与pMX-GFP或与聚I:C组合，细胞穿透肽CPP-SOX2 与逆转录病毒Sox2(pMX-Sox2)的效果相似。(B)用于评估在暴露于各 种处理条件的第2天Oct4启动子的H3K9me3的芯片分析，数据以平 均值±标准偏差表示，n＝2(*P<0.005，**P<0.02)(C)显示HDAC1 蛋白质表达的免疫印迹证实聚I:C诱导早期(第2天)并且持续(到第6 天)的HDAC1表达抑制。HP-1α的表达未受影响(尽管其是重分布的， 参见图S11A-C)
图18.聚I:C/病毒粒子促进表观遗传修饰(时间过程，第2-6天)： (A)用于评估在暴露于各种处理条件第2、4和6天Oct4启动子的 H3K4me3的芯片分析。(B)用于评估在暴露于各种处理条件第2、4 和6天Oct4启动子的H3K9me3的芯片分析。(C)用于评估在暴露于 各种处理条件第2、4和6天Sox2启动子的H3K4me3的芯片分析。 (D)用于评估在暴露于各种处理条件第2、4和6天Sox2启动子的 H3K9me3的芯片分析。
图19.共焦显微镜图像分析：(A)在CPP-Sox2加上pMX-GFP或 聚I:C存在下HP1α阳性斑点的尺寸增加。(B)HP1α-阳性斑点的数目 减少，表明在CPP-Sox2加上pMX-GFP或聚I:C存在下HP1α位置的 重排。(C)HP1α的共焦显微镜分析。(D)随时间过程推移HP-1α表达 的蛋白质印迹(第2、4和6天)
图20.聚I:C通过TLR3-TRIF信号传导激活NF-κB：(A)TLR3 和NF-κB响应于聚I:C的转录表达。(B)-(C)NF-κB活性的荧光素酶 分析显示聚I:C(而非CPP-SOX2)使NF-κB活性基本上增加，此效果 受到TLR3信号传导途径的基因敲低元件的抑制。
图21：人类成纤维细胞通过先天免疫激活和微环境诱因直接重 编程为功能性内皮细胞：(A)用于使人类BJ成纤维细胞直接重编程 为内皮细胞的方案。该图描述了时间过程和不同介质的连续处理：在 含有DMEM/FBS的分化培养基I和7.5％无血清替代物(KSR)中用聚 I:C(30ng/ml)处理人类成纤维细胞7天。7天之后，培养基变为含有 DMEM/FBS的分化培养基II和含有20ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF 和20ng/ml bFGF的10％KSR。再7天后，将培养基用含有50ng/ml VEGF、20ng/ml bFGF和0.1mM8-Br-cAMP的内皮细胞培养基 (EGM2)替换再持续14天。每2-3天更换培养基。接着，用CD31或 VE钙粘蛋白将细胞FAC分选并且接着在含有SB431542(一种特异性 TGFβ受体抑制剂)的EGM2培养基中扩增。(B)使用CD31+抗体测定 iEC数量所获得的荧光激活细胞分选(FACs)数据曲线。(左侧图)-媒介 物对照；(中间图)-聚I:C和(右侧图)-具有CD31抗体的iEC的富集。 (C-D)实时RT-PCR和内皮细胞标记CD31、CD144、eNOS和温韦伯 氏因子(von Willebrand factor)的iEC免疫荧光染色。(E-F)iEC吸收乙 酰基化LDL并且在基质胶上形成毛细管样网状结构。
图22：通过iEC移植获得的缺血后肢中的血液灌注的改善和毛 细管密度。(A)激光多普勒灌注成像(laser Doppler perfusion imaging) 的代表性图像。(B)在处理后第0天和第7天灌注比(缺血肢体的值除 以非缺血肢体的值)的概括数据。(C)来自用iEC或媒介物处理的小鼠 的缺血组织的免疫荧光CD31染色。(D)缺血肢体中总毛细管密度的 定量。(E)设盲观测者所获得的后肢缺血得分。
图23：TLR3信号传导使人类成纤维细胞能够有效转分化为功能 性内皮细胞：(A)用于使人类BJ成纤维细胞在TLR3基因敲低细胞 (上文所描述)中直接重编程为内皮细胞的方案。(B)使用CD144+抗体 测定iEC数量所获得的荧光激活细胞分选(FAC)数据曲线。(左侧图)- 用媒介物对照处理的错义细胞；(中间图)-用聚I:C处理的错义细胞和 (右侧图)-用聚I:C处理的TLR3-KD细胞。(C-D)衍生自TLR3-KD细 胞的iEC具有降低的吸收乙酰基化LDL的能力并且未能在基质胶上 形成毛细管样网状结构。
具体实施方式
已显示体细胞中先天免疫反应的激活极大地促进了在非整合编 程因子下使体细胞重编程为诱导性多能干细胞或转分化细胞。激活先 天免疫的方法包括激活toll样受体，例如TLR3。
定义
应了解，本发明不限于所描述的特定方法、方案、细胞系、动物 物种或属以及试剂，因此可有所变化。还应了解，本文所用的术语是 仅用于描述特定实施方案的目的，而不意在限制本发明的范围，本发 明的范围将仅受限于随附权利要求书。
除非上下文明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个(一种)”、 “和”、和“所述”包括复数指示物。因此，举例来说，提到“一个细胞” 包括多个此类细胞并且提到“所述蛋白质”包括提到一种或多种蛋白 质和其本领域技术人员已知的等效物等等。除非明确指明，否则本文 所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域技术人员通常 所理解相同的含意。
先天免疫。先天免疫系统是一种原始细胞反应，其为细胞针对 病原体抗原提供防御。先天免疫系统对这些抗原的识别可产生以诸如 TNF、IL-1、IL-6和IL-8的细胞因子的产生；以及尤其ICAM-1和 E-选择素的基因激活为特征的炎症反应。
广泛类别的病原体(例如病毒、细菌和真菌)可组成性地表达一组 称为病原体相关分子模式(PAMP)的类别特异性抗突变分子。这些微 生物分子标记可由蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸和/或其组合组 成，并且可位于内部或外部。实例包括内毒素脂多糖(LPS)、单链或 双链RNA等。
典型地，PAMP受体(PRR)是非克隆的(即在给定类型的所有细胞 上表达)并且由生殖细胞系编码，或与免疫记忆无关。一旦结合，PRR 倾向于使其它细胞外和细胞内蛋白质聚集、募集成复合物，并且引发 信号传导级联反应，从而最终影响转录。另外，PRR响应病原体检测 参与补充、凝结、吞噬、发炎和细胞凋亡功能的激活。存在若干类型 的PRR，包括补体受体、葡聚糖受体、甘露糖受体、清道夫受体和 toll样受体，各自具有特异性PAMP配体、表达模式、信号传导途径 和抗病原体反应。
Toll样受体是I型跨膜(TM)PRR，其具有不同数目的细胞外N 端富含亮氨酸重复(LRR)基序，继之以富含半胱氨酸区域、TM结构 域和细胞内Toll/IL-1R(TIR)基序。LLR结构域对配体结合和相关信 号传导来说是重要的并且是PRR的共同特征。TIR结构域在蛋白-蛋 白相互作用中是重要的并且典型地与先天免疫有关。TIR结构域还合 并成一个较大的IL-1R/TLR超家族，它由三个亚群组成。人类TLR 家族由至少10个成员(TLR1到TLR10)组成。各TLR在其表达模式 和PAMP敏感性方面具特异性。
Toll样受体3(TLR3)识别双链RNA(dsRNA)和其拟似物(与病毒 感染有关的分子模式)。其位于染色体4q35并且其序列编码具有24 个N端LRR并且计算的分子量为97kDa的推定904aa蛋白。TLR3 与TLR5、TLR7和TLR8最紧密相关，各自具有26％总aa序列一致 性。在暴露于革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria)之后TLR3mRNA 提高并且响应于革兰氏阳性菌(Gram-positive bacteria)达到甚至更大 的程度。
TLR3具体地说识别双链RNA(dsRNA)并且诱导多个负责针对许 多病毒感染的先天抗病毒免疫的细胞内事件。预期904-氨基酸TLR3 蛋白含有特征性Toll基序：细胞外富含亮氨酸重复(LRR)结构域和细 胞质白介素-1受体样区域。
暴露于双链RNA(dsRNA)或聚肌苷-聚胞苷酸(聚(I:C))(一种合成 dsRNA类似物)诱导干扰素α和β产生并且通过经过TLR3进行信号 传导激活NFκB。IRF3具体地说是通过刺激TLR3或TLR4来诱导， 其介导负责先天抗病毒反应的特异性基因程序。TRIF为NFΚB的 TLR3依赖性激活所必需的。其充当连接RIP1和TLR3的衔接蛋白以 介导TLR3诱导的NFΚB激活。
RIG-1(视黄酸诱导型基因1)是一种RIG-I样受体dsRNA解旋酶， 其(在人类中)由DDX58基因编码。RIG-I是RIG-I样受体(RLR)家族 的一部分，RIG-I样受体家族还包括MDA5和LGP2，并且充当作为 病毒传感器的模式识别受体。RIG-I典型地识别短(＜4000nt)的5′三磷 酸dsRNA。RIG-I和MDA5参与激活MAVS并且触发抗病毒反应。 人类RIG1基因可以基因库NM_014314.3存取并且蛋白质以基因库 NP_055129.2存取。
Toll样受体4是一种在人类中由TLR4基因编码的蛋白质。其检 测来自革兰氏阴性菌的脂多糖并且因此在先天免疫系统的激活中是 重要的。此受体在胎盘中和在白细胞的粒单核细胞亚群中表达最丰 富。人类TLR4基因可以基因库NM_003266.3存取并且蛋白质以基 因库NP_003257.1存取。
TLR4的激活导致下游包括TNF-α和白介素-1的炎症调节剂的释 放。激动剂包括吗啡、羟可酮(oxycodone)、芬太尼(fentanyl)、美沙酮 (methadone)、脂多糖(LPS)、卡马西平(carbamazepine)、奥卡西平 (oxcarbazepine)等。
TLR激动剂。TLR激动剂激活TLR，包括但不限于TLR3、TLR4 和RIG1。TLR激动剂的实例包括病原体相关分子模式(PAMP)和其拟 似物。如本领域中已知，这些微生物分子标记可由蛋白质、碳水化合 物、脂质、核酸和/或其组合组成，并且可位于内部或外部。实例包 括LPS、酵母聚糖、肽葡聚糖、鞭毛蛋白、合成TLR2激动剂Pam3cys、 Pam3CSK4、MALP-2、咪喹莫特(Imiquimod)、CpG ODN等。
TLR3激动剂包括双链RNA；聚(I:C)、聚(A.U)等，其中此类核 酸的大小通常为至少约10bp，至少约20bp，至少约50bp并且可具 有约1到约20kb、通常不超过约50到100kb的高分子量。替代TLR3 激动剂可直接结合于蛋白质，例如选择性结合于并且激活TLR3的抗 体或小分子。其它TLR3激动剂包括逆转录病毒，例如被工程化到缺 乏整合到基因组中的能力的逆转录病毒。
在本发明方法中有效的激动剂剂量是使细胞或细胞群的重编程 效率相对于相同群在不存在TLR激动剂的情况下增加的剂量。如此 处所用的术语“重编程”意味着体外或体内，体细胞核重编程为多能细 胞(例如成纤维细胞到诱导性多能细胞)或体细胞核重编程为实质上 不同的体细胞(例如成纤维细胞到内皮细胞)。后一过程也称为转分 化。
方便地，可评估TLR激活的标记以测定适合的剂量，包括用于 重编程的NFκB在所关注的体细胞中的激活、干扰素α和β的产生等。 举例来说，其中聚I:C或其类似物的TLR激动剂，有效剂量可以是 至少约10ng/ml，至少约50ng/ml，至少约100ng/ml，至少约250 ng/ml，至少约500ng/ml。培养基中聚I:C的最佳化浓度为至少10 ng/ml并且不超过3000ng/ml，包括在20ng/ml到300ng/ml并且尤其 25ng/ml到150ng/ml范围内，例如为约30ng/ml。除聚I:C外的TLR 激动剂的剂量可基于等效于最佳化聚I:C剂量的活性提供来计算。
“多能性”和多能干细胞意味着此类细胞具有分化成有机体中所 有类型的细胞的能力。术语“诱导性多能干细胞”涵盖可经长时间培养 同时保持分化成有机体中所有类型的细胞的能力(像胚胎干(ES)细胞) 但衍生自分化体细胞(不像ES细胞(其衍生自胚囊的内细胞团))的多 能细胞，即具有窄的较大规定潜能并且在不存在实验操作的情况下不 能产生有机体中所有类型的细胞的细胞。“具有变成iPS细胞的潜能” 意味着分化体细胞可被诱导变成(即可重编程以变成)iPS细胞换言 之，体细胞可被诱导以再分化，从而形成细胞具有多能细胞的形态特 征、生长能力和多能性的体细胞。iPS细胞具有hESC样形态，以具 有大核质比、清晰边界和突起的核的平面集落形式生长。此外，iPS 细胞表达本领域技术人员已知的一种或多种主要多能性标记，包括但 不限于碱性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、 TRA181、TDGF1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、TERT和zfp42。 此外，iPS细胞能够形成畸胎瘤。此外，其能够形成或贡献于活生物 中的外胚层、中胚层或内胚层组织。
术语“原代细胞”，“原代细胞系”和“原代培养物”在本文中可互换 使用，用于指已衍生自受试者并且允许培养物体外生长有限代数(即 分裂)的细胞和细胞培养物。举例来说，原代培养物是培养物可能已 传代0次、1次、2次、4次、5次、10次或15次，但次数不足以经 历危机期。
起始细胞群。如本文所用，“起始细胞群”或“初始细胞群”是指体 细胞，通常为原代或非转型体细胞，其通过本发明方法经历了核重编 程。起始细胞群可属于任何哺乳动物物种，但尤其包括人类细胞。起 始细胞群的来源包括需要细胞疗法的个体、具有研究所关注的遗传缺 陷的个体等。
在一些实施方案中，获自用于核重编程目的的受试者的人类细胞 可选自任何人类细胞类型，包括成纤维细胞、脂肪组织细胞、间充质 细胞、骨髓细胞、胃细胞、肝细胞、上皮细胞、鼻上皮细胞、粘膜上 皮细胞、滤泡细胞、结缔组织细胞、肌细胞、骨细胞、软骨细胞、胃 肠细胞、脾细胞、肾细胞、肺细胞、睾丸细胞、神经组织细胞等。在 一些实施方案中，人类细胞类型是成纤维细胞，其可方便地通过钻取 活检获自受试者。在某些实施方案中，细胞是获自已知或怀疑具有所 关注基因的拷贝数变异(CNV)或突变的受试者。在其它实施方案中， 细胞是来自具有特发/偶发疾病形式的患者。在其它实施方案中，细 胞是来自非人类受试者。细胞接着重编程，并且可转分化以走上特异 性细胞的道路，诸如内胚层细胞、神经元细胞，例如多巴胺能、胆碱 能、血清素能、GABA能或谷氨酸盐能神经元细胞；胰腺细胞(例如 胰岛细胞)、肌细胞(包括但不限于心肌细胞)、造血细胞等。
术语“重编程效率”可用于指当与重编程因子接触时细胞产生iPS 细胞集落的能力。展示增强的重编程为多能细胞的效率的体细胞当与 重编程因子接触时将相对于对照展示增强的产生iPS细胞的能力。术 语“重编程效率”还可指体细胞重编程为实质上不同的体细胞类型(一 种称为转分化的过程)的能力。本发明方法的重编程效率随体细胞的 特定组合、引入重编程因子的方法和诱导重编程之后的培养方法而变 化。
重编程因子如本文所用是指一种作用于细胞以改变转录并且在 表达后将体细胞重编程为不同细胞类型或多潜能细胞或多能细胞的 生物活性多肽或小分子或其混合物。出于本发明的目的，需要重编程 因子是非整合的，即以不引起外源性DNA整合到受体细胞的基因组 中的形式提供给受体细胞。因此，除核酸以外的试剂(例如蛋白质和 小分子)往往为优选的。
出于本发明的目的，重编程因子通常融合到穿透结构域中以允许 多肽穿过细胞膜并且穿过核膜进入。重编程因子可属于任何适合的哺 乳动物物种，例如人类、鼠、猪、马、犬、羊、猫、猿等。人类多肽 特别受关注。
在一些实施方案中，重编程因子是转录因子，包括但不限于 Oct3/4；Sox2；Klf4；c-Myc；和Nanog。作为重编程因子同样受关注 的是Lin28，其为一种被认为影响在分化期间特异性mRNA的转译或 稳定性的mRNA结合蛋白。
所关注的重编程因子还包括适用于转分化的因子，其中体细胞重 编程为不同的体细胞。出于使一种体细胞转分化为另一种实质上不同 的体细胞类型的目的，可使用不同组的重编程因子。举例来说，为使 成纤维细胞转分化为心肌细胞，可使用细胞穿透肽Gata4、Mef2c和 Tbx5(Leda等使用病毒载体将成纤维细胞转化为心肌细胞；Cell,第 142卷,第3期,375-386,2010年8月6日，具体地说以引用的方式并 入本文中。)
重编程因子可以具生物活性的分离多肽组合物形式(即以无细胞 形式)提供。生物活性可如实施例中所描述通过特异性DNA结合分 析；或通过测定因子在改变细胞转录中的有效性来测定。本发明的组 合物可提供一种或多种生物活性重编程因子。所述组合物可包含至少 约50μg/ml、至少约100μg/ml；至少约150μg/ml、至少约200μg/ml、 至少约250μg/ml、至少约300μg/ml或更多可溶性重编程因子。
Klf4多肽是一种包含与人类Klf4(即Kruppel样因子4，其序列 可见于基因库登录号NP_004226和NM_004235)的氨基酸序列至少 70％一致的氨基酸序列的多肽。Klf4多肽(例如那些与基因库登录号 NM_004235中所提供的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、 92％、95％、97％、99％或100％一致的多肽)和编码它们的核酸在本 发明中作为重编程因子而获得应用。
c-Myc多肽是一种包含与人类c-Myc(即骨髓细胞癌病毒致癌基 因同系物，其序列可见于基因库登录号NP_002458和NM_002467) 的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列的多肽。c-Myc多肽(例如 那些与基因库登录号NM_002467中所提供的序列至少70％、75％、 80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％或100％一致的多 肽)和编码它们的核酸在本发明中作为重编程因子而获得应用。
Nanog多肽是一种包含与人类Nanog(即Nanog同源框，其序列 可见于基因库登录号NP_079141和NM_024865)的氨基酸序列至少 70％一致的氨基酸序列的多肽。Nanog多肽(例如那些与基因库登录号 NM_024865中所提供的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、 92％、95％、97％、99％或100％一致的多肽)和编码它们的核酸在本 发明中作为重编程因子而获得应用。
Lin-28多肽是一种包含与人类Lin-28(即秀丽隐杆线虫(C. elegans)的Lin-28同系物，其序列可见于基因库登录号NP_078950和 NM_024674)的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列的多肽。Lin-28 多肽(例如那些与基因库登录号NM_024674中所提供的序列至少 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％或100％ 一致的多肽)和编码它们的核酸在本发明中作为重编程因子而获得应 用。
Oct3/4多肽是一种包含与人类Oct3/4(也称为智人POU第5类同 源框1(POU5F1)，其序列可见于基因库登录号NP_002692和 NM_002701)的氨基酸序列至少70％一致的氨基酸序列的多肽。Oct3/4 多肽(例如那些与基因库登录号NM_002701中所提供的序列至少 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％或100％ 一致的多肽)和编码它们的核酸在本发明中作为重编程因子而获得应 用。
Sox2多肽是一种包含与人类Sox2(即性别决定区Y-框2蛋白， 其序列可见于基因库登录号NP_003097和NM_003106)的氨基酸序列 至少70％一致的氨基酸序列的多肽。Sox2多肽(例如那些与基因库登 录号NM_003106中所提供的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、 91％、92％、95％、97％、99％或100％一致的多肽)和编码它们的核酸 在本发明中作为重编程因子而获得应用。
已描述小分子适用于重编程细胞，所述小分子包括但不限于丙戊 酸、异羟肟酸、曲古霉素A、辛二酰苯胺异羟肟酸、BIX-01294和 BayK8644(参见Shi等(2008)Cell Stem Cell6；3(5):568-574和 Huangfu等(2008)Nature Biotechnology26:795-797，各自具体地说以 引用的方式并入本文中)。
术语“处理”等在本文中用于泛指获得所要药理和/或生理效果。 所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/ 或就部分或完全稳定或治愈疾病和/或可归因于所述疾病的有害作用 而言可以是治疗性的。如本文所用的“处理”涵盖对哺乳动物(尤其人 类)的疾病的任何处理，并且包括：(a)预防疾病或症状在预先倾向于 具有所述疾病或症状但尚未诊断为具有所述疾病或症状的受试者中 出现；(b)抑制疾病症状，即阻止其发展；或(c)减轻疾病症状，即使 疾病或症状退去。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用并 且指需要诊断、处理或治疗的任何哺乳动物受试者，尤其人类。
穿透结构域。许多穿透结构域是本领域中已知的并且可用于本 发明中，包括肽、拟肽类物质和非肽载体。在一个实施方案中，穿透 肽衍生自称为穿膜肽(penetratin)的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) 转录因子触角足蛋白(Antennapaedia)的第三α螺旋，其包含氨基酸序 列RQIKIWFQNRRMKWKK。在另一个实施方案中，穿透肽包含 HIV-1tat碱性区域氨基酸序列，其可包括例如天然存在的tat蛋白的 氨基酸49-57。其它穿透结构域包括聚精氨酸基序，例如HIV-1rev 蛋白的氨基酸34-56的区域、九精氨酸、八精氨酸等。(参见例如Futaki 等(2003)Curr Protein Pept Sci.2003年4月；4(2):87-96；和Wender 等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A2000年11月21日； 97(24):13003-8；公开的美国专利申请20030220334；20030083256； 20030032593；和20030022831，具体地说以引用的方式并入本文中 用于教示肽和类肽的移位)。九精氨酸(R9)序列是已表征(Wender等 2000；Uemura等2002)的较有效PTD中的一者。
体外诱导多能性的方法
在用有效剂量的先天免疫激活剂(例如TLR激动剂)激活体细胞 之前、同时或之后，使起始体细胞群与呈足以使细胞重编程为具有多 能性的组合和量的如上文所定义的重编程因子接触。在本发明的一个 实施方案中，TLR是TLR3。在一些实施方案中，TLR激动剂是双链 RNA或其类似物。重编程因子可个别地或以单一组合物形式(即以重 编程因子的预混组合物形式)提供给体细胞。
在一些实施方案中，使起始细胞群与呈在功能上等效于5ng/ml 到3000ng/ml聚I:C的剂量的有效剂量的TLR激动剂(例如LPS、 dsRNA等)接触，并且在此类激动剂存在下在培养物中维持约4到约 18天(例如约5到约10天并且可为约6到8天)的时间。
重编程因子可同时或在不同时间连续地添加到受试者细胞中，并 且可与先天免疫激活剂组合添加。在一些实施方案中，添加一组至少 三种纯化重编程因子，例如Oct3/4多肽、Sox2多肽和Klf4、c-myc、 nanog或lin28多肽。在一些实施方案中，向细胞中提供一组四种纯 化重编程因子，例如Oct3/4多肽、Sox2多肽、Klf4多肽和c-Myc多 肽；或Oct3/4多肽、Sox2多肽、lin28多肽和nanog多肽。
用于将重编程因子引入体细胞的方法包括提供具有纯化蛋白因 子的细胞。典型地，重编程因子多肽将包含融合到多肽穿透结构域中 的重编程因子的多肽序列。许多穿透结构域是本领域中已知的并且可 用于本发明的核作用非整合多肽，包括肽、拟肽类物质和非肽载体。 举例来说，穿透肽可衍生自称为穿膜肽的黑腹果蝇转录因子触角足蛋 白的第三α螺旋，其包含氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKK。作 为另一个实例，穿透肽包含HIV-1tat碱性区域氨基酸序列，其可包 括例如天然存在的tat蛋白的氨基酸49-57。其它穿透结构域包括聚精 氨酸基序，例如HIV-1rev蛋白的氨基酸34-56的区域、九精氨酸、 八精氨酸等。(参见例如Futaki等(2003)Curr Protein Pept Sci.2003 年4月；4(2):87-96；和Wender等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2000年11月21日；97(24):13003-8；公开的美国专利申请 20030220334；20030083256；20030032593；和20030022831，具体 地说以引用的方式并入本文中用于教示肽和类肽的移位)。九精氨酸 (R9)序列是已表征(Wender等2000；Uemura等2002)的较有效PTD 中的一者。
在此类实施方案中，细胞在纯化重编程因子多肽存在下孵育约 30分钟到约72小时，例如2小时、4小时、8小时、12小时、18小 时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或约30分钟到约 72小时的任何其它时间。典型地，四次将重编程因子提供到受试者 细胞中，并且使细胞与重编程因子一起孵育48小时，所述时间之后 将介质替换为新鲜介质并且进一步培养细胞(参见例如Zhou等人 (2009)Cell Stem Cells4(5)；381-384)。重编程因子可提供到受试者细 胞中约一周到约4周，例如约两周到约3周。
重编程因子的剂量将随细胞的性质、因子、培养条件等而变化。 在一些实施方案中，各因子的剂量将为约1nM到约1μM，更通常为 约10nM到约500nM或约100到200nM左右。在暴露于重编程作 用物期间细胞最初宜暴露于TLR激动剂至少约1天、至少约2天、 至少约4天、至少约6天或一周，并且可暴露整个重编程过程或更短 时间。剂量将视具体激动剂而定，但可为约1ng/ml到约1μg/ml、约 10ng/ml到约500ng/ml。可在各次提供之后与重组因子一起进行两 次16-24小时孵育，其后将介质替换为新鲜介质并且进一步培养细胞。
在一些实施方案中，使用不整合到体细胞基因组中的载体。适用 于将外源性基因转化到目标哺乳动物细胞中的许多载体是可获得的。 载体可保持游离，例如呈质粒、病毒衍生载体(诸如巨细胞病毒、腺 病毒)等形式。用于以核酸形式提供重编程因子到受试者细胞中的载 体将典型地包含适合的启动子，用于驱使重编程因子核酸的表达，即 转录激活。其可包括泛作用启动子，例如CMV-β-肌动蛋白启动子或 诱导型启动子，诸如在特定细胞群中具活性或对诸如四环素的药物的 存在有响应的启动子。通过转录激活，意在使靶细胞中的转录将增至 高于基础水平至少约10倍、至少约100倍、更通常至少约1000倍。
在引入重编程因子之后，体细胞可维持在包含饲养层细胞的常规 培养基中或可在不存在饲养层(即缺乏除那些诱导为多能细胞的体细 胞外的体细胞)的情况下培养。无饲养层培养物可使用蛋白质涂布表 面，例如基质胶等。
通过本发明的方法诱导变成此类细胞的iPS细胞具有hESC样形 态，以具有大核质比、清晰边界和突起的核的平面集落形式生长。此 外，iPS细胞可表达一种或多种本领域技术人员已知的主要多能细胞 标记，包括但不限于碱性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、 Nanog、TRA160、TRA181、TDGF1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、 TERT和zfp42。此外，iPS细胞能够形成畸胎瘤。此外，其能够形成 或有助于形式活生物中的外胚层、中胚层或内胚层组织。
基因可出于各种目的引入体细胞或由其衍生的iPS细胞中，例如 用于替换具有功能丧失型突变的基因、提供标记基因等。作为另外一 种选择，引入表达反义mRNA或核糖酶的载体，从而阻断不合希望 的基因的表达。其它基因治疗方法是引入耐药基因以使正常祖细胞能 够具有优势并且经受选择压力，例如多重耐药基因(MDR)或抗细胞凋 亡基因，诸如bcl-2。如上文所论述，可使用本领域中已知的各种技 术来将核酸引入靶细胞中，例如电穿孔、钙沉淀DNA、融合、转染、 脂质体转染、感染等。引入DNA的具体方式对本发明的实施来说并 不关键。
通过以上方法产生的iPS细胞可用于重建或补充接受者中正分化 或已分化的细胞。诱导的细胞可分化成各种谱系的细胞类型。分化细 胞的实例包括来自外胚层(例如神经元和成纤维细胞)、中胚层(例如心 肌细胞)或内胚层(例如胰腺细胞)谱系的任何分化细胞。分化细胞可为 一种或多种：胰腺β细胞、神经干细胞、神经元(例如多巴胺能神经 元)、少突胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞、肝细胞、肝干细胞、星 形胶质细胞、肌细胞、造血细胞或心肌细胞。
存在许多将诱导细胞分化成更特化细胞类型的方法。分化诱导细 胞的方法可类似于那些用于分化干细胞(尤其ES细胞、MSC、MAPC、 MIAMI、造血干细胞(HSC))的方法。在一些情况下，分化离体进行； 在一些情况下，分化体内进行。
诱导细胞或从诱导细胞分化的细胞可用作治疗疾病(例如遗传缺 陷)的疗法。所述疗法可针对治疗病因；或者所述疗法可治疗疾病或 病状的结果。诱导细胞可转化到或接近于受试者的损伤部位；或可以 允许细胞迁移或驻留在损伤部位的方式将细胞引入受试者。经转化的 细胞可有利地替换损坏或损伤细胞并且使受试者的总体病状改善。在 一些情况下，经转化的细胞可刺激组织再生或修复。
经转化的细胞可以是从诱导细胞分化的细胞。经转化的细胞还可 以是从诱导细胞分化的多能干细胞。在一些情况下，经转化的细胞可 以是尚未分化的诱导细胞。
向受试者施用治疗的次数可变化。将诱导和/或分化细胞引入受 试者可为一次事件；但在某些情况下，此类治疗可在有限时间引起改 善并且需要持续的一系列重复治疗。在其它情况下，观测到效果之前 可能需要多次施用细胞。确切方案视疾病或病状、疾病的阶段和所治 疗的个别受试者的参数而定。
可通过以下途径中的任一者将细胞引入受试者：非肠道、静脉 内、动脉内、肌肉内、皮下、经皮、气管内、腹膜内或脊髓液内。
iPS细胞可以任何生理学上可接受的方法施用。其可单独或与适 合的底物或基质(例如用于支持其生长和/或其所移植的组织中的构造) 一起提供。通常，将施用至少1×105个细胞，优选地1×106个或更多。 细胞可通过注射、导管等引入。细胞可在液氮温度下冷冻并且长时间 储存，解冻后能够使用。若冷冻，则通常将细胞储存在10％DMSO、 50％FCS、40％RPMI1640培养基中。一旦解冻，细胞可通过使用与 祖细胞增殖和分化有关的生长因子和/或基质细胞扩增。
可提供试剂盒，其中所述试剂盒将包含有效剂量的TLR激动剂。 在一些实施方案中，TLR激动剂是TLR3激动剂，例如双链RNA或 其类似物。试剂盒可进一步包含一种或多种例如呈融合到穿透结构域 中的蛋白质形式的重编程因子。
诱导体外或体内转分化的方法
如上文所定义的转分化是使体细胞核重编程为实质上不同的体 细胞，例如不同谱系的体细胞。转分化的实例包括但不限于：成纤维 细胞→肌细胞；成纤维细胞→内皮细胞；成纤维细胞→神经细胞；成 纤维细胞→胰岛细胞；成纤维细胞→造血细胞；等；脂肪组织细胞到 以下中的任一者：肌细胞、内皮细胞、神经细胞、造血细胞、胰岛细 胞等；等。适合作为起始群的细胞上文已定义。此方法可提供一致性 和在再生医学中的实际应用。
出于转分化的目的，将使用不同组的因子和对所衍生的细胞表型 具特异性的介质。典型地，将在细胞已暴露于聚I:C足以诱导先天免 疫的时间之后将分化因子提供到受试者细胞中。在一些实施方案中， 在不存在分化因子的情况下，细胞暴露于先天免疫激活剂。在一些实 施方案中，使起始细胞群与呈在功能上等效于5ng/ml到3000ng/ml 聚I:C的剂量的有效剂量的TLR激动剂(例如LPS、dsRNA等)接触， 并且在此类激动剂存在下在培养物中维持约4到约18天(例如约5到 约10天并且可为约6到8天)的时间。通过此方法诱导先天免疫之后， 细胞暴露于一种分化因子或其混合物。
举例来说，在以有效剂量进行TLR激动剂治疗约一周之后，通 过使细胞再暴露于分化因子一到四周来使细胞转分化。培养基可替换 为补充有对所衍生的细胞具特异性的生长因子的新鲜培养基。通过绘 制剂量反应曲线来测定所需因子的适当浓度。类似地，用包括基因表 达、形态和函数分析的一系列标准二级分析来表征转分化细胞。在许 多实施方案中，用于从多能细胞群(例如ES细胞、iPS细胞等)分化体 细胞类型的培养方案可应用于转分化。换句话说，已暴露于培养物中 的TLR激动剂足以诱导先天免疫的时间的细胞可接着暴露于常规用 于谱系特异性分化因子组。
细胞可分化成各种谱系的细胞类型。转分化细胞的实例包括来自 外胚层(例如神经元和成纤维细胞)、中胚层(例如心肌细胞)或内胚层 (例如内胚层细胞、胰腺细胞)谱系的任何分化细胞。转分化细胞可为 一种或多种：胰腺β细胞、神经干细胞、神经元(例如多巴胺能神经 元)、少突胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞、肝细胞、肝干细胞、星 形胶质细胞、肌细胞、造血细胞、内胚层细胞或心肌细胞等。
转分化细胞可以是末端分化细胞，或其可能能够产生特定谱系的 细胞。举例来说，细胞可以分化成各种多能细胞类型，例如神经干细 胞、心干细胞或肝干细胞。干细胞可接着进一步分化成新的细胞类型， 例如神经干细胞可分化成神经元；心干细胞可分化成心肌细胞；并且 肝干细胞可分化成肝细胞。
存在许多将诱导细胞分化成更特化细胞类型的方法。分化诱导细 胞的方法可类似于那些用于分化干细胞(尤其ES细胞、MSC、MAPC、 MIAMI、造血干细胞(HSC))的方法。在一些情况下，分化离体进行； 在一些情况下，分化体内进行。
在一些实施方案中，例如使用本文中实施例2中所阐述的方案使 TLR激动剂处理的细胞分化成内皮细胞。用聚I:C处理之后，在包含 有效剂量的BMP4、VEGF和bFGF的培养基中培养细胞。再5-10天 之后，将培养基替换为包含有效剂量的VEGF、bFGF和8-Br-cAMP 的内皮细胞培养基再持续10-20天。所得内皮细胞可按原样使用或可 在培养物中(例如在包含有效剂量的TGFβ受体抑制剂的培养基存在 下)进一步扩增。
任何已知从ES细胞产生神经干细胞的方法均可用于从TLR激动 剂处理的细胞产生神经干细胞。参见例如Reubinoff等,(2001),Nat, Biotechnol.,19(12):1134-40。举例来说，可通过在头蛋白或其它骨形 态发生蛋白拮抗剂存在下培养呈浮动聚集物形式的TLR激动剂处理 的细胞来产生神经干细胞，参见例如Itsykson等,(2005),Mol Cell Neurosci.,30(1):24-36。在另一个实例中，可通过在生长因子存在下以 悬浮液形式培养TLR激动剂处理的细胞以形成聚集物来产生神经干 细胞，例如FGF-2,Zhang等,(2001),Nat.Biotech.,(19):1129-1133。在 一些情况下，聚集物是在含有FGF-2的不含血清的培养基中培养。 在另一个实例中，TLR激动剂处理的细胞与小鼠基质细胞系(例如PA6) 在包含FGF-2的不含血清的培养基存在下一起培养。在另一个实例 中，TLR激动剂处理的细胞直接转移到含有FGF-2的不含血清的培 养基中以直接诱导分化。
衍生自TLR激动剂处理的细胞的神经干细胞可分化成神经元、 少突胶质细胞或星形胶质细胞。通常，用于产生神经干细胞的条件也 可以用于产生神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞。
多巴胺能神经元在帕金森氏病(Parkinson's Disease)和其它神经退 行性疾病中起关键作用并且因此受到特别关注。为促进分化为多巴胺 能神经元，可将TLR激动剂处理的细胞与PA6小鼠基质细胞系在不 含血清条件下一起共培养，参见例如Kawasaki等,(2000)Neuron, 28(1):3140。也已描述其它方法，参见例如Pomp等,(2005),Stem Cells 23(7):923-30；美国专利No.6,395,546，例如Lee等人,(2000),Nature Biotechnol.,18:675-679。
少突胶质细胞也可以产生自诱导细胞。诱导细胞分化为少突胶质 细胞可通过已知用于使ES细胞或神经干细胞分化成少突胶质细胞的 方法来实现。举例来说，可通过将诱导细胞或神经干细胞与基质细胞 一起共培养来产生少突胶质细胞，例如Hermann等(2004),J Cell Sci. 117(Pt19):4411-22。在另一个实例中，可通过在融合蛋白存在下培养 诱导细胞或神经干细胞来产生少突胶质细胞，其中白介素(IL)-6受体 或衍生物连接至IL-6细胞因子或其衍生物。还可以通过本领域中已 知的其它方法从诱导细胞产生少突胶质细胞，参见例如Kang等, (2007)Stem Cells25,419-424。
星形胶质细胞也可以由TLR激动剂处理的细胞产生。可通过在 神经原培养基存在下将TLR激动剂处理的细胞或神经干细胞与bFGF 和EGF一起培养来产生星形胶质细胞，参见例如Brustle等,(1999), Science,285:754-756。
TLR激动剂处理的细胞可通过本领域中已知的方法分化成胰腺β 细胞，例如Lumelsky等,(2001)Science,292:1389-1394；Assady等, (2001),Diabetes,50:1691-1697；D'Amour等,(2006),Nat.Biotechnol., 24:1392-1401；D'Amour等,(2005),Nat.Biotechnol.23:1534-1541。所 述方法可包括在补充有激活素A的不含血清的培养基中培养TLR激 动剂处理的细胞，随后在补充有全反视黄酸的不含血清的培养基存在 下培养，随后在补充有bFGF和烟酰胺的不含血清的培养基存在下培 养，例如Jiang等,(2007),Cell Res.,4:333-444。在其它实例中，所述 方法包括在不含血清的培养基、激活素A和Wnt蛋白存在下将TLR 激动剂处理的细胞培养约0.5到约6天，例如约0.5、1、2、3、4、5、 6天；随后在约0.1％到约2％(例如0.2％)FBS和激活素A存在下培 养约1到约4天，例如约1、2、3或4天；随后在2％FBS、FGF-10 和KAAD-环巴胺(酮基-N-氨基乙基氨基己酰基二氢肉桂酰基环巴胺) 和视黄酸存在下培养约1到约5天，例如1、2、3、4或5天；随后 与1％B27、γ分泌酶抑制剂和促胰岛素分泌素-4(extendin-4)一起培 养约1到约4天，例如1、2、3或4天；并且最后在1％B27、促胰 岛素分泌素-4、IGF-1和HGF存在下培养约1到约4天，例如1、2、 3或4天。
可从TLR激动剂处理的细胞分化肝细胞或肝干细胞。举例来说， 在丁酸钠存在下培养TLR激动剂处理的细胞可产生肝细胞，参见例 如Rambhatla等,(2003),Cell Transplant,12:1-11。在另一个实例中， 可通过在不含血清的培养基中在激活素A存在下培养TLR激动剂处 理的细胞，随后在成纤维细胞生长因子-4和骨形态发生蛋白-2中培 养所述细胞来产生肝细胞，例如Cai等,(2007),Hepatology,45(5): 1229-39。在一个示例性实施方案中，TLR激动剂处理的细胞如下分 化成肝细胞或肝干细胞：通过在激活素A存在下将TLR激动剂处理 的细胞培养约2到约6天，例如约2、约3、约4、约5或约6天， 并且接着在肝细胞生长因子(HGF)存在下将诱导细胞培养约5天到约 10天，例如约5、约6、约7、约8、约9或约10天。
TLR激动剂处理的细胞还可以分化成心肌细胞。骨形态发生蛋白 (BMP)信号传导受抑制可引起心肌细胞的产生，参见例如Yuasa等, (2005),Nat.Biotechnol.,23(5):607-11。可通过在白血病抑制因子(LIF) 存在下培养TLR激动剂处理的细胞或通过使其经受本领域中已知用 于从ES细胞产生心肌细胞的其它方法来产生心肌细胞，例如Bader 等,(2000),Circ.Res.,86:787-794；Kehat等,(2001),J.Clin.Invest., 108:407-414；Mummery等,(2003),Circulation,107:2733-2740。
用于从TLR激动剂处理的细胞产生其它细胞类型的方法的实例 包括：(1)培养诱导细胞在视黄酸、白血病抑制因子(LIF)、甲状腺激 素(T3)和胰岛素存在下以产生脂肪细胞，例如Dani等,(1997),J.Cell Sci.,110:1279-1285；(2)在BMP-2或BMP4存在下培养TLR激动剂 处理的细胞以产生软骨细胞，例如Kramer等,(2000),Mech.Dev., 92:193-205；(3)在各条件下培养TLR激动剂处理的细胞以产生平滑 肌，例如Yamashita等,(2000),Nature,408:92-96；(4)在β-1整合素存 在下培养TLR激动剂处理的细胞以产生角化细胞，例如Bagutti等, (1996),Dev.Biol.,179:184-196；(5)在白介素-3(IL-3)和巨噬细胞集落 刺激因子存在下培养TLR激动剂处理的细胞以产生巨噬细胞，例如 Lieschke和Dunn(1995),Exp.Hemat.,23:328-334；(6)在IL-3和干细 胞因子存在下培养TLR激动剂处理的细胞以产生肥大细胞，例如Tsai 等,(2000),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:9186-9190；(7)在地塞米松 (dexamethasone)和基质细胞层、青灰因子存在下培养TLR激动剂处 理的细胞以产生黑色素细胞，例如Yamane等,(1999),Dev.Dyn., 216:450-458；(8)在地塞米松、视黄酸、抗坏血酸、β-甘油磷酸酯存在 下将TLR激动剂处理的细胞与胎鼠成骨细胞一起共培养以产生成骨 细胞，例如Buttery等,(2001),Tissue Eng.,7:89-99；(9)在成骨因子存 在下培养TLR激动剂处理的细胞以产生成骨细胞，例如Sottile等, (2003),Cloning Stem Cells,5:149-155；(10)使胰岛素样生长因子-2在 TLR激动剂处理的细胞中过表达并且在二甲基亚砜存在下培养细胞 以产生骨骼肌细胞，例如Prelle等,(2000),Biochem.Biophys.Res. Commun.,277:631-638；(11)使TLR激动剂处理的细胞经受多种条件 用于产生白血球；或(12)在BMP4和以下中的一者或多者存在下培养 TLR激动剂处理的细胞以产生造血祖细胞：SCF、FLT3、IL-3、IL-6 和GCSF，例如Chadwick等,(2003),Blood,102:906-915。
在一些情况下，可将转分化体细胞的亚群纯化或分离。在一些情 况下，将一种或多种对所要细胞类型具特异性的单克隆抗体与细胞群 一起孵育并且将那些结合细胞者分离。在其它情况下，所要细胞亚群 表达受细胞类型特异性启动子控制的报告基因。
转分化细胞可用作一种疗法来治疗疾病，例如遗传缺陷。所述疗 法可针对治疗病因；或者所述疗法可治疗疾病或病状的结果。转分化 细胞可转化到或接近于受试者的损伤部位；或可以允许细胞迁移或驻 留到损伤部位的方式将细胞引入受试者。经转化的细胞可有利地替换 损坏或损伤细胞并且使受试者的总体病状改善。在一些情况下，经转 化的细胞可刺激组织再生或修复。
向受试者施用治疗的次数可变化。将诱导和/或分化细胞引入受 试者可为一次事件；但在某些情况下，此类治疗可在有限时间引起改 善并且需要持续的一系列重复治疗。在其它情况下，观测到效果之前 可能需要多次施用细胞。确切方案视疾病或病状、疾病的阶段和所治 疗的个别受试者的参数而定。
可通过以下途径中的任一者将细胞引入受试者：非肠道、静脉 内、动脉内、肌肉内、皮下、经皮、气管内、腹膜内或脊髓液内。
转分化细胞可转化到忍受广泛范围疾病或病症的受试者中。忍受 神经疾病或病症的受试者可尤其受益于细胞疗法。在一些途径中，转 分化细胞是移植到损伤部位的神经干细胞或神经细胞以治疗神经病 状，例如阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、多发性硬化、脑梗死、脊髓损伤或其它中枢神经系统病症， 参见例如Morizane等,(2008),Cell Tissue Res.,331(1):323-326；Coutts 和Keirstead(2008),Exp.Neurol.,209(2):368-377；Goswami和Rao (2007),Drugs,10(10):713-719。
为治疗帕金森氏病，可使诱导细胞分化成多巴胺作用神经元并且 接着移植到帕金森氏病受试者的纹状体中。为治疗多发性硬化，可使 神经干细胞分化成少突胶质细胞或少突胶质细胞祖细胞，其接着转化 到忍受MS的受试者中。
诸如缺血性心肌病、传导疾病和先天性缺陷的退行性心脏疾病可 受益于干细胞疗法，参见例如Janssens等,(2006),Lancet,367:113-121。
内皮细胞适用于改善脉管结构和功能，增强血管形成并且改善灌 注，例如在外周动脉疾病中。
胰岛细胞(或郎格罕氏岛(islet of Langerhans)的原代细胞)可移植 到忍受糖尿病(例如1型糖尿病)的受试者中，参见例如Burns等,(2006) Curr.Stem Cell Res.Ther.,2:255-266。在一些实施方案中，衍生自本发 明细胞方法的胰腺β细胞可移植到忍受糖尿病(例如1型糖尿病)的受 试者中。
在其它实例中，衍生自诱导细胞的肝细胞或肝干细胞移植到忍受 肝病(例如肝炎、肝硬化或肝功能衰竭)的受试者中。
造血细胞或造血干细胞(HSC)可移植到忍受血癌或其它血液或免 疫病症的受试者中。可能通过造血细胞或HSC治疗的血癌的实例包 括：急性成淋巴细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、慢性髓细胞 性白血病(CML)、何杰金氏病(Hodgkin's disease)、多发性骨髓瘤和非 何杰金氏淋巴瘤。往往，忍受此类疾病的受试者必须经历放射线和/ 或化学疗法治疗以快速杀死分裂的血细胞。将衍生自本发明方法的 HSC引入这些受试者可帮助重新填充耗尽的细胞储层。
在一些情况下，通过转分化衍生的造血细胞或HSC还可以直接 用于对抗癌症。举例来说，异体HSC的移植在治疗肾癌方面已展现 前景，参见例如Childs等,(2000),N.Engl.J.Med.,343:750-758。在一 些实施方案中，可将衍生自诱导细胞的异体或甚至自体HSC引入受 试者以治疗肾癌或其它癌症。还可以将衍生自诱导细胞的造血细胞或 HSC引入受试者以产生或修复除血细胞以外的细胞或组织，例如肌 肉、血管或骨胳。此类治疗可适用于许多病症。
应了解，本发明不限于所描述的特定方法、方案、细胞系、动物 物种或属、构筑体和试剂，因此当然可变化。还应了解，本文所用的 术语是仅出于描述特定实施方案的目的，并且不打算限制本发明的范 围，本发明的范围将仅由随附权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发 明所属领域技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文所描述类似 或等效的任何方法、装置和材料均可用于本发明的实施或测试，但现 描述优选的方法、装置和材料。
本文所提到所有出版物均出于描述和公开的目的以引用的方式 并入本文中，例如所述出版物中所描述并且可结合本发明使用的试 剂、细胞、构筑体和方法。提供上文所论述并且在本文通篇中的出版 物仅仅针对其在本申请提交日之前的公开内容。本文中所有内容均不 应视为承认本发明人无权凭借现有发明而先于此类公开内容。
公布以下实施例以便为本领域技术人员提供对如何制备和使用 本发明的完整公开和描述，并且不打算限制什么被视为本发明的范 围。已努力确保所用数值(如量、温度、浓度等)的准确性，但应允许 一些实验误差和偏差。除非另有陈述，否则份数是重量份，分子量是 平均分子量，温度是以摄氏度计，压力是大气压或接近大气压。
实验
实施例1
非整合核重编程中先天免疫的激活
重编程因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)的逆转录病毒过表达可产 生诱导性多能干细胞(iPSC)。然而，外来DNA的整合可诱导基因组 调节异常。克服此限制的一种途径是表达呈细胞穿透蛋白(CPP)形式 的因子。迄今为止，已证明此途径是困难的，并且尚未使用纯化CPP 重编程人类体细胞。我们发现由基于病毒与基于蛋白质递送的重编程 因子诱导的基因表达模式差异显著，表明有效核重编程所需的信号传 导途径由逆转录病毒而非CPP途径激活。在功能获得与功能丧失研 究两者中，我们发现toll样受体3(TLR3)的激活在核重编程效率方面 发挥作用。TLR3的刺激引起在染色质重塑情况下表观遗传修饰剂的 表达的快速改变和有利于诱导多能性的基因表达的改变。
在设法研发通过引入CPP有效重编程人类细胞的方案过程中， 我们偶然观察到与基于蛋白质的方法相对比在通过病毒诱导的基因 表达的模式中的有趣差异。通过将CPP与编码非相关基因的逆转录 病毒粒子组合或更实际上通过将CPP与toll样受体(TLR)激动剂组合 概括得到在逆转录病毒方法情况下观察到的基因表达的诱导更快速。 我们进一步观察到TLR3介导的信号传导的诱导促进为有效重编程所 需的表观遗传重塑。对先天免疫在核重编程中的作用和其定向操纵的 认识提供可促进我们了解先天免疫与重编程两者的关键理解，并且增 加我们对在诱导性多能性中起作用的遗传和表观遗传途径的了解。
结果
相对于细胞穿透肽通过病毒编码转录诱导的基因表达的不同模 式如先前所描述，我们的CPP是融合肽，各自具有重编程因子、连 接子和细胞转导结构域。如同样所描述，这些CPP展现同源DNA结 合活性、快速移位穿过细胞质和核膜、均匀转导所处理孔中的几乎所 有细胞并且对已知的下游目标基因施加转录控制。然而，在用各种实 验方案作出多次尝试之后，我们未能使用由我们小组或商业供应商产 生的CPP从人类成纤维细胞产生iPSC细胞系。
在努力理解并且克服此失败的过程中，我们检验了响应于逆转录 病毒构筑体(pMX-Sox2)相较于相应CPP(CPP-SOX2)的目标基因表达 的时间序列。我们将注意力集中于Sox2激活的基因的经验证的下游 目标，诸如Jarid2、Zic2和bMyb，以及已知在核重编程中起作用的 下游基因，即Nanog、Sox2和Oct4。通过血清饥饿法使人类成纤维 细胞同步并且接着使其单次感染pMX-Sox2或每天用CPP-SOX2处 理，并且在6天内分析基因表达。我们使用我们先前已证实能够相较 于Sox2而解救经shRNA处理的人类iPSC的CPP-SOX2日剂量(200 nM)。
观测到基因表达模式中的有趣差异。早在pMX-Sox2转染的第1 天，人类BJ成纤维细胞已显示多能细胞(例如Nanog)和目标基因的表 达增加(图1A和图8)。相比之下，尽管CPP-SOX2快速进入所处理 细胞的细胞质和核(2h内)，但其直至若干天后仍不显示相应的目标 基因表达增多(图1A)。因为各处理条件下所选基因(Jarid2、Zic2、 bMyb、Oct4、Sox2和Nanog)的时间表达模式显著类似，所以其随时 间推移的倍数表达变化以平均值形式显示于图1B中。
为排除目标基因表达延迟是单一CPP设计的函数的可能性，我 们重复这些比较CPP与针对Oct4的病毒载体(pMX-Oct4)的实验，评 估其对下游目标(Tcf4和GAP43)和多能性基因的影响。与用 pMX-Oct4转染的细胞相比，在用CPPOCT4处理的细胞中我们观察 到类似的延迟基因表达模式(图1C-D)。又，因为各处理条件下所选基 因(Tcf4、GAP43、Oct4、Sox2和Nanog)的时间表达模式显著类似， 所以其随时间推移的倍数表达的变化以组平均值显示于图1D中。这 些数据显示与暴露于呈纯化CPP形式的重编程因子的人类成纤维细 胞相比，暴露于在逆转录病毒载体中的重编程因子的人类成纤维细胞 的基因表达模式之间的极大差异。
病毒粒子促进CPP-TF诱导的基因表达我们假设病毒粒子(独 立于所编码的基因)的内在特征可影响重编程过程。为验证这一假设， 我们评估了CPP单独或在编码不参与重编程的基因的逆转录病毒存 在下的效果。pMX-GFP对照载体不影响目标基因表达(图8)。然而， 当pMX-GFP载体与CPP-SOX2组合时，下游基因的表达基本上增强， 从而再现由逆转录病毒表达载体pMX-Sox2诱导的基因表达的模式 (图2A-B和图S2A-C)。我们用CPP-OCT4重复了这些研究(图2和图 S2D-E)。当pMX-GFP载体与CPP-OCT4组合时，再次促进下游基因 的时间表达，与在病毒载体pMX-Oct4情况下观察到的效果相似(图 2C-D)。这些研究表明病毒粒子本身的一些内在特征对重编程因子对 基因表达的影响有贡献。
为获得对逆转录病毒粒子可促进核重编程的机制的更深入理解， 我们在逆转录病毒的pol编码区域附近引入移码突变代替pMX-GFP 的非整合突变。此突变可进入保持逆转录酶活性的完好病毒粒子的细 胞直接合成，但不能将新合成的病毒DNA整合到宿主基因组中。然 而，pMX-GFP非整合突变完全能够促进CPP-OCT4诱导的基因表达 (图10)。因此，外来DNA整合到宿主基因组中不是CPP与其相应病 毒载体之间的基因表达差异所需要的。病毒感染借助于与Toll样受体 (TLR)相互作用激活先天免疫。TLR识别与病毒蛋白、脂多糖、DNA 或RNA有关的病原体相关分子模式(PAMP)。我们假定先天免疫通过 TLR激活可真正涉及基因表达差异，我们观察到我们的逆转录病毒载 体(而非CPP)激活炎症(先天免疫反应)基因，包括toll样受体3 (TLR3)、NF-κB、IFN-β、Stat1和Stat2(图11)。
TLR3信号传导的基因敲低使由编码Oct4的病毒载体诱导的多能 基因表达降低。TLR信号传导途径由两条不同的途径组成：骨髓分化 初级反应基因(MyD)88依赖性途径，和MyD88非依赖性途径。MyD88 依赖性途径是所有TLR共有的，除了TLR3。为辨别哪一TLR信号 传导途径可涉及载体情况下的核重编程，我们使用抑制肽或对准 MyD88依赖性和非依赖性途径的元件的shRNA基因敲低。TLR3途 径由病毒dsRNA激活，并且独立于MyD88。TLR3的衔接子是TRIF (含TIR结构域的衔接子诱导的干扰素β)。
因此，为探索此途径在病毒构筑体对基因表达的影响中的作用， 我们将TLR3或TRIF基因敲低。此外，我们使用TRIF的细胞可穿 透肽抑制剂。正如所料，TRIF衔接子分子的肽抑制或通过TRIF或 TLR3的shRNA进行的基因敲低使pMX-Oct4引起的免疫应答基因的 激活显著降低(图12)。值得注意地，TLR信号传导的这些基因敲低也 使由pMX-Oct4诱导的目标和多能基因表达降低。TRIF的肽抑制剂 (肽抑制剂-TRIF)使pMX-Oct4诱导Oct4表达(图3A)以及其它所选基 因的表达(图3D)的效果减弱。类似地，TRIF的shRNA基因敲低(图 3B和3E)，以及TLR3的shRNA基因敲低(图3C和3F)也使pMX-Oct4 诱导所选基因表达的效果减弱。相比之下，抑制肽(图13A)或稳定 shRNA基因敲低(图13B)对MyD88的抑制对由pMX-Oct4诱导的目 标和多能基因表达没有影响。总而言之，这些研究表明TLR3(而非 其它TLR途径)是逆转录病毒表达载体完全诱导目标基因表达所需要 的。
TLR3信号传导是有效产生人类iPSC所需要的为确定TLR3信 号传导是否为有效产生人类iPSC所必需，我们使人类BJ成纤维细胞 暴露于编码OSKM到BJ成纤维细胞中的逆转录病毒载体，所述BJ 成纤维细胞事先用错义shRNA或shRNA处理以抑制(KD)TLR3、 TRIF或MyD88的表达(图4A)。转导后六天，将细胞在丝裂霉素C 处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上接种，并且第二天，将培养基用 iPSC培养基(含有8ng/ml碱性FGF)替换。约第25天，我们在错义-KD 和MyD88-KD细胞中观察到小集落；相比之下，在TRIF-KD或 TLR3-KD细胞中未观察到集落。在第30天，在含有错义-KD细胞和 MyD88-KD细胞的盘中注意到清晰的具有典型iPSC集落形态的集落 (图4B)。此时，TRIF-KD和TLR3-KD细胞仅显示小颗粒状集落。TRIF 和TLR3-KD细胞又用了9天来产生形态清晰的iPSC集落。我们人 工计算了具有典型形态特征的各清晰集落，以及那些第30天到第39 天出现的较小的颗粒状集落(在由对处理组设盲的观察者进行的两个 独立实验中)。如图4C所示，在早期时间点处TRIF-KD和TLR3-KD 细胞与错义-KD和MyD88-KD细胞相比产生显著较少的集落。此外， 我们比较了第30天这些集落之间的基因表达值。Oct4(图4D)、Sox2 和Nanog的表达当与TRIF-KD和TLR3-KD iPSC相比时上调大于10 倍。这些发现提供第一证据表明：TLR3激活为使用最初由Yamanaka 描述的方法有效诱导多能基因和产生人类iPSC集落所必需的。
TLR3激动剂促进CPP诱导的目标基因表达若TLR3激活在基 于病毒的重编程的效率中起作用，则添加TLR3激动剂预期将增强 CPP诱导的重编程。聚肌苷聚胞苷酸(聚I:C)是dsRNA的合成类似物， 其具体地说由TLR3识别并且其诱导参与先天免疫的基因的表达(图 14)。因此，我们评估了CPP单独或在聚I:C存在下的效果。目标基 因的表达不受单独聚I:C的影响。然而，当聚I:C(300ng/ml)与 CPP-SOX2组合时，促进下游基因的表达，从而再现由pMX-Sox2诱 导的基因表达的时间过程(图5A-B；和图15A-C)。我们用CPP-OCT4 重复了这些研究。当聚I:C与CPP-OCT4组合时，再次促进下游基因 的时间表达，与病毒载体pMX-Oct4情况下所观察的效果相似(图 5C-D；和图15D-E)。这些研究提供了对TLR3信号传导为重编程因 子有效诱导目标基因所需的假设的进一步支持。
TLR3激活使强力霉素诱导型系统产生iPSC的效率提高为进一 步验证TLR3激活为有效重编程所需的假设，我们从鼠胚胎分离表达 编码四种重编程因子的强力霉素(Dox)诱导型多顺反子转基因构筑体 的MEF。为产生iPSC，将6孔板中每孔105个MEF用Dox处理。在 一些孔中，在重编程过程的起初6天还添加聚I:C。在其它孔中，在 Dox处理的第一天用pMX-GFP感染细胞。聚I:C或pMX-GFP各促 进Oct4和Sox2的表达(图6A)。聚I:C以及pMX-GFP促进在第3天 孔中聚集的小而紧密的圆形细胞的MEF的形态变化(图16)。类似地， 用pMX-GFP感染似乎促进集落形成，因为在病毒粒子感染组中在第 7天观察到许多小集落(图16)。在第14天，典型mES样集落出现， 其中许多具有激活的SSEA-1。此时间点，在暴露于病毒粒子或聚I:C 的孔中典型SSEA-1+集落的数目增加7-8倍(图6B)。在第21-28天集 落数进一步增加(图6B和6C)。这些研究证实TLR3激活使核重编程 为多能细胞增强。
TLR3激活使CPP诱导产生人类iPSC增强已知重编程因子的持 续表达(约2周)是使用病毒载体产生小鼠iPSC所需要的。然而，甚 至在连续暴露于CPP6-30天之后我们仍未能产生人类iPSC。我们假 设TLR3途径的激活可促进为CPP的完全转录效果所需的表观遗传 变化。我们还试图通过在6天后降低CPP的剂量来模拟以病毒载体 形式引入的重编程因子的双相效果。因此，我们使人类成纤维细胞在 第1-6天存在或不存在聚I:C(300ng/ml)的情况下暴露于四种CPP-转 录因子(Oct4-R11、Sox2-R11、Klf4-R11和cMyc-R11)(第1-6天以200 nM的剂量，并且第7-21天以100nM的剂量)(图7A)。在第26天 将培养物转化到饲养细胞(去活化MEF)中。在聚I:C存在下，Oct4表 达得以促进(图7B)。此外，聚I:C促进iPSC产生(图7C-D)。第21 天观察到小集落并且第30天出现ES样集落，其中许多如活细胞染 色所指示表达TRA-1-81。相比之下，在不暴露于聚I:C的人类成纤 维细胞中，直到第30天仍未观察到集落。第40天，在暴露于聚I:C 的细胞中，集落数增加大于4倍(图7C)。我们关于TLR3信号传导在 核重编程中的作用的理解的应用使我们成功地使用CPP重编程人类 成纤维细胞为多能细胞。
TLR3激活引起有利于重编程的表观遗传变化我们假设TLR3激 活可通过诱导开放染色质状态从而允许重编程因子诱导ESC特异性 基因表达模式来使早期转录激活增强。因此，我们进行了芯片分析， 以检测组蛋白H3在第4位赖氨酸处的三甲基化(H3K4me3)。此表观 遗传修饰标记转录活性基因。在聚I:C或pMXGFP存在下用pMXSox2 或用CPPSox2处理人类成纤维细胞。在处理的第2天，单独pMXSox2 (而非CPPSox2)诱导在Oct4启动子处的H3K4三甲基化(图8A)。然 而，在病毒载体或聚I:C存在下，在第2天CPPSox2诱导H3K4三甲 基化的变化(图17)。尽管单独CPPSox2可诱导H3K4三甲基化(图 18A)，但仅是在一段时间滞后以后，这反映了其对目标基因表达的延 迟作用。类似地，在CPP处理的成纤维细胞中，聚I:C或编码GFP 的逆转录病毒载体促进在Sox2启动子处的H3K4三甲基化(图18C)。 以类似方式，我们评估了Oct4和Sox2启动子中第9位赖氨酸处的组 蛋白H3(H3K9me3)。此表观遗传修饰标记转录沉默基因。在处理的 第2天，单独pMXSox2(而非CPPSox2)使Oct4启动子处的H3K9三 甲基化完全逆转(图17)。聚I:C或pMXGFP使第2天由CPPSox2诱 导的H3K9三甲基化增强(图17)。尽管单独CPPSox2可使Oct4启动 子处的H3K9三甲基化完全逆转(图18B)，但仅是在一段时间滞后以 后，这反映其对目标基因表达的延迟作用。类似地，在CPP处理的 成纤维细胞中，聚I:C或编码GFP的逆转录病毒载体促进在Sox2启 动子处的H3K9三甲基化的损失(图18D)。这些研究提供一种表观遗 传机制，用以解释TLR3激活增强核重编程的作用。
TLR3激活调节表观遗传机构：NF-κB的作用组蛋白乙酰基化 状态影响染色质的折叠和功能状态并且调节DNA对用于基因表达的 转录机构的可及性。组蛋白去乙酰基化通常与闭合染色质状态有关， 并且使用组蛋白去乙酰基化酶(HDAC)抑制剂(诸如丙戊酸)来增强核 重编程。因此，应注意，聚I:C下调一套HDAC基因在CPP处理的 人类成纤维细胞中的表达。聚I:C对HDAC1表达的下调是通过蛋白 质印迹分析确认(图17)。在上文所描述的dox诱导型MEF中并且在 图6中注意到类似的聚I:C对HDAC家族的下调。
聚I:C显著影响其它表观遗传修饰剂的表达。此外，由TLR3激 活促进的Oct4和Sox2启动子的甲基化状态的变化还与被促进的异染 色质蛋白1(HP1；图19A和19B)的再分配有关。结合于甲基化H3K9 的HP1补充甲基化酶Suv39h，从而引起H3K9的进一步甲基化，以 便巩固抑制状态。由聚I:C诱导的HP1再分配与由TLR3激活诱导的 全基因组表观遗传变化一致。组蛋白乙酰基化喜欢由含有组蛋白乙酰 基转移酶(HAT)结构域的蛋白质(诸如p300和CBP)所维持的开放染色 质状态。NF-κB是TLR3激活的转录效应因子，并且与CBP/p300相 互作用以正向调节基因表达。我们使用荧光素酶报告子分析系统来证 明单独聚I:C(而非CPP)诱导的NF-κB激活(图20)。此效应由TLR3 介导，因为TLR3或其衔接蛋白TRIF1的shRNA基因敲低使聚I:C 对NF-κB激活的影响降低(图20)。类似地，逆转录病毒构筑体以及 聚I:C诱导NF-κB和TLR3的表达的持续增加，而CPP-SOX2并不如 此(图20)。这些研究表明TLR3激活诱导表观遗传机制的基因表达的 变化的效应可部分由NF-κB介导。
在使用细胞穿透肽(CPP)的同时设法诱导多能性的过程中，我们 偶然发现先天免疫信号传导在有效核重编程中的作用。我们的突出观 察结果是：1.)在暴露于呈逆转录病毒载体与CPP形式的重编程因子 的细胞之间观察到基因表达的时间特征的一致差异；2.)当使用逆转录 病毒载体来过表达重编程因子时，TLR3基因敲低抑制下游目标基因 的激活，并且使产生人类iPSC的效率和产量降低；3.)TLR3激活促 进使用CPP的下游目标基因的表达；使dox诱导型系统中产生miPSC 的效率和产量提高；并且当使用呈CPP形式的重编程因子时使产生 人类iPSC的效率和产量提高，并且4.)TLR3激活诱导表观遗传变化， 包括Oct4和Sox2启动子的甲基化状态的变化，以及表观遗传效应因 子的表达的变化，其促进开放染色质构型。此报告首次在多能细胞诱 导中的核重编程效率与炎症途径之间建立直接联系。
未被了解的TLR3活性在重编程中的作用。TLR3识别由逆转录 病毒产生的双链RNA(dsRNA)。TLR信号传导对有效核重编程的重 要性尚未被了解。我们证实肽抑制剂情况下途径的基因敲低或TLR3 或其衔接蛋白TRIF的shRNA基因敲低使得使用逆转录病毒载体产 生人类iPSC的效率和产量降低。我们证实了TLR信号传导在使用经 基因工程化以表达编码重编程因子的强力霉素诱导型盒的鼠胚胎成 纤维细胞的无病毒系统中的重要性。在此系统中，TLR3激动剂聚I:C 共施用使鼠iPSC的效率和产量增加(图6)。值得注意地，在共施用编 码GFP的逆转录病毒情况下观察到相同效果，所述逆转录病毒预期 将激活TLR3，而不以其它方式影响核重编程过程。我们的研究表明 用于诱导多能性的逆转录病毒载体不只是用于递送重编程因子的媒 介物，并且对重编程过程有积极贡献。
TLR3激活增强重编程。先天免疫反应激活影响核重编程的认识 允许我们提高使用呈CPP形式的重编程因子的人类iPSC的效率和产 量。迄今为止，尚未使用纯化CPP将人类体细胞重编程为多能细胞。 已使用衍生自过表达Yamanaka因子的HEK细胞的提取物产生人类 iPSC。然而，有可能这些细胞提取物含有可触发炎症途径的因子(例 如病毒DNA)。即便如此，我们仍了解到有可能用单独CPP实现核重 编程。此成功仅在我们修改我们的实验方案以便模拟在重编程因子的 逆转录病毒施用情况下观察到的双相基因表达模式之后实现(即我们 第6天开始降低所施用CPP的剂量)。
TLR3和表观遗传修饰。TLR3激活提高产生人类iPSC的产量和 效率的效果似乎部分归因于其对表观遗传修饰剂的表达或分配的调 节。我们使用cDNA分型来检验TLR3激活的效果。我们观察到组蛋 白去乙酰基酶家族的抑制，其中HDAC1、2、5和7的表达显著降低。 我们还观察到甲基转移酶SMYD1、PRMT2、6和8；组蛋白-赖氨酸 -N-甲基转移酶ASH1l；和丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶Nek6的下调。与 表观遗传修饰剂的表达的变化相关联，我们观察到在Oct4和Sox2启 动子区域上与开放染色质构型一致的组蛋白修饰(图17、18)。然而， 值得注意地，在单独TLR3激活情况下未观察到这些启动子的H3K4 三甲基化的增加和H3K9三甲基化的减少。仅在CPP存在下，聚I:C 诱导这些甲基化标记的变化。此观测结果显示，尽管TLR3激活引起 可促进多能细胞基因的开放染色质构型的表观遗传修饰剂的表达的 普遍变化，重编程蛋白质可能是将表观遗传修饰剂引导到适当启动子 序列中所必需的。此观点还由HP1α分配的共焦图像(图S19A-C)支持。
异染色质蛋白-1(HP1)与闭合染色质构象有关。尽管我们未看到 HP1表达的表达水平的变化(图19D)，但当CPP-SOX2与聚I:C一起 或与编码GFP的逆转录病毒载体一起共施用时我们观察到其分配的 显著变化。然而，在不存在CPP的情况下，不存在可观察到的由聚 I:C或逆转录病毒载体单独诱导的HP1再分配。五类病原体识别受体 (PRR)中的任一者均已显示以类似于TLR3的方式进行信号传导，并 且预期可促进核重编程。当前研究暗示TRIF信号传导的事实可能与 逆转录病毒RNA提供足够TLR3信号传导以触发NF-κB、IRF3和IFN 的事实一致。虽然TLR3模拟逆转录病毒载体的信号传导，但其它 TLR激动剂以及NOD样受体、RIG-I样受体、胞质DNA传感器和C 型凝集素受体的激动剂驱动集中于NF-κB、IRF-3和IFNβ的类似炎 症反应。
总之，我们的观测结果突出了先前未被识别的先天免疫激活在核 重编程中的作用。用于诱导多能性的载体不只是仅用于重编程因子的 媒介物。其对TLR3受体的刺激诱导表观遗传激活，这会促进重编程 因子对其下游目标基因的作用。对先天免疫信号传导在核重编程中的 作用的认识可产生提高重编程的效率和质量并且改进iPSC的治疗应 用的见解。
实验程序
将衍生自包皮的细胞BJ人类成纤维细胞(Stemgent)在具有10％ FBS和1％青霉素/链霉素(pen-strep)抗菌素的DMEM中在湿润的5％ CO2孵育器中在37℃下培养。关于MEF分离，在第E13.5天从获自 杰克逊实验室(Jackson Laboratory)的来自Col1a1基因座的表达loxP 侧翼dox诱导型多顺反子4F2A盒(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)的单基 因转基因R26rtTA；Col1a12lox-4F2A小鼠分离嵌合胚。在移除头部和内部 器官之后，将其余组织物理地分离并且在胰蛋白酶中在37℃下孵育 20分钟，其后将细胞再悬浮于含有嘌呤霉素(2μg/ml)的MEF介质中 并且扩增两代，然后冷冻。
病毒制剂和感染HEK293FT细胞以每个T225烧瓶6×106个细胞 进行涂铺并且孵育过夜。用10μg VSV-G(包膜蛋白)、15μg pUMVC (包装质粒)和10μg所关注基因(Sox2或Oct4)与脂质体一起转染细 胞。转染后48小时，收集转染体的上清液并且通过0.45μm过滤器 过滤。以17,100rpm旋转2小时20分钟之后，将病毒团块再悬浮以 制备100倍储备溶液。在6孔盘中以每孔5×104个细胞接种人类成纤 维细胞，一天后转导。将培养基用补充有8μg/ml凝聚胺的含病毒上 清液替换，并且孵育24小时。
在60-70％融合时进行处理，使用1％血清对BJ成纤维细胞进行 血清饥饿处理以诱导G1细胞周期停止。接着，使经同步的BJ成纤 维细胞经受逆转录病毒构筑体单一感染或每天用200nM CPP (CPP-SOX2或CPP-OCT4)处理。将聚I:C(300ng/ml)与CPP同时添 加到细胞中。对于涉及肽抑制剂的实验，将细胞在40μM下用MyD88 抑制肽(肽抑制剂-MyD)或TRIF抑制肽(肽抑制剂-TRIF)预处理6h， 随后进行CPP处理。
用RNeasy试剂盒将基因表达和微阵列分析RNA分离。用oligo (dT)引物起始第一链cDNA并且用来自Applied Biosystems的引物组 进行qPCR。制备RNA探针并且杂交到伊鲁米那人HT-12v4表达微 珠芯片(Illumina HumanHT-12 v4 Expression BeadChip)微阵列中。
短发夹RNA设计短发夹RNA是获自Invivogen。目标序列：M yD88shRNA，AACTGGAACAGACAAACTATC；TRIF shRNA，A AGACCAGACGCCACTCCAAC和TLR3shRNA，GCTTGGCTTCC ACAACTAGAA
如先前所描述进行染色质免疫沉淀和ChIP-qPCR qChIP(Lim等, 2009；Peng等,2009)。对于qChIP和qRT-PCR，误差估计值是标准 偏差。用免疫沉淀物中的拷贝数与输入对照值的比率计算以输入百分 比表示的基因组DNA的回收率。Oct4和Sox2启动子的引物购自Cell Signaling。
iPSC的产生逆转录病毒-iPSC：如先前所描述(Takahashi等, 2007；Takahashi和Yamanaka,2006)，将事先用MyD88、TRIF、TLR3 或错义shRNA处理的人类成纤维细胞用pMX-Oct4、Sox2、Klf4和 cMyc逆转录病毒转导并且在iPSC培养基中在经丝裂霉素处理的 MEF上培养。随时间推移计算集落的数目，并且将其收获用于RNA 分离、关于多能基因表达的qPCR分析。
蛋白质-iPSC：在C端含有十一精氨酸膜渗透结构域的重组 Oct4、Sox2、Klf4和cMyc人类蛋白(CPP)获自Stemgent。将人类成 纤维细胞用编码重编程因子的CPP(CPP-Oct4、CPP-Sox2、CPP-Klf4 和CPP-Myc)处理，每天用200nM CPP持续6天，随后从第7天到 第20天每天用100nM CPP处理。同时添加聚I:C(300ng/ml)或媒介 物到细胞中仅到第6天。在第30天将细胞传代到MEF饲养细胞上。 在CPP处理20天后，仔细扫描各孔的集落。
强力霉素诱导的iPSC：如先前所描述(Wernig等,2008)，分离来 自第E13.5天的嵌合胚的MEF。在六孔板中每孔涂铺4×104个次级 MEF(#4代)并且用强力霉素(2μg/mL)±聚I:C(300ng/ml)处理。每天 监测iPSC集落的产生并且在第14天和第21天进行打分。
NF-κB荧光素酶分析将BJ成纤维细胞(3×105)在6孔板中接种并 且使其在存在或不存在聚IC(300ng/ml)的情况下经受pMX-GFP感 染、CPP-SOX2处理。使用脂质体2000(Lipofectamine2000)将细胞用 作为阳性对照质粒的pNF-κB-Luc和pFC-MEKK转染。转染后二十 四小时，收集细胞以便使用光度计通过Bright-GloTM荧光素酶分析系 统测量荧光素酶活性。
活细胞的免疫染色为检测活细胞中的SSEA-1或TRA-1-81，将 原始Ab(抗小鼠SSEA-1，抗人TRA-1-81，Stemgent)稀释到于新鲜细 胞培养基中2.5到5μg/ml的最终浓度并且在37℃和5％CO2下与细 胞一起孵育30分钟。温和洗涤之后，在荧光显微镜下检验细胞。
蛋白质印迹法通过将细胞溶解于含有1倍蛋白酶抑制剂混合物 的RIPA缓冲液中来从BJ成纤维细胞中提取蛋白质。装载25μg总蛋 白并且在SDS聚丙烯酰胺凝胶上溶解，转移到PVDF膜上并且用以 下第一抗体作探针：抗HP1α和抗HDAC(Cell Signaling)以及β-肌动 蛋白(Sigma，A5441)。用高级化学发光试剂使免疫印迹显影。
实施例2
成纤维细胞直接重编程为功能性内皮细胞(EC)：
如上文所公开，已证实EC可衍生自ESC或iPSC，并且这些多 能干细胞衍生的EC可增强鼠PAD模型中的肢体灌注和血管形成。 然而，分化细胞的其它来源(诸如自体EC)也非常合乎需要。尤其对 于临床应用来说，需要发展涉及最小程度使用遗传操纵(即非整合因 子)的策略。先天免疫(例如通过toll样受体)途径在核重编程中起重要 作用，并且重要地，当被激活时，可引起表观遗传修饰剂的表达的快 速和总体变化以增强染色质重塑。
在认可先天免疫在核重编程中的作用和其定向操纵喜欢开放染 色质状态的情况下，我们假设TLR3的激活与驱动EC特异化的外部 微环境诱因一起可诱导成纤维细胞转分化成EC。
为确定人类成纤维细胞是否可通过先天免疫激活转化成EC，将 人类包皮成纤维细胞(BJ)用聚I:C(30ng/ml)处理并且在成纤维细胞培 养基和所规定的不含血清的生长培养基的混合物中培养(图1A)。培养 7天后，将培养基变为补充有bFGF(20ng/ml)、VEGF(50ng/ml)和 BMP4(20ng/ml)的分化诱导培养基，其已知促进内皮细胞谱系的诱 导。为进一步增加内皮细胞转分化的效率，我们添加8-Br-cAMP(一 种环AMP依赖性蛋白激酶激动剂)到我们的方案中，因为其增强内皮 细胞特异化。分化28天后，将细胞分离并且通过荧光激活细胞分选 (FACS)针对EC特异性标记VE-钙粘蛋白或CD31进行纯化。相对于 媒介物对照，约2％细胞表达CD31(图21B)。为进一步增强诱导内皮 细胞(iEC)的扩增，我们添加SB431542(一种特异性TGFβ受体抑制 剂)，其促进ESC衍生的内皮细胞生长并且形成薄片。扩增之后，将 iEC针对VE-钙粘蛋白或CD31进行分选，显示77％纯度(图21B)。
扩增之后，iEC形成典型“鹅卵石”单层，并且持续表达内皮细胞 标记，包括CD31、VE-钙粘蛋白、KDR、温韦伯氏因子(vWF)和eNOS。 类似地，免疫荧光染色显示这些iEC对EC标记(诸如CD31、VE-钙 粘蛋白和vWF)呈阳性(图21C)。此外，这些iEC能够并入乙酰基化 LDL并且在基质胶上形成管状结构网状物(图21D-E)。此外，这些iEC 显示当将其放置于基质胶中并且添加生长因子VEGF后进行皮下注 射时形成毛细管的能力(图21F)。
iEC在外周动脉疾病模型中的治疗性潜力：(iEC在小鼠外周动 脉疾病模型中改善血液灌注)。为在功能上表征iEC并且测定其脉管 再生能力，我们使用小鼠的后肢缺血模型，其中缺血是通过结扎NOD SCID小鼠的股动脉来诱导。接着将小鼠分配以接受iEC、人类EC或 媒介物肌肉注射(到达腓肠肌)。为分析皮下后肢灌注，进行激光多普 勒灌注成像分析以确定在缺血后肢上移植iEC的效果。与媒介物处理 的小鼠相比，在iEC处理的小鼠中后肢灌注比(缺血后肢/对照后肢) 显著提高(图22A-B)。为确认激光多普勒数据，在第18天将缺血后肢 的部分通过免疫荧光染色用小鼠CD31抗体染色以评估毛细管密度。 与对照组相比，在iEC组中小鼠CD31阳性毛细管密度显著较大(图 22C和D)。此外，由设盲观察者评估后肢缺血以获得后肢缺血得分， 其显示在iEC处理的小鼠中血液灌注和再生显著改善(图22E)。
先天免疫(TLR3信号传导)使成纤维细胞能够有效转分化为EC： 为测定TLR3信号传导是否为人类成纤维细胞有效转分化所必需的， 我们评估了事先用错义shRNA或shRNA处理以抑制(KD)TLR3表达 的BJ成纤维细胞的直接分化。在用聚I:C(30ng/ml)和化学上定义的 分化培养基处理之后，将细胞在补充有生长因子(bFGF、VEGF和 BMP4)的EC特异性培养基中培养。分化28天后，将细胞分离并且 针对VE-钙粘蛋白进行FAC分选(图23A)。如图23B所示，当用聚 I:C处理时，与TLR3-KD细胞相比错义处理的细胞产生显著较多的 iEC。尽管当与错义细胞相比时从TLR3KD细胞产生的iEC仅显示 EC标记的基因和蛋白质表达适度降低，但其显示其吸收乙酰基化 LDL的能力显著降低(图23C)并且在基质胶上形成管状结构网状物 (图24D)。为进一步阐明涉及转分化的TLR3信号传导元件，我们抑 制了下游效应因子NFκB的作用。NF-κB是TLR3激活的转录效应因 子并且与CBP/p300相互作用以正向调节基因表达。我们发现聚I:C 使成纤维细胞转分化为iEC显著增强。此聚I:C增强转分化(图23E) 的作用因添加p65诱饵而显著降低，表明TLR3诱导的NFkB激活参 与直接重编程。
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