检测酪氨酸酶 mRNA 用引物 技术领域 ：
本发明涉及一种用于检测酪氨酸酶 ( 以下称 “TYR” )mRNA( 信使核糖核酸 ) 的引 物。 更具体地， 涉及一种适宜检测试样中 TYR mRNA 的引物、 引物对及 TYR mRNA 的检测方法。 背景技术 ：
TYR 是动物和植物细胞中酪氨酸氧化合成黑色素这一反应的催化酶之一。近年来 的研究表明， TYR 作为检测黑色素瘤的淋巴结转移的分子标记十分有用。例如， 非专利文献 1 中公开了一种技术， 用从生物体采集的淋巴结制备测定试样， 通过 RT-PCR 法检测测定试 样中的 TYR mRNA， 以此可判断有无黑色素瘤的淋巴结转移。
在先技术文献
非专利文献
非专利文献 1 ： 亚伯拉罕森 (Abrahamsen) 等人， 《在前哨淋巴结中定量黑色素瘤 mRNA 标记 ： 临床前评价单步实时逆转录聚合酶链反应检测 (Quantification of Melanoma mRNA Markers in Sentinel Nodes ： Pre-Clinical Evaluation of a Single-Step Real-Time ReverseTranscriptase-Polymerase Chain Reaction Assay)》 ， 2004 年 8 月第 6 卷第 3 号 P.253-259 发明内容 ：
如上所述， TYR mRNA 作为检测黑色素瘤等癌症的分子标记十分有用。但是， 非专 利文献 1 中记述的技术在检测时应用的是可以灵敏地检测靶核酸的 RT-PCR 法， 因此， 虽然 也能检测出癌细胞向淋巴结的微小转移， 但检测非常费时间 (2-4 个小时 )。
本发明的目的之一是提供可以用比过去的技术更短的时间检测出 TYRmRNA 的 TYR mRNA 检测用引物、 TYR mRNA 检测用引物对、 TYR mRNA 检测用试剂盒以及 TYR mRNA 检测方 法。
即本发明涉及
[1] 一种酪氨酸酶 mRNA 检测用引物， 该酪氨酸酶 mRNA 检测用引物用于检测试样中 的酪氨酸酶的 mRNA，
它在 5’ 末端一侧包含第一序列， 在 3’ 末端一侧包含第二序列，
上述第一序列
(a1) 长度为 10-30 个核苷酸
(b1) 是一种能与序列号 1 的部分区域——第一区域的互补链杂交的多聚核苷酸 序列，
上述第二序列
(c1) 长度为 10-30 个核苷酸
(d1) 是一种可与序列号 1 中比第一区域靠近 3’ 末端一侧的第二区域杂交的多聚 核苷酸序列，上述第二区域含有
(i) 序列号 1 的第 901 及 902 位核苷酸、 或
(ii) 序列号 1 的第 1118 及 1119 位核苷酸 ；
[2] 一种酪氨酸酶 mRNA 检测用引物对， 该酪氨酸酶 mRNA 检测用引物对用于检测试 样中的酪氨酸酶的 mRNA，
其包括第一引物、 第二引物及第三引物，
上述第一引物是权利要求 1 所记述的引物，
上述第二引物在 5’ 末端一侧含有第三序列， 在 3’ 末端一侧含有第四序列，
上述第三序列
(a2) 长度为 10-30 个核苷酸
(b2) 是一种可与序列号 1 中比第一区域靠近 5’ 末端一侧的第三区域杂交的多聚 核苷酸序列，
上述第四序列
(c2) 长度为 10-30 个核苷酸
(d2) 是一种可与上述序列号 1 中比第三区域靠近 5’ 末端一侧的第四区域的互补 链杂交的多聚核苷酸序列， 上述第三引物由可与上述序列号 1 中比第四区域靠近 5’ 末端一侧的第五区域的 互补链杂交的多聚核苷酸序列组成 ；
[3] 一种酪氨酸酶 mRNA 检测用试剂盒， 包括
上述 [2] 所记述的引物对、
dNTPs、
具有以 RNA 为模板合成 DNA 的作用和边进行链置换边以 DNA 为模板合成 DNA 的作 用的酶、 或 RNA 依赖性 DNA 聚合酶及 DNA 依赖性 DNA 聚合酶 ；
[4] 一种酪氨酸酶 mRNA 检测方法， 包括以下步骤 ：
使试样、 上述 [2] 所述引物对及 RNA 依赖性 DNA 聚合酶发生反应， 由上述试样中的 酪氨酸酶 mRNA 合成 cDNA，
使上述引物对、 DNA 依赖性 DNA 聚合酶和在上述步骤合成的 cDNA 发生反应， 扩增 上述 cDNA， 以及
通过检测在上述步骤扩增的 cDNA， 检测上述试样中的酪氨酸酶 mRNA ；
[5] 一种酪氨酸酶 mRNA 检测方法， 包括以下步骤 ：
使试样和上述 [2] 所述引物对与具有以 RNA 为模板合成 DNA 的作用和边进行链置 换边以 DNA 为模板合成 DNA 的作用的酶发生反应， 以上述试样中的酪氨酸酶 mRNA 为模板合 成 cDNA， 并以此 cDNA 为模板再合成该 cDNA 进行扩增，
通过检测在上述步骤扩增的 cDNA， 检测上述试样中的酪氨酸酶 mRNA。
采用本发明的 TYR mRNA 检测用引物、 TYR mRNA 检测用引物对、 TYR mRNA 检测用试 剂盒以及 TYR mRNA 检测方法， 可以在短时间内检测出 TYR mRNA。
附图说明 ：
图 1 为引物及引物杂交的区域的示意图。具体实施方式 ：
( 引物及引物对 )
首先就检测 TYR mRNA 用的 TYR mRNA 检测用引物进行说明。
在本说明书中， 所谓 “检测” 不仅指判断试样中是否存在靶物质—— TYR mRNA， 还 包括定量试样中的 TYR mRNA。
在本说明书中， 所谓 “引物”指在 LAMP( 环介导等温扩增反应， Loop-mediated Isothermal Amplification) 法 ( 参照美国专利第 6410278 号公报以及美国专利第 6974670 号公报 ) 等核酸扩增技术中， 与扩增目标核酸的特定区域杂交的多聚核苷酸， 该多聚核苷 酸具有能作为聚合酶扩增反应起点的功能 ( 以下， 称为 “引物功能” )。待检测核酸是 mRNA， 故可以通过包括逆转录反应的核酸扩增反应 ( 例如 ： RT-LAMP 法等等 ) 加以检测。
所谓 “杂交” 是指在严格条件下， 基于多聚核苷酸碱基之间的互补性， 某多聚核苷 酸的一部分或全部序列通过氢键与其它多聚核苷酸的一部分或全部序列结合。
所谓 “严格条件” 指进行多聚核苷酸杂交时该行业专业人士普遍使用的条件， 只要 满足本实施方式的引物能与 TYR mRNA 或其 cDNA 杂交这一条件即可， 无特别限定。已知， 杂 交时的严格条件是指温度、 盐浓度、 引物链长、 引物中 GC 含量以及杂交缓冲液中的离液剂 浓度函数。例如作为严格条件， 可以使用 Sambrook， J. 等， 1998， 分子克隆 ： 实验室手册 ( 第 2 版 )， 冷泉港实验室， 纽约 (1998， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(2nd ed.)， Cold Spring Harbor Laboratory Press， New York) 所记载的条件等。更具体地， 比如可 以列举出 ： “在含有 50％甲酰胺、 5×SSC(150mM NaCl， 15mM 柠檬酸钠 )、 50mM 磷酸钠、 pH7.6， 5× 登哈特 (Denhardt’ s) 溶液、 10％硫酸葡聚糖以及 20μg/ml 核酸的溶液中， 杂交温度为 42℃” ， 但不限定于此。
TYR mRNA 的核苷酸序列是与序列号 1 所示序列相对应的序列。虽然 mRNA 中含有 的是尿嘧啶而不是胸腺嘧啶， 但在序列号 1 为方便起见， 将尿嘧啶表示为胸腺嘧啶 (t)。这 个序列在基因库 (GenBank) 数据库中的登录号为 ： NM_000372。
本发明一实施方式 ( 实施方式 1) 涉及的引物是用于从试样中检测酪氨酸酶 mRNA 的 TYR mRNA 检测用引物， 其特征在于 ：
它在 5’ 末端一侧包含第一序列， 在 3’ 末端一侧包含第二序列，
上述第一序列
(a1) 长度为 10-30 个核苷酸，
(b1) 是一种能与序列号 1 的部分区域——第一区域的互补链杂交的多聚核苷酸 序列，
上述第二序列
(c1) 长度为 10-30 个核苷酸，
(d1) 是一种可与序列号 1 中比第一区域靠近 3’ 末端一侧的第二区域杂交的多聚 核苷酸序列，
上述第二区域含有
(i) 序列号 1 的第 901 及 902 位核苷酸 ； 或
(ii) 序列号 1 的第 1118 及 1119 位核苷酸。本实施方式 1 的引物是一种特别适用于通过 RT-LAMP 法检测 TYR mRNA 的引物。 用 本实施方式 1 的引物， 由于其在 5’ 末端一侧包含上述第一序列， 在 3’ 末端一侧包含上述第 二序列， 因此， 可以高效地、 高再现性地检测出 TYR mRNA。
在上述 RT-LAMP 法中， 首先通过逆转录反应 (RT 反应 ) 从 TYR mRNA 合成 cDNA， 再 通过 LAMP 反应扩增合成的 cDNA。
使用 RT-LAMP 法检测 TYR mRNA 时， 比如如图 1 所示， 可以使用由下述多聚核苷酸构 成的引物作为本实施方式 1 的引物， 该多聚核苷酸在 5’ 末端侧有第一序列——即可与 TYR mRNA 的一部分区域 ( 图 1 中 “R1c” ) 的互补区域 ( 图 1 中 “R1” ) 杂交的多聚核苷酸序列， 在 3’ 末端侧有第二序列——即可与 TYRmRNA 中位于上述 R1c 区域下游 (3’ 末端 ) 的区域 (图1中 “R2c” ) 杂交的多聚核苷酸序列。
上述第一序列和第二序列， 从本实施方式 1 的引物和该引物杂交的区域之间的杂 交特异性的角度考虑， 其各自长度最好分别为 10 个核苷酸以上， 检测 TYR mRNA 时， 为保证 易于进行操作的杂交温度， 其最好长度是 30 个核苷酸以下。
在本实施方式 1 的引物中， 第一序列与第二序列既可直接连接， 也可通过间插 序列连接。间插序列最好是与 TYR mRNA 或 TYR cDNA 相关性低的序列。例如， 可举出 5’ -tttt-3’ 等。间插序列长度以 1-50 个核苷酸为宜， 1-40 个核苷酸更好。 本实施方式 1 的引物在上述 RT-LAMP 法所使用的引物当中， 可以作为反向内引物 ( 以下， 称为 “RIP” ) 发挥作用。
要用 RT-LAMP 法检测 TYR mRNA， 可以使用上述实施方式 1 的引物 (RIP)、 正向内引 物 ( 以下称 “FIP” ) 以及 F3 引物。本发明中也包括含有这些引物的 TYR mRNA 检测用引物 对。
本发明一实施方式涉及的 TYR mRNA 检测用引物对是一种用于检测试样中的酪氨 酸酶 mRNA 的 TYR mRNA 检测用引物对， 其特征在于 ：
该引物对包括第一引物、 第二引物及第三引物，
上述第一引物是上述实施方式 1 的引物，
上述第二引物在 5’ 末端一侧含有第三序列， 在 3’ 末端一侧含有第四序列，
上述第三序列
(a2) 长度为 10-30 个核苷酸
(b2) 是一种可与在序列号 1 中比第一区域靠近 5’ 末端一侧的第三区域杂交的多 聚核苷酸序列，
上述第四序列
(c2) 长度为 10-30 个核苷酸，
(d2) 是一种可与序列号 1 中比第三区域靠近 5’ 末端一侧的第四区域的互补链杂 交的多聚核苷酸序列，
上述第三引物由可与比上述序列号 1 中第四区域靠近 5’ 末端一侧的第五区域的 互补链杂交的多聚核苷酸序列组成。
使用本实施方式的引物对， 由于其包含上述第一引物、 第二引物及第三引物， 可以 高效、 快速、 高再现性地检测出 TYR mRNA。
本实施方式的引物对也可以包含第四引物， 该第四引物可以与比上述序列号 1 中
第二区域靠近 3’ 末端一侧的第六区域杂交。本实施方式的引物对还可以包含第五引物， 该 第五引物可以与位于上述序列号 1 中第三区域和第四区域之间的第七区域杂交。本实施方 式的引物对还可以包含第六引物， 该第六引物与位于上述序列号 1 中第一区域和第二区域 之间的第八区域的互补区域杂交。
下面根据图 1 进一步说明上述引物及引物对。
图 1 是引物和引物杂交区域的示意图。图 1 中， F1、 F2、 L、 F1、 R1c、 R2c 及 R3c 各 区域为 TYR mRNA 上的区域， F3c、 F2c、 F1c、 R1、 M、 R2 及 R3 各区域是 TYR mRNA 互补链 TYR cDNA 上的区域。F1 和 F1c、 F2 和 F2c、 F3 和 F3c、 R1 和 R1c、 R2 和 R2c 及 R3 和 R3c 分别互 补。这些区域在考虑 TYR mRNA 的检测效率和再现性等的基础上进行选择。
在图 1， RIP 对应上述第一引物， FIP 对应上述第二引物， F3 引物对应上述第三引 物， R3 引物对应上述第四引物， 环状引物 F 对应上述第五引物， 环状引物 R 对应上述第六引 物。
FIP( 第二引物 ) 为多聚核苷酸， 其在 5’ 末端一侧有可与 TYR mRNA 的互补链 TYR cDNA 的 F1 区域 (F1c 互补区域 ) 杂交的多聚核苷酸序列——第三序列， 在 3’ 末端一侧有可 与 TYR cDNA 的 F2c 区域杂交的多聚核苷酸序列——第四序列。第三序列和第四序列可以 直接连接， 也可以通过上述间插序列连接。在 FIP， 第三序列和第四序列的长度与上述第一 序列和第二序列的长度相同。 F3 引物 ( 第三引物 ) 由可以与比 TYR cDNA 的 F2c 更靠近下游 (3’ 末端一侧 ) 的 F3c 区域杂交的多聚核苷酸构成。
本发明的引物对除 FIP、 RIP 及 F3 引物外， 还也可以包含 R3 引物。此 R3 引物由可 与比 TYR mRNA 的 R2c 更靠近下游 (3’ 末端一侧 ) 的 R3c 区域杂交的多聚核苷酸构成。
本发明的引物对还可以含有环状引物。环状引物如有可与 TYR mRNA 上位于 F2 与 F1 之间的 L 区域杂交的多聚核苷酸——环状引物 F、 及可与在 TYR cDNA 上位于 R1 和 R2 之 间的 M 区域杂交的多聚核苷酸——环状引物 R 等。本发明的引物对也可以包含环状引物 F 及 R 其中之一或二者均包括。
当本发明的引物对包含环状引物 F 及 R 其中之一或全部时， 利用该引物对可以更 快速地通过 LAMP 反应进行 cDNA 扩增。
F3 引物、 R3 引物、 环状引物 F 及 R 的链长只要足够表达引物功能即可， 无特别限 定。众所周知的催化核酸合成反应的聚合酶所识别的引物链长为 5 个核苷酸以上， 因此， 上 述各引物的链长最好分别是 5-100 个核苷酸。从引物的核苷酸序列与引物杂交的区域之间 的特异性来考虑， 所述各引物的链长最好为 10 个核苷酸以上， 从引物的杂交温度来考虑， 引物链长最好在 30 个核苷酸以下。FIP 以及 RIP 的链长以 20-200 个核苷酸为宜， 20-60 个 核苷酸更好。
在本发明的引物对中， 最好上述引物中至少有一个与 TYR mRNA 含有外显子连接点 的区域杂交。TYR 基因由 9 个外显子组成， 外显子与外显子之间由内含子连接。当在细胞中 由 TYR 基因合成 mRNA 时， 剪接作用切掉了内含子， 外显子与外显子直接连接起来。外显子 与外显子之间连接处的部分称为外显子连接点。例如， 在基因组中外显子 1 与外显子 2 被 内含子隔离， 但是在 mRNA 合成过程中上述内含子被剪切， 所以 mRNA 中， 外显子 1 的 3’ 末端 与外显子 2 的 5’ 末端挨着。因为序列号 1 由 5 个外显子组成， 所以序列号 1 有以下 4 个外
显子连接点 ( 外显子连接点 1-4)。
外显子 1 与 2 之间的外显子连接点 1 ： 序列号 1 的第 901 位与 902 位的结合部分
外显子 2 与 3 之间的外显子连接点 2 ： 序列号 1 的第 1118 位与 1119 位的结合部 分
外显子 3 与 4 之间的外显子连接点 3 ： 序列号 1 的第 1266 位与 1267 位的结合部 分
外显子 4 与 5 之间的外显子连接点 4 ： 序列号 1 的第 1448 位与 1449 位的结合部 分
可与包含外显子连接点的区域杂交的引物虽然能与 TYR 基因的 mRNA 杂交， 但是与 TYR 基因的基因组 DNA 杂交的可能性极低。通过使用这样的引物， 可以防止以上述 RT-LAMP 反应检测 mRNA 时非特异性地扩增核酸。
根据 RT-LAMP 反应的反应机理 ( 参照美国专利第 6410278 号公报以及美国专利第 6974670 号公报 )， 最先与试样中的 TYR mRNA 杂交的是 RIP 的由第二序列构成的多聚核苷 酸部分。因此， 本发明的引物对更为理想的是， 上述引物中， RIP 的第二序列构成的多聚核 苷酸部分与含有外显子连接点的区域杂交。即， 较为理想的是上述 R2c 区域中含有外显子 连接点。这样， 能够防止在反应初期阶段非特异性地扩增核酸。 从 TYR mRNA 与来源于试样中其它基因的 mRNA 的相同性及检测速度、 检测再现性 等观点出发， 本发明的引物对最好包括与含有上述外显子连接点中外显子连接点 1 或 2 的 区域杂交的引物， 包括与含有外显子连接点 2 的区域杂交的引物更好。
本实施方式的引物与该引物杂交的 TYR mRNA 的特定区域， 不要求完全互补， 二者 只要具有可杂交的互补性即可 ( 这一点美国专利第 4800159 号公报上也有记述 )。即只 要是有引物功能的多聚核苷酸， 此引物也可以是在与上述特定区域完全互补的序列中导入 了一个或复数个即多个置换、 缺失、 插入、 附加等变异的多聚核苷酸。这种变异的多聚核苷 酸与未变异的多聚核苷酸相比， 以具有 80％以上的相同性为宜， 具有 90％以上的相同性更 好， 最好是具有 95％以上的相同性。
在 RT-LAMP 反应中， 引物与靶核酸 TYR mRNA 杂交后， 通过聚合酶的作用， 以引物 3’ 末端为起点进行核酸合成反应。为此， 引物的 3’ 末端部分与 TYRmRNA 的互补性越高， 核酸 合成反应越容易进行。所以， 本发明的引物最好 3’ 末端的 3 个核苷酸是与该引物杂交的区 域完全互补的多聚核苷酸， 如果 3’ 末端的 5 个核苷酸是完全互补的多聚核苷酸就更好了。
尤其当检测 TYR mRNA 时， 从提高特异性的角度看， 上述第二序列最好在 3 末’ 端含 有与上述第二区域的序列完全互补的连续 3 个核苷酸构成的序列， 含有与上述第二区域的 序列完全互补的连续 5 个核苷酸构成的序列更好。
各区域 F3、 F2、 F1、 R1c、 R2c、 R3c、 L 以及 M 设定在序列号 1 所示的 TYR mRNA 序列 中。以下列举这些区域的具体例子。
(F1)
第 795-817 位区域
第 1005-1024 位区域
第 1015-1036 位区域
第 1016-1040 位区域
第 1031-1054 位区域 (F2) 第 731-751 位区域 第 963-977 位区域 第 964-986 位区域 第 971-992 位区域 第 972-992 位区域 第 986-1008 位区域 (F3) 第 703-722 位区域 第 931-953 位区域 第 945-962 位区域 第 950-962 位区域 第 966-985 位区域 (R1c) 第 825-848 位区域 第 1026-1049 位区域 第 1041-1062 位区域 第 1044-1064 位区域 第 1044-1068 位区域 第 1057-1080 位区域 (R2c) 第 886-908 位区域 第 1110-1133 位区域 第 1114-1131 位区域 第 1114-1133 位区域 (R3c) 第 917-936 位区域 第 1135-1153 位区域 第 1138-1155 位区域 第 1138-1156 位区域 第 1141-1160 位区域 第 1142-1161 位区域 (L) 第 752-776 位区域 第 981-1004 位区域 第 982-1004 位区域 第 982-1006 位区域 第 986-1010 位区域第 987-1011 位区域 第 988-1011 位区域 第 988-1012 位区域 第 989-1011 位区域 第 989-1012 位区域 第 989-1013 位区域 第 990-1012 位区域 第 990-1013 位区域 第 990-1014 位区域 第 992-1015 位区域 第 993-1016 位区域 第 994-1016 位区域 第 995-1016 位区域 第 995-1018 位区域 第 996-1018 位区域 第 1000-1019 位区域 第 1001-1020 位区域 第 1003-1022 位区域 第 1004-1022 位区域 第 1005-1024 位区域 第 1006-1024 位区域 第 1008-1027 位区域 第 1009-1027 位区域 第 1009-1028 位区域 第 1010-1029 位区域 (M) 第 860-884 位区域 第 1063-1087 位区域 第 1065-1089 位区域 第 1066-1090 位区域 第 1067-1089 位区域 第 1067-1090 位区域 第 1068-1091 位区域 第 1068-1092 位区域 第 1069-1091 位区域 第 1069-1092 位区域 第 1069-1093 位区域 第 1070-1093 位区域 第 1070-1094 位区域第 1073-1097 位区域
第 1074-1098 位区域
第 1075-1099 位区域
第 1082-1104 位区域
第 1083-1105 位区域
第 1084-1105 位区域
第 1085-1107 位区域
(F3 引物 )
序列号 2 ： 5’ -AATGGAACGCCCGAGGGA-3’ ( 与第 950-967 位区域是相同的序列 )
序列号 3 ： 5’ -GACCTTTACGGCGTAATCCT-3’ ( 与第 966-985 位区域是相同的序列 )
序列号 4 ： 5’ -TATGCAATGGAACGCCCG-3’ ( 与第 945-962 位区域是相同的序列 )
序列号 5 ： 5’ -CAGCCATCAGTCTTTATGCAATG-3’ ( 与第 931-953 位区域是相同序列 )
序列号 6 ： 5’ -TCTGCCTTGGCATAGACTCT-3’ ( 与第 703-722 位区域是相同序列 )
(FIP)
序列号 7 ： 5’ -CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCTTACGGCGTAATCCTGGAAACC-3’ ( 连接第 1031-1054 位区域的互补序列和与第 971-992 位区域相同的序列的序列 )
序列号 8 ： 5’ -CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCGGAAACCATGACAAATCCAGAAC-3’ ( 连接第 1031-1054 位区域的互补序列和与第 986-1008 位区域相同的序列的序列 )
序列号 9 ： 5’ -TACATCAGCTGAAGAGGGGAGCAGGGACCTTTACGGC-3’ ( 连接第 1015-1036 位区域的互补序列和与第 963-977 位区域相同的序列的序列 )
序列号 10 ： 5’ -CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCTACGGCGTAATCCTGGAAACC-3’ ( 连接第 1031-1054 位区域的互补序列和与第 972-992 位区域相同的序列的序列 )
序列号 11 ： 5’ -AGAGGGGAGCCTTGGGGTTCAGGGACCTTTACGGC-3’ ( 连接第 1005-1024 位区域的互补序列和与第 963-977 位区域相同的序列的序列 )
序列号 12 ： 5’ -ATTCTACATCAGCTGAAGAGGGGAGGGGACCTTTACGGCGTAATCCTG-3’ ( 连接 第 1016-1040 位区域的互补序列和与第 964-986 位区域相同的序列的序列 )
序 列 号 13 ： 5’ -GTCACACTTTTCTGCATCCCGCCCGGTGGGAACAAGAAATCCAG-3’ ( 连接第 795-817 位区域的互补序列和与第 731-751 位区域相同的序列的序列 )
(RIP)
序列号 14 ： 5’ -CCAATATGAATCTGGTTCCATGGAGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3’ ( 连接与第 1057-1080 位区域相同的序列和第 1114-1133 位区域的互补序列的序列 )
序 列 号 15 ： 5’ -TTTGCCTGAGTTTGACCCAATAGGACTAGCAAATCCTTCC-3’ (连接与第 1041-1062 位区域相同的序列和第 1114-1131 位区域的互补序列的序列 )
序 列 号 16 ： 5’ -GCCTGAGTTTGACCCAATATGGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3’ ( 连接与第 1044-1064 位区域相同的序列和第 1114-1133 位区域的互补序列的序列 )
序列号 17 ： 5’ -CAGCTGATGTAGAATTTTGCCTGAGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3’ ( 连接与第 1026-1049 位区域相同的序列和第 1114-1133 位区域的互补序列的序列 )
序列号 18 ： 5’ -GCCTGAGTTTGACCCAATATGAATCGTGGACTAGCAAATCCTTCCAGTG-3’ (连 接与第 1044-1068 位区域相同的序列和 1110-1133 位区域的互补序列的序列 )序列号 19 ： 5’ -CAGATGAGTACATGGGAGGTCAGCAGACAATCTGCCAAGAGGAGAAG-3’ ( 连接 与第 825-848 位区域相同的序列和第 886-908 位区域的互补序列的序列 )
(R3 引物 )
序列号 20 ： 5’ -GAGGCATCCGCTATCCCA-3’ ( 第 1138-1155 位区域的互补序列 )
序列号 21 ： 5’ -TTTGAGAGGCATCCGCTATC-3’ ( 第 1141-1160 位区域的互补序列 )
序列号 22 ： 5’ -GGCATCCGCTATCCCAGTA-3’ ( 第 1135-1153 位区域的互补序列 )
序列号 23 ： 5’ -AGAGGCATCCGCTATCCCA-3’ ( 第 1138-1156 位区域的互补序列 )
序列号 24 ： 5’ -CTTTGAGAGGCATCCGCTAT-3’ ( 第 1142-1161 位区域的互补序列 )
序列号 25 ： 5’ -TGGCTGTTGTACTCCTCCAA-3’ ( 第 917-936 位区域的互补序列 )
( 环状引物 F)
序列号 26 ： 5’ -GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTCA-3’ ( 第 994-1016 位区域的互补序列 )
序列号 27 ： 5’ -CTGAAGAGGGGAGCCTTGGG-3’ ( 第 1009-1028 位区域的互补序列 )
序列号 28 ： 5’ -GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTCAT-3’ ( 第 993-1016 位区域的互补序列 )
序列号 29 ： 5’ -TGAAGAGGGGAGCCTTGGG-3’ ( 第 1009-1027 位区域的互补序列 )
序列号 30 ： 5’ -GGAGCCTTGGGGTTCTGGAT-3’ ( 第 1000-1019 位区域的互补序列 )
序列号 31 ： 5’ -GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTC-3’ ( 第 995-1016 位区域的互补序列 ) 序列号 32 ： 5’ -GGGTTCTGGATTTGTCATGGTTTCC-3’ ( 第 986-1010 位区域的互补序列 ) 序列号 33 ： 5’ -GGGAGCCTTGGGGTTCTGGA-3’ ( 第 1001-1020 位区域的互补序列 ) 序列号 34 ： 5’ -GAGCCTTGGGGTTCTGGATTTGT-3’ ( 第 996-1018 位区域的互补序列 ) 序列号 35 ： 5’ -GCTGAAGAGGGGAGCCTTGG-3’ ( 第 1010-1029 位区域的互补序列 ) 序列号 36 ： 5’ -TCTGGATTTGTCATGGTTTCCAGGA-3’ ( 第 982-1006 位区域的互补序列 ) 序列号 37 ： 5’ -GAGCCTTGGGGTTCTGGATTTGTC-3’ ( 第 995-1018 位区域的互补序列 ) 序列号 38 ： 5’ -TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3’ ( 第 989-1012 位区域的互补序列 ) 序列号 39 ： 5’ -GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTTC-3’ ( 第 987-1011 位区域的互补序列 ) 序列号 40 ： 5’ -TGAAGAGGGGAGCCTTGGGG-3’ ( 第 1008-1027 位区域的互补序列 ) 序列号 41 ： 5’ -CTTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3’ ( 第 990-1014 位区域的互补序列 ) 序列号 42 ： 5’ -TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3’ ( 第 990-1012 位区域的互补序列 ) 序列号 43 ： 5’ -AGGGGAGCCTTGGGGTTCT-3’ ( 第 1004-1022 位区域的互补序列 ) 序列号 44 ： 5’ -AGAGGGGAGCCTTGGGGTTC-3’ ( 第 1005-1024 位区域的互补序列 ) 序列号 45 ： 5’ -TTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3’ ( 第 990-1013 位区域的互补序列 ) 序列号 46 ： 5’ -AGAGGGGAGCCTTGGGGTT-3’ ( 第 1006-1024 位区域的互补序列 ) 序列号 47 ： 5’ -TGGATTTGTCATGGTTTCCAGGAT-3’ ( 第 981-1004 位区域的互补序列 ) 序列号 48 ： 5’ -TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTT-3’ ( 第 988-1012 位区域的互补序列 ) 序列号 49 ： 5’ -GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3’ ( 第 989-1011 位区域的互补序列 ) 序列号 50 ： 5’ -CCTTGGGGTTCTGGATTTGTCATG-3’ ( 第 992-1015 位区域的互补序列 ) 序列号 51 ： 5’ -TGGATTTGTCATGGTTTCCAGGA-3’ ( 第 982-1004 位区域的互补序列 ) 序列号 52 ： 5’ -GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTT-3’ ( 第 988-1011 位区域的互补序列 ) 序列号 53 ： 5’ -TTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3’ ( 第 989-1013 位区域的互补序列 ) 序列号 54 ： 5’ -AGGGGAGCCTTGGGGTTCTG-3’ ( 第 1003-1022 位区域的互补序列 )序列号 55 ： 5’ -TGAAGTTTTCATCTCCTGTCAGCTT-3’ ( 第 752-776 位区域的互补序列 )
( 环状引物 R)
序列号 56 ： 5’ -AAAGCTGCCAATTTCAGCTTTAG-3’ ( 与第 1082-1104 位区域相同的序列 )
序列号 57 ： 5’ -AGCTGCCAATTTCAGCTTTAGA-3’ ( 与第 1084-1105 位区域相同的序列 )
序列号 58 ： 5’ -GCTGCCAATTTCAGCTTTAGAAA-3’ ( 与第 1085-1107 位区域相同的序列 )
序列号 59 ： 5’ -AAGCTGCCAATTTCAGCTTTAGA-3’ ( 与第 1083-1105 位区域相同的序列 )
序列号 60 ： 5’ -ATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCC-3’ ( 与第 1066-1090 位区域相同的序列 )
序列号 61 ： 5’ -AATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGC-3’ ( 与第 1065-1089 位区域相同的序列 )
序列号 62 ： 5’ -CTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAA-3’ ( 与第 1068-1092 位区域相同的序列 )
序列号 63 ： 5’ -TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAA-3’ ( 与第 1069-1092 位区域相同的序列 )
序列号 64 ： 5’ -GGTTCCATGGATAAAGCTGCCAAT-3’ ( 与第 1070-1093 位区域相同的序列 )
序列号 65 ： 5’ -TCCATGGATAAAGCTGCCAATTTCA-3’ ( 与第 1073-1097 位区域相同的序列 )
序列号 66 ： 5’ -CTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCA-3’ ( 与第 1068-1091 位区域相同的序列 )
序列号 67 ： 5’ -TCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCC-3’ ( 与第 1067-1090 位区域相同的序列 )
序列号 68 ： 5’ -TGAATCTGGTTCCATGGATAAAGCT-3’ ( 与第 1063-1087 位区域相同的序列 )
序列号 69 ： 5’ -TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCA-3’ ( 与第 1069-1091 位区域相同的序列 )
序列号 70 ： 5’ -CATGGATAAAGCTGCCAATTTCAGC-3’ ( 与第 1075-1099 位区域相同的序列 )
序列号 71 ： 5’ -GGTTCCATGGATAAAGCTGCCAATT-3’ ( 与第 1070-1094 位区域相同的序列 )
序列号 72 ： 5’ -CCATGGATAAAGCTGCCAATTTCAG-3’ ( 与第 1074-1098 位区域相同的序列 )
序列号 73 ： 5’ -TCTGGTTCCATGGATAAAGCTGC-3’ ( 与第 1067-1089 位区域相同的序列 )
序列号 74 ： 5’ -TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAAT-3’ ( 与第 1069-1093 位区域相同的序列 )
序列号 75 ： 5’ -CCTAACTTACTCAGCCCAGCATCAT-3’ ( 与第 860-884 位区域相同的序列 )
上述引物中， 序列号 19 所示核苷酸序列构成的引物， 可与含有外显子连接点 1 的 区域杂交。
序列号 14-18 的引物， 可与含有外显子连接点 2 的区域杂交。
上述引物中， 可根据扩增区域适当组合 F3 引物、 FIP、 RIP 以及 R3 引物， 并将其作 为含有四种引物的引物对使用。也可以再加上环状引物 F 和 R 可以组成含有六种引物的引 物对使用。这种引物对的具体例示见以下表 1。
[ 表 1]
逆转录酶和链置换型 DNA 聚合酶可以使用众所周知的酶。也可以使用具有以 RNA 为模板合成 DNA 的作用和在进行链置换的同时以 DNA 为模板合成 DNA 的作用的一种酶取代 这二种酶 ( 逆转录酶和链置换型 DNA 聚合酶 )。
最好还使用为酶反应创造适宜条件的缓冲剂。
上述物质可以分别装在不同的容器中， 也可以将逆转录酶和链置换型 DNA 聚合酶 装在同一容器中。 dNTPs、 缓冲剂以及各种引物中， 可以将至少两种物质放在同一个容器中。 向用户提供这些试剂时， 也可以提供含有上述部分或全部试剂的试剂盒。
[TYR mRNA 的检测方法及 TYR mRNA 检测用试剂盒 ]
下面说明 TYR mRNA 的检测方法。本发明的 TYR mRNA 的检测方法可以通过以下二 种途径实现 ：
使用上述引物对、 RNA 依赖性 DNA 聚合酶及 DNA 依赖性 DNA 聚合酶 ( 以下称 “实施 方式 1 的检测方法” )； 或者
使用上述引物对、 以及具有以 RNA 为模板合成 DNA 作用和边进行链置换边以 DNA 为模板合成 DNA 作用的酶 ( 以下称 “实施方式 2 的检测方法” )。
上述实施方式 1 的检测方法包括以下步骤 ：
(I-1) 使试样、 上述引物对及 RNA 依赖性 DNA 聚合酶发生反应， 由上述试样中的酪 氨酸酶 mRNA 合成 cDNA ；
(II-1) 使上述引物对、 DNA 依赖性 DNA 聚合酶和在上述步骤 (I-1) 合成的 cDNA 发 生反应， 扩增 cDNA ；
(III-1) 通过检测在上述步骤 (II-1) 扩增的 cDNA， 检测上述试样中的酪氨酸酶 mRNA。
上述实施方式 2 的检测方法包括以下步骤 ：
(I-2) 使试样和上述引物对与具有以 RNA 为模板合成 DNA 作用和边进行链置换 边以 DNA 为模板合成 DNA 作用的酶发生反应， 以上述试样中的酪氨酸酶 mRNA 为模板合成 cDNA， 并以此 cDNA 为模板再合成该 cDNA， 进行扩增 ； 及
(II-2) 通过检测在上述步骤扩增的 cDNA， 检测上述试样中的酪氨酸酶 mRNA。
实施方式 1 和 2 的检测方法从高效、 准确、 快速地检测 TYR mRNA 的角度看， 最好使 用 RT-LAMP 法进行。
在上述实施方式 1 的检测方法中， 当使用 RT-LAMP 法时， 通过混合上述引物对、 RNA 依赖性 DNA 聚合酶 ( 以下称 “逆转录酶” )、 有链置换活性的 DNA 依赖性 DNA 聚合酶 ( 以下称 “链置换型 DNA 聚合酶” )、 dNTPs( 包括 dATP、 dGTP、 dTTP 及 dCTP) 及试样， 使其进行反应， 就 可检测出试样中的 TYR mRNA。因此， 此时上述步骤 (I-1) 及 (II-1) 可以一步进行。
另一方面， 在上述实施方式 2 的检测方法中， 如果使用 RT-LAMP 法， 则混合上述引 物对、 具有以 RNA 为模板合成 DNA 作用和边进行链置换边以 DNA 为模板合成 DNA 作用的酶、 dNTPs 及试样， 使其产生反应， 就可检测出试样中的 TYRmRNA。
逆转录酶和链置换型 DNA 聚合酶可以使用众所周知的酶。
另外， 实施方式 1 的检测方法的步骤 (I-1) 及 (II-1) 以及实施方式 2 的检测方法 的步骤 (I-2) 最好还使用为各步骤的酶反应创造适宜条件的缓冲剂。
用于 TYR mRNA 检测的试样如采自生物体的组织 ( 淋巴结、 淋巴液、 血液等 ) 和粪 便等。
在实施方式 1 的检测方法中， 在使用 RT-LAMP 法的情况下， 检测 TYR mRNA 要经过 扩增步骤 [ 上述步骤 (I-1) 及 (II-1)] 和检测步骤 [ 上述步骤 (III-1)]。
首先， 将含有从生物体采集的 TYR mRNA 的试样与上述引物对、 逆转录酶、 dNTPs 以 及链置换型 DNA 聚合酶混合在一起。再将所得混合物加热到一定温度 ( 例如 65℃ )， 进行 RT 反应和 LAMP 反应， 以 TYR mRNA 为模板合成 TYR cDNA， 同时以此 TYR cDNA 为模板再合成 该 TYR cDNA， 进行扩增 [ 上述步骤 (I-1) 及 (II-1)]。
RT 反应和 LAMP 反应的反应机理如下 ：
首先， RIP 的第二序列与反应液中 TYR mRNA 的 R2c 区域杂交。然后， 通过逆转录 酶， 从该 RIP 的 3’ 末端开始， 以 TYR mRNA 为模板合成 TYR cDNA 。通过这一反应， 合成由 TYR mRNA 与从该 RIP 延长出的 TYR cDNA(RIP 延长链 ) 组成的双链核酸。
接着， R3 引物与 TYR mRNA 的 R3c 区域杂交。由于链置换型 DNA 聚合酶的作用， 从 该 R3 引物的 3’ 末端开始， 以 TYR mRNA 为模板， 剥离 ( 置换 ) 已与 TYRmRNA 结合的上述 RIP 延长链， 同时合成 TYR cDNA。
上述 RIP 延长链为单链状态， 具有与 TYR mRNA 互补的序列， 因此， 该 RIP 延长链中包含与 TYR mRNA 的 F2 区域互补的 F2c 区域。FIP 的第四序列与此 RIP 延长链的 F2c 区域 杂交。
然后， 由于链置换型 DNA 聚合酶的作用， 以上述 RIP 延长链为模板从 FIP 的 3’ 末 端开始合成 DNA。在此合成的 DNA 因为在其 5’ 末端有第三序列 ( 与 F1 区域杂交的多聚核 苷酸序列 )， 该第三序列构成的多聚核苷酸与此 DNA 上的 F1 区域杂交， 形成茎环结构。此 DNA 在 3’ 末端有第一序列的互补序列 ( 与 R1c 区域杂交的序列 )， 该第一序列的互补序列 与此 DNA 上的 R1c 区域杂交， 形成茎环结构。因此， 此 DNA 形成在 5’ 末端以及 3’ 末端两端 有茎环结构的哑铃结构。
上述哑铃结构的 DNA( 哑铃 DNA) 以该哑铃 DNA 中的其他部分为模板， 从其 3’ 末端 开始， 在解开 5’ 末端茎环结构的同时， 通过链置换型 DNA 聚合酶进行延长， 获得延长链。这 个延伸链在其 5’ 末端、 3’ 末端以及它们的中间部分分别具有相互互补的序列， 因此， 在该延 长链中形成了三个茎环结构。而且， 该延长链从其 3’ 末端开始， 以该延长链的其他部分为 模板， 一边解开上述茎环结构， 一边通过链置换型 DNA 聚合酶的作用进行延长。通过这个反 应实际上在恒温下反复进行， 合成分子中含有多个特定序列的核酸 ( 该反应的具体内容参 阅美国专利第 6410278 号公报以及美国专利第 6974670 号公报 )。
如此获得的扩增产物中的核酸大部分为 dsDNA( 双链 DNA)， 因此在检测步骤 [ 上 述步骤 (III-1)] 中， 可将这些扩增产物用像溴化乙锭、 SYBR( 注册商标 )GREEN 1、 Pico Green( 注册商标 ) 等荧光嵌入剂进行荧光染色后， 照射紫外线使其产生荧光， 来检测该扩 增产物。
荧光染色也可通过在扩增反应后 [ 上述步骤 (II-1) 后 ] 的反应液中添加荧光色 素来实施， 也可以预先在上述反应液中添加荧光色素， 在有荧光色素存在的情况下进行核 酸扩增。 在检测步骤 [ 上述步骤 (III-1)]， 可通过是否检测出荧光来判断试样中是否有 TYR mRNA。另外， 还可以通过测定扩增反应后 [ 上述步骤 (II-1) 后 ] 的反应液的荧光强度来对 扩增产物进行定量， 也可以此定量结果为基础， 对试样中含有的 TYR mRNA 进行定量。特别 是在荧光色素存在的情况下进行核酸扩增时， 通过实时测定反应液中荧光强度的增大， 以 及测定达到一定荧光强度所需的时间， 可以换算出试样中的 TYR mRNA 含量 ( 实时 RT-PCR 法、 实时 RT-LAMP 法等 )。
此外， 在上述步骤 (II-1) 中的 LAMP 反应中， 会生成不溶于水的副产物焦磷酸镁。 该焦磷酸镁随着核酸扩增的进行而增多， 反应液随着焦磷酸镁的增多而变得白浊。 为此， 可 以通过 i) 目视判断反应液的浊度 ； ii) 测定反应液的吸光度及散射光强度来测定其浊度 ； 或 iii) 使用有色过滤器过滤反应液， 确认过滤器上的残渣， 检测出靶核酸 ( 参照国际公开 第 01/83817 号 )。当通过测定反应液的吸光度或散射光强度来测定浊度时， 和上述使用荧 光色素时一样， 可通过实时监测浊度的变化， 在封闭系统中追踪 DNA 扩增以及浊度的增加 情况。因此， 在检测步骤 [ 上述步骤 (III-1)] 中， 可根据反应液是否白浊化， 判断试样中是 否存在 TYR mRNA。 此外， 通过测定扩增产物的浊度， 可以对该扩增产物定量， 根据定量结果， 还可以对试样中含有的 TYR mRNA 进行定量。在实时测定浊度增加的时候， 也可以测定到 达一定浊度所需要的时间 ( 以下， 称为 “扩增上升时间” )， 再将该时间换算成试样中的 TYR mRNA 含量。
另一方面， 在实施方式 2 的检测方法中， 步骤 (I-2) 是对应于上述实施方式 1 的检测方法中的扩增步骤 [ 上述步骤 (I-1) 和 (II-1)] 的扩增步骤。此步骤 (I-2) 除用一种既 能以 RNA 为模板合成 DNA 又可在进行链置换的同时以 DNA 为模板合成 DNA 的酶取代上述步 骤 (I-1) 和 (II-1) 中的两种酶 ( 逆转录酶和链置换 DNA 聚合酶 ) 外， 其他均可与上述步骤 (I-1) 和 (II-1) 相同。
在实施方式 2 的检测方法中， 步骤 (II-2) 可与上述实施方式 1 的检测方法中的检 测步骤 [ 上述步骤 (III-1)] 相同。
本发明可提供 mRNA 检测用试剂盒作为上述步骤 (I-1)、 步骤 (II-1) 和步骤 (I-2) 使用的试剂。该 mRNA 检测用试剂盒包括上述引物对、 dNTPs 及兼具以 RNA 为模板合成 DNA 功能和在进行链置换同时以 DNA 为模板合成 DNA 功能的酶或 RNA 依赖性 DNA 聚合酶和 DNA 依赖性 DNA 聚合酶。
上述各试剂可以分别装于不同的容器中。逆转录酶和链置换型 DNA 聚合酶也可以 装于同一容器中。也可以将 dNTPs、 缓冲剂和各种引物中的至少二种试剂装于同一容器中。
下面举实施例详细说明本发明。不过， 本发明不限于这些实施例。
( 实施例 1)
如下验证使用表 1 中列出的引物对 1-45 能否检测出 TYR mRNA。
(1) 制备试样
用无核糖核酸酶 (RNase-free) 的超纯水对 5×1010 拷贝 /μL 的 TYR mRNA 进行阶 段性稀释， 制备出 2.5×103 拷贝 /μL 的 TYR mRNA。
(2) 制备反应液
将表 1 所示 F3 引物、 FIP、 RIP 以及 R3 引物按如下配比加入缓冲液 [10mM 三羟甲 基氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCI)(pH8.0)]， 制备混合引物 ( 引物 MIX)。
16μM FIP
16μM RIP
1μM F3 引物
1μM R3 引物
12μM 环状引物 F
12μM 环状引物 R
10mM Tris-HCI(pH8.0)
混合各种试剂， 制备出如下配比的 RT-LAMP 反应用缓冲液。
53m MTris-HCI(pH8.8)
1.8×Thermopol 缓冲液 (New England Biolabs 制 )
1.43mM dNTPs(Invitrogen 公司制 )
5.36mM MgSO4(NACALAI TESQUE( 株 ) 制 )
8.93mM DTT( 和光纯药 ( 株 ) 制 )
2 体积％ Tergitol(Sigma 制 )
混合各种试剂， 制备出配比如下的酶溶液 (3.04μL)。
10U/μL AMV 逆转录酶 (Promega 制 ) 0.14μL
8U/μL Bst DNA 聚合酶 (New England Biolabs 制 ) 2.27μL
40U/μL Rnase 抑制剂 (Promega 制 ) 0.63μL混合各试剂， 制备 25μL 如下配比的反应液。反应液分别针对 45 种引物对制备。
RT-LAMP 反应用缓冲液 14.0μL
酶溶液 3.0μL
混合引物 5.0μL
10mM Tris-HCI(pH8.0) 1.0μL
RNA 试样 2.0μL
此外， 作为与 45 种反应液分别对应的阴性对照 (NC)， 还添加 2.0μL 超纯水取代 2.0μL RNA 试样， 制备了 NC 用反应液 (45 种 )。
(3) 检测及检测结果
将装有含 45 种引物对中某一种的反应液的试管放置到预先加温至 65℃的浊度实 时测定装置 (TERAMECS 公司制， 商品名 ： LA-200) 中。然后， 在 65℃温度下， 培养上述试管 中的反应液， 进行 LAMP 反应。测定从反应开始到反应液浊度达到 0.1 时所需的时间。阴性 对照测定进行一次， 含 RNA 试样的反应液测定进行 3 次 (n ＝ 3)。阴性对照测定结果和含 RNA 试样反应液测定结果的平均值见表 2。表中， “NC” 表示阴性对照时的测定结果。表中 的 “-( 连字符 )” 表示在 60 分钟以内浊度未达到 0.1。
[ 表 2]
本发明涉及一种用于检测酪氨酸酶 ( 以下称 “TYR” )mRNA( 信使核糖核酸 ) 的引 物。 更具体地， 涉及一种适宜检测试样中 TYR mRNA 的引物、 引物对及 TYR mRNA 的检测方法。 背景技术 ：
TYR 是动物和植物细胞中酪氨酸氧化合成黑色素这一反应的催化酶之一。近年来 的研究表明， TYR 作为检测黑色素瘤的淋巴结转移的分子标记十分有用。例如， 非专利文献 1 中公开了一种技术， 用从生物体采集的淋巴结制备测定试样， 通过 RT-PCR 法检测测定试 样中的 TYR mRNA， 以此可判断有无黑色素瘤的淋巴结转移。
在先技术文献
非专利文献
非专利文献 1 ： 亚伯拉罕森 (Abrahamsen) 等人， 《在前哨淋巴结中定量黑色素瘤 mRNA 标记 ： 临床前评价单步实时逆转录聚合酶链反应检测 (Quantification of Melanoma mRNA Markers in Sentinel Nodes ： Pre-Clinical Evaluation of a Single-Step Real-Time ReverseTranscriptase-Polymerase Chain Reaction Assay)》 ， 2004 年 8 月第 6 卷第 3 号 P.253-259 发明内容 ：
如上所述， TYR mRNA 作为检测黑色素瘤等癌症的分子标记十分有用。但是， 非专 利文献 1 中记述的技术在检测时应用的是可以灵敏地检测靶核酸的 RT-PCR 法， 因此， 虽然 也能检测出癌细胞向淋巴结的微小转移， 但检测非常费时间 (2-4 个小时 )。
本发明的目的之一是提供可以用比过去的技术更短的时间检测出 TYRmRNA 的 TYR mRNA 检测用引物、 TYR mRNA 检测用引物对、 TYR mRNA 检测用试剂盒以及 TYR mRNA 检测方 法。
即本发明涉及
[1] 一种酪氨酸酶 mRNA 检测用引物， 该酪氨酸酶 mRNA 检测用引物用于检测试样中 的酪氨酸酶的 mRNA，
它在 5’ 末端一侧包含第一序列， 在 3’ 末端一侧包含第二序列，
上述第一序列
(a1) 长度为 10-30 个核苷酸
(b1) 是一种能与序列号 1 的部分区域——第一区域的互补链杂交的多聚核苷酸 序列，
上述第二序列
(c1) 长度为 10-30 个核苷酸
(d1) 是一种可与序列号 1 中比第一区域靠近 3’ 末端一侧的第二区域杂交的多聚 核苷酸序列，上述第二区域含有
(i) 序列号 1 的第 901 及 902 位核苷酸、 或
(ii) 序列号 1 的第 1118 及 1119 位核苷酸 ；
[2] 一种酪氨酸酶 mRNA 检测用引物对， 该酪氨酸酶 mRNA 检测用引物对用于检测试 样中的酪氨酸酶的 mRNA，
其包括第一引物、 第二引物及第三引物，
上述第一引物是权利要求 1 所记述的引物，
上述第二引物在 5’ 末端一侧含有第三序列， 在 3’ 末端一侧含有第四序列，
上述第三序列
(a2) 长度为 10-30 个核苷酸
(b2) 是一种可与序列号 1 中比第一区域靠近 5’ 末端一侧的第三区域杂交的多聚 核苷酸序列，
上述第四序列
(c2) 长度为 10-30 个核苷酸
(d2) 是一种可与上述序列号 1 中比第三区域靠近 5’ 末端一侧的第四区域的互补 链杂交的多聚核苷酸序列， 上述第三引物由可与上述序列号 1 中比第四区域靠近 5’ 末端一侧的第五区域的 互补链杂交的多聚核苷酸序列组成 ；
[3] 一种酪氨酸酶 mRNA 检测用试剂盒， 包括
上述 [2] 所记述的引物对、
dNTPs、
具有以 RNA 为模板合成 DNA 的作用和边进行链置换边以 DNA 为模板合成 DNA 的作 用的酶、 或 RNA 依赖性 DNA 聚合酶及 DNA 依赖性 DNA 聚合酶 ；
[4] 一种酪氨酸酶 mRNA 检测方法， 包括以下步骤 ：
使试样、 上述 [2] 所述引物对及 RNA 依赖性 DNA 聚合酶发生反应， 由上述试样中的 酪氨酸酶 mRNA 合成 cDNA，
使上述引物对、 DNA 依赖性 DNA 聚合酶和在上述步骤合成的 cDNA 发生反应， 扩增 上述 cDNA， 以及
通过检测在上述步骤扩增的 cDNA， 检测上述试样中的酪氨酸酶 mRNA ；
[5] 一种酪氨酸酶 mRNA 检测方法， 包括以下步骤 ：
使试样和上述 [2] 所述引物对与具有以 RNA 为模板合成 DNA 的作用和边进行链置 换边以 DNA 为模板合成 DNA 的作用的酶发生反应， 以上述试样中的酪氨酸酶 mRNA 为模板合 成 cDNA， 并以此 cDNA 为模板再合成该 cDNA 进行扩增，
通过检测在上述步骤扩增的 cDNA， 检测上述试样中的酪氨酸酶 mRNA。
采用本发明的 TYR mRNA 检测用引物、 TYR mRNA 检测用引物对、 TYR mRNA 检测用试 剂盒以及 TYR mRNA 检测方法， 可以在短时间内检测出 TYR mRNA。
附图说明 ：
图 1 为引物及引物杂交的区域的示意图。具体实施方式 ：
( 引物及引物对 )
首先就检测 TYR mRNA 用的 TYR mRNA 检测用引物进行说明。
在本说明书中， 所谓 “检测” 不仅指判断试样中是否存在靶物质—— TYR mRNA， 还 包括定量试样中的 TYR mRNA。
在本说明书中， 所谓 “引物”指在 LAMP( 环介导等温扩增反应， Loop-mediated Isothermal Amplification) 法 ( 参照美国专利第 6410278 号公报以及美国专利第 6974670 号公报 ) 等核酸扩增技术中， 与扩增目标核酸的特定区域杂交的多聚核苷酸， 该多聚核苷 酸具有能作为聚合酶扩增反应起点的功能 ( 以下， 称为 “引物功能” )。待检测核酸是 mRNA， 故可以通过包括逆转录反应的核酸扩增反应 ( 例如 ： RT-LAMP 法等等 ) 加以检测。
所谓 “杂交” 是指在严格条件下， 基于多聚核苷酸碱基之间的互补性， 某多聚核苷 酸的一部分或全部序列通过氢键与其它多聚核苷酸的一部分或全部序列结合。
所谓 “严格条件” 指进行多聚核苷酸杂交时该行业专业人士普遍使用的条件， 只要 满足本实施方式的引物能与 TYR mRNA 或其 cDNA 杂交这一条件即可， 无特别限定。已知， 杂 交时的严格条件是指温度、 盐浓度、 引物链长、 引物中 GC 含量以及杂交缓冲液中的离液剂 浓度函数。例如作为严格条件， 可以使用 Sambrook， J. 等， 1998， 分子克隆 ： 实验室手册 ( 第 2 版 )， 冷泉港实验室， 纽约 (1998， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(2nd ed.)， Cold Spring Harbor Laboratory Press， New York) 所记载的条件等。更具体地， 比如可 以列举出 ： “在含有 50％甲酰胺、 5×SSC(150mM NaCl， 15mM 柠檬酸钠 )、 50mM 磷酸钠、 pH7.6， 5× 登哈特 (Denhardt’ s) 溶液、 10％硫酸葡聚糖以及 20μg/ml 核酸的溶液中， 杂交温度为 42℃” ， 但不限定于此。
TYR mRNA 的核苷酸序列是与序列号 1 所示序列相对应的序列。虽然 mRNA 中含有 的是尿嘧啶而不是胸腺嘧啶， 但在序列号 1 为方便起见， 将尿嘧啶表示为胸腺嘧啶 (t)。这 个序列在基因库 (GenBank) 数据库中的登录号为 ： NM_000372。
本发明一实施方式 ( 实施方式 1) 涉及的引物是用于从试样中检测酪氨酸酶 mRNA 的 TYR mRNA 检测用引物， 其特征在于 ：
它在 5’ 末端一侧包含第一序列， 在 3’ 末端一侧包含第二序列，
上述第一序列
(a1) 长度为 10-30 个核苷酸，
(b1) 是一种能与序列号 1 的部分区域——第一区域的互补链杂交的多聚核苷酸 序列，
上述第二序列
(c1) 长度为 10-30 个核苷酸，
(d1) 是一种可与序列号 1 中比第一区域靠近 3’ 末端一侧的第二区域杂交的多聚 核苷酸序列，
上述第二区域含有
(i) 序列号 1 的第 901 及 902 位核苷酸 ； 或
(ii) 序列号 1 的第 1118 及 1119 位核苷酸。本实施方式 1 的引物是一种特别适用于通过 RT-LAMP 法检测 TYR mRNA 的引物。 用 本实施方式 1 的引物， 由于其在 5’ 末端一侧包含上述第一序列， 在 3’ 末端一侧包含上述第 二序列， 因此， 可以高效地、 高再现性地检测出 TYR mRNA。
在上述 RT-LAMP 法中， 首先通过逆转录反应 (RT 反应 ) 从 TYR mRNA 合成 cDNA， 再 通过 LAMP 反应扩增合成的 cDNA。
使用 RT-LAMP 法检测 TYR mRNA 时， 比如如图 1 所示， 可以使用由下述多聚核苷酸构 成的引物作为本实施方式 1 的引物， 该多聚核苷酸在 5’ 末端侧有第一序列——即可与 TYR mRNA 的一部分区域 ( 图 1 中 “R1c” ) 的互补区域 ( 图 1 中 “R1” ) 杂交的多聚核苷酸序列， 在 3’ 末端侧有第二序列——即可与 TYRmRNA 中位于上述 R1c 区域下游 (3’ 末端 ) 的区域 (图1中 “R2c” ) 杂交的多聚核苷酸序列。
上述第一序列和第二序列， 从本实施方式 1 的引物和该引物杂交的区域之间的杂 交特异性的角度考虑， 其各自长度最好分别为 10 个核苷酸以上， 检测 TYR mRNA 时， 为保证 易于进行操作的杂交温度， 其最好长度是 30 个核苷酸以下。
在本实施方式 1 的引物中， 第一序列与第二序列既可直接连接， 也可通过间插 序列连接。间插序列最好是与 TYR mRNA 或 TYR cDNA 相关性低的序列。例如， 可举出 5’ -tttt-3’ 等。间插序列长度以 1-50 个核苷酸为宜， 1-40 个核苷酸更好。 本实施方式 1 的引物在上述 RT-LAMP 法所使用的引物当中， 可以作为反向内引物 ( 以下， 称为 “RIP” ) 发挥作用。
要用 RT-LAMP 法检测 TYR mRNA， 可以使用上述实施方式 1 的引物 (RIP)、 正向内引 物 ( 以下称 “FIP” ) 以及 F3 引物。本发明中也包括含有这些引物的 TYR mRNA 检测用引物 对。
本发明一实施方式涉及的 TYR mRNA 检测用引物对是一种用于检测试样中的酪氨 酸酶 mRNA 的 TYR mRNA 检测用引物对， 其特征在于 ：
该引物对包括第一引物、 第二引物及第三引物，
上述第一引物是上述实施方式 1 的引物，
上述第二引物在 5’ 末端一侧含有第三序列， 在 3’ 末端一侧含有第四序列，
上述第三序列
(a2) 长度为 10-30 个核苷酸
(b2) 是一种可与在序列号 1 中比第一区域靠近 5’ 末端一侧的第三区域杂交的多 聚核苷酸序列，
上述第四序列
(c2) 长度为 10-30 个核苷酸，
(d2) 是一种可与序列号 1 中比第三区域靠近 5’ 末端一侧的第四区域的互补链杂 交的多聚核苷酸序列，
上述第三引物由可与比上述序列号 1 中第四区域靠近 5’ 末端一侧的第五区域的 互补链杂交的多聚核苷酸序列组成。
使用本实施方式的引物对， 由于其包含上述第一引物、 第二引物及第三引物， 可以 高效、 快速、 高再现性地检测出 TYR mRNA。
本实施方式的引物对也可以包含第四引物， 该第四引物可以与比上述序列号 1 中
第二区域靠近 3’ 末端一侧的第六区域杂交。本实施方式的引物对还可以包含第五引物， 该 第五引物可以与位于上述序列号 1 中第三区域和第四区域之间的第七区域杂交。本实施方 式的引物对还可以包含第六引物， 该第六引物与位于上述序列号 1 中第一区域和第二区域 之间的第八区域的互补区域杂交。
下面根据图 1 进一步说明上述引物及引物对。
图 1 是引物和引物杂交区域的示意图。图 1 中， F1、 F2、 L、 F1、 R1c、 R2c 及 R3c 各 区域为 TYR mRNA 上的区域， F3c、 F2c、 F1c、 R1、 M、 R2 及 R3 各区域是 TYR mRNA 互补链 TYR cDNA 上的区域。F1 和 F1c、 F2 和 F2c、 F3 和 F3c、 R1 和 R1c、 R2 和 R2c 及 R3 和 R3c 分别互 补。这些区域在考虑 TYR mRNA 的检测效率和再现性等的基础上进行选择。
在图 1， RIP 对应上述第一引物， FIP 对应上述第二引物， F3 引物对应上述第三引 物， R3 引物对应上述第四引物， 环状引物 F 对应上述第五引物， 环状引物 R 对应上述第六引 物。
FIP( 第二引物 ) 为多聚核苷酸， 其在 5’ 末端一侧有可与 TYR mRNA 的互补链 TYR cDNA 的 F1 区域 (F1c 互补区域 ) 杂交的多聚核苷酸序列——第三序列， 在 3’ 末端一侧有可 与 TYR cDNA 的 F2c 区域杂交的多聚核苷酸序列——第四序列。第三序列和第四序列可以 直接连接， 也可以通过上述间插序列连接。在 FIP， 第三序列和第四序列的长度与上述第一 序列和第二序列的长度相同。 F3 引物 ( 第三引物 ) 由可以与比 TYR cDNA 的 F2c 更靠近下游 (3’ 末端一侧 ) 的 F3c 区域杂交的多聚核苷酸构成。
本发明的引物对除 FIP、 RIP 及 F3 引物外， 还也可以包含 R3 引物。此 R3 引物由可 与比 TYR mRNA 的 R2c 更靠近下游 (3’ 末端一侧 ) 的 R3c 区域杂交的多聚核苷酸构成。
本发明的引物对还可以含有环状引物。环状引物如有可与 TYR mRNA 上位于 F2 与 F1 之间的 L 区域杂交的多聚核苷酸——环状引物 F、 及可与在 TYR cDNA 上位于 R1 和 R2 之 间的 M 区域杂交的多聚核苷酸——环状引物 R 等。本发明的引物对也可以包含环状引物 F 及 R 其中之一或二者均包括。
当本发明的引物对包含环状引物 F 及 R 其中之一或全部时， 利用该引物对可以更 快速地通过 LAMP 反应进行 cDNA 扩增。
F3 引物、 R3 引物、 环状引物 F 及 R 的链长只要足够表达引物功能即可， 无特别限 定。众所周知的催化核酸合成反应的聚合酶所识别的引物链长为 5 个核苷酸以上， 因此， 上 述各引物的链长最好分别是 5-100 个核苷酸。从引物的核苷酸序列与引物杂交的区域之间 的特异性来考虑， 所述各引物的链长最好为 10 个核苷酸以上， 从引物的杂交温度来考虑， 引物链长最好在 30 个核苷酸以下。FIP 以及 RIP 的链长以 20-200 个核苷酸为宜， 20-60 个 核苷酸更好。
在本发明的引物对中， 最好上述引物中至少有一个与 TYR mRNA 含有外显子连接点 的区域杂交。TYR 基因由 9 个外显子组成， 外显子与外显子之间由内含子连接。当在细胞中 由 TYR 基因合成 mRNA 时， 剪接作用切掉了内含子， 外显子与外显子直接连接起来。外显子 与外显子之间连接处的部分称为外显子连接点。例如， 在基因组中外显子 1 与外显子 2 被 内含子隔离， 但是在 mRNA 合成过程中上述内含子被剪切， 所以 mRNA 中， 外显子 1 的 3’ 末端 与外显子 2 的 5’ 末端挨着。因为序列号 1 由 5 个外显子组成， 所以序列号 1 有以下 4 个外
显子连接点 ( 外显子连接点 1-4)。
外显子 1 与 2 之间的外显子连接点 1 ： 序列号 1 的第 901 位与 902 位的结合部分
外显子 2 与 3 之间的外显子连接点 2 ： 序列号 1 的第 1118 位与 1119 位的结合部 分
外显子 3 与 4 之间的外显子连接点 3 ： 序列号 1 的第 1266 位与 1267 位的结合部 分
外显子 4 与 5 之间的外显子连接点 4 ： 序列号 1 的第 1448 位与 1449 位的结合部 分
可与包含外显子连接点的区域杂交的引物虽然能与 TYR 基因的 mRNA 杂交， 但是与 TYR 基因的基因组 DNA 杂交的可能性极低。通过使用这样的引物， 可以防止以上述 RT-LAMP 反应检测 mRNA 时非特异性地扩增核酸。
根据 RT-LAMP 反应的反应机理 ( 参照美国专利第 6410278 号公报以及美国专利第 6974670 号公报 )， 最先与试样中的 TYR mRNA 杂交的是 RIP 的由第二序列构成的多聚核苷 酸部分。因此， 本发明的引物对更为理想的是， 上述引物中， RIP 的第二序列构成的多聚核 苷酸部分与含有外显子连接点的区域杂交。即， 较为理想的是上述 R2c 区域中含有外显子 连接点。这样， 能够防止在反应初期阶段非特异性地扩增核酸。 从 TYR mRNA 与来源于试样中其它基因的 mRNA 的相同性及检测速度、 检测再现性 等观点出发， 本发明的引物对最好包括与含有上述外显子连接点中外显子连接点 1 或 2 的 区域杂交的引物， 包括与含有外显子连接点 2 的区域杂交的引物更好。
本实施方式的引物与该引物杂交的 TYR mRNA 的特定区域， 不要求完全互补， 二者 只要具有可杂交的互补性即可 ( 这一点美国专利第 4800159 号公报上也有记述 )。即只 要是有引物功能的多聚核苷酸， 此引物也可以是在与上述特定区域完全互补的序列中导入 了一个或复数个即多个置换、 缺失、 插入、 附加等变异的多聚核苷酸。这种变异的多聚核苷 酸与未变异的多聚核苷酸相比， 以具有 80％以上的相同性为宜， 具有 90％以上的相同性更 好， 最好是具有 95％以上的相同性。
在 RT-LAMP 反应中， 引物与靶核酸 TYR mRNA 杂交后， 通过聚合酶的作用， 以引物 3’ 末端为起点进行核酸合成反应。为此， 引物的 3’ 末端部分与 TYRmRNA 的互补性越高， 核酸 合成反应越容易进行。所以， 本发明的引物最好 3’ 末端的 3 个核苷酸是与该引物杂交的区 域完全互补的多聚核苷酸， 如果 3’ 末端的 5 个核苷酸是完全互补的多聚核苷酸就更好了。
尤其当检测 TYR mRNA 时， 从提高特异性的角度看， 上述第二序列最好在 3 末’ 端含 有与上述第二区域的序列完全互补的连续 3 个核苷酸构成的序列， 含有与上述第二区域的 序列完全互补的连续 5 个核苷酸构成的序列更好。
各区域 F3、 F2、 F1、 R1c、 R2c、 R3c、 L 以及 M 设定在序列号 1 所示的 TYR mRNA 序列 中。以下列举这些区域的具体例子。
(F1)
第 795-817 位区域
第 1005-1024 位区域
第 1015-1036 位区域
第 1016-1040 位区域
第 1031-1054 位区域 (F2) 第 731-751 位区域 第 963-977 位区域 第 964-986 位区域 第 971-992 位区域 第 972-992 位区域 第 986-1008 位区域 (F3) 第 703-722 位区域 第 931-953 位区域 第 945-962 位区域 第 950-962 位区域 第 966-985 位区域 (R1c) 第 825-848 位区域 第 1026-1049 位区域 第 1041-1062 位区域 第 1044-1064 位区域 第 1044-1068 位区域 第 1057-1080 位区域 (R2c) 第 886-908 位区域 第 1110-1133 位区域 第 1114-1131 位区域 第 1114-1133 位区域 (R3c) 第 917-936 位区域 第 1135-1153 位区域 第 1138-1155 位区域 第 1138-1156 位区域 第 1141-1160 位区域 第 1142-1161 位区域 (L) 第 752-776 位区域 第 981-1004 位区域 第 982-1004 位区域 第 982-1006 位区域 第 986-1010 位区域第 987-1011 位区域 第 988-1011 位区域 第 988-1012 位区域 第 989-1011 位区域 第 989-1012 位区域 第 989-1013 位区域 第 990-1012 位区域 第 990-1013 位区域 第 990-1014 位区域 第 992-1015 位区域 第 993-1016 位区域 第 994-1016 位区域 第 995-1016 位区域 第 995-1018 位区域 第 996-1018 位区域 第 1000-1019 位区域 第 1001-1020 位区域 第 1003-1022 位区域 第 1004-1022 位区域 第 1005-1024 位区域 第 1006-1024 位区域 第 1008-1027 位区域 第 1009-1027 位区域 第 1009-1028 位区域 第 1010-1029 位区域 (M) 第 860-884 位区域 第 1063-1087 位区域 第 1065-1089 位区域 第 1066-1090 位区域 第 1067-1089 位区域 第 1067-1090 位区域 第 1068-1091 位区域 第 1068-1092 位区域 第 1069-1091 位区域 第 1069-1092 位区域 第 1069-1093 位区域 第 1070-1093 位区域 第 1070-1094 位区域第 1073-1097 位区域
第 1074-1098 位区域
第 1075-1099 位区域
第 1082-1104 位区域
第 1083-1105 位区域
第 1084-1105 位区域
第 1085-1107 位区域
(F3 引物 )
序列号 2 ： 5’ -AATGGAACGCCCGAGGGA-3’ ( 与第 950-967 位区域是相同的序列 )
序列号 3 ： 5’ -GACCTTTACGGCGTAATCCT-3’ ( 与第 966-985 位区域是相同的序列 )
序列号 4 ： 5’ -TATGCAATGGAACGCCCG-3’ ( 与第 945-962 位区域是相同的序列 )
序列号 5 ： 5’ -CAGCCATCAGTCTTTATGCAATG-3’ ( 与第 931-953 位区域是相同序列 )
序列号 6 ： 5’ -TCTGCCTTGGCATAGACTCT-3’ ( 与第 703-722 位区域是相同序列 )
(FIP)
序列号 7 ： 5’ -CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCTTACGGCGTAATCCTGGAAACC-3’ ( 连接第 1031-1054 位区域的互补序列和与第 971-992 位区域相同的序列的序列 )
序列号 8 ： 5’ -CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCGGAAACCATGACAAATCCAGAAC-3’ ( 连接第 1031-1054 位区域的互补序列和与第 986-1008 位区域相同的序列的序列 )
序列号 9 ： 5’ -TACATCAGCTGAAGAGGGGAGCAGGGACCTTTACGGC-3’ ( 连接第 1015-1036 位区域的互补序列和与第 963-977 位区域相同的序列的序列 )
序列号 10 ： 5’ -CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCTACGGCGTAATCCTGGAAACC-3’ ( 连接第 1031-1054 位区域的互补序列和与第 972-992 位区域相同的序列的序列 )
序列号 11 ： 5’ -AGAGGGGAGCCTTGGGGTTCAGGGACCTTTACGGC-3’ ( 连接第 1005-1024 位区域的互补序列和与第 963-977 位区域相同的序列的序列 )
序列号 12 ： 5’ -ATTCTACATCAGCTGAAGAGGGGAGGGGACCTTTACGGCGTAATCCTG-3’ ( 连接 第 1016-1040 位区域的互补序列和与第 964-986 位区域相同的序列的序列 )
序 列 号 13 ： 5’ -GTCACACTTTTCTGCATCCCGCCCGGTGGGAACAAGAAATCCAG-3’ ( 连接第 795-817 位区域的互补序列和与第 731-751 位区域相同的序列的序列 )
(RIP)
序列号 14 ： 5’ -CCAATATGAATCTGGTTCCATGGAGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3’ ( 连接与第 1057-1080 位区域相同的序列和第 1114-1133 位区域的互补序列的序列 )
序 列 号 15 ： 5’ -TTTGCCTGAGTTTGACCCAATAGGACTAGCAAATCCTTCC-3’ (连接与第 1041-1062 位区域相同的序列和第 1114-1131 位区域的互补序列的序列 )
序 列 号 16 ： 5’ -GCCTGAGTTTGACCCAATATGGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3’ ( 连接与第 1044-1064 位区域相同的序列和第 1114-1133 位区域的互补序列的序列 )
序列号 17 ： 5’ -CAGCTGATGTAGAATTTTGCCTGAGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3’ ( 连接与第 1026-1049 位区域相同的序列和第 1114-1133 位区域的互补序列的序列 )
序列号 18 ： 5’ -GCCTGAGTTTGACCCAATATGAATCGTGGACTAGCAAATCCTTCCAGTG-3’ (连 接与第 1044-1068 位区域相同的序列和 1110-1133 位区域的互补序列的序列 )序列号 19 ： 5’ -CAGATGAGTACATGGGAGGTCAGCAGACAATCTGCCAAGAGGAGAAG-3’ ( 连接 与第 825-848 位区域相同的序列和第 886-908 位区域的互补序列的序列 )
(R3 引物 )
序列号 20 ： 5’ -GAGGCATCCGCTATCCCA-3’ ( 第 1138-1155 位区域的互补序列 )
序列号 21 ： 5’ -TTTGAGAGGCATCCGCTATC-3’ ( 第 1141-1160 位区域的互补序列 )
序列号 22 ： 5’ -GGCATCCGCTATCCCAGTA-3’ ( 第 1135-1153 位区域的互补序列 )
序列号 23 ： 5’ -AGAGGCATCCGCTATCCCA-3’ ( 第 1138-1156 位区域的互补序列 )
序列号 24 ： 5’ -CTTTGAGAGGCATCCGCTAT-3’ ( 第 1142-1161 位区域的互补序列 )
序列号 25 ： 5’ -TGGCTGTTGTACTCCTCCAA-3’ ( 第 917-936 位区域的互补序列 )
( 环状引物 F)
序列号 26 ： 5’ -GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTCA-3’ ( 第 994-1016 位区域的互补序列 )
序列号 27 ： 5’ -CTGAAGAGGGGAGCCTTGGG-3’ ( 第 1009-1028 位区域的互补序列 )
序列号 28 ： 5’ -GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTCAT-3’ ( 第 993-1016 位区域的互补序列 )
序列号 29 ： 5’ -TGAAGAGGGGAGCCTTGGG-3’ ( 第 1009-1027 位区域的互补序列 )
序列号 30 ： 5’ -GGAGCCTTGGGGTTCTGGAT-3’ ( 第 1000-1019 位区域的互补序列 )
序列号 31 ： 5’ -GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTC-3’ ( 第 995-1016 位区域的互补序列 ) 序列号 32 ： 5’ -GGGTTCTGGATTTGTCATGGTTTCC-3’ ( 第 986-1010 位区域的互补序列 ) 序列号 33 ： 5’ -GGGAGCCTTGGGGTTCTGGA-3’ ( 第 1001-1020 位区域的互补序列 ) 序列号 34 ： 5’ -GAGCCTTGGGGTTCTGGATTTGT-3’ ( 第 996-1018 位区域的互补序列 ) 序列号 35 ： 5’ -GCTGAAGAGGGGAGCCTTGG-3’ ( 第 1010-1029 位区域的互补序列 ) 序列号 36 ： 5’ -TCTGGATTTGTCATGGTTTCCAGGA-3’ ( 第 982-1006 位区域的互补序列 ) 序列号 37 ： 5’ -GAGCCTTGGGGTTCTGGATTTGTC-3’ ( 第 995-1018 位区域的互补序列 ) 序列号 38 ： 5’ -TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3’ ( 第 989-1012 位区域的互补序列 ) 序列号 39 ： 5’ -GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTTC-3’ ( 第 987-1011 位区域的互补序列 ) 序列号 40 ： 5’ -TGAAGAGGGGAGCCTTGGGG-3’ ( 第 1008-1027 位区域的互补序列 ) 序列号 41 ： 5’ -CTTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3’ ( 第 990-1014 位区域的互补序列 ) 序列号 42 ： 5’ -TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3’ ( 第 990-1012 位区域的互补序列 ) 序列号 43 ： 5’ -AGGGGAGCCTTGGGGTTCT-3’ ( 第 1004-1022 位区域的互补序列 ) 序列号 44 ： 5’ -AGAGGGGAGCCTTGGGGTTC-3’ ( 第 1005-1024 位区域的互补序列 ) 序列号 45 ： 5’ -TTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3’ ( 第 990-1013 位区域的互补序列 ) 序列号 46 ： 5’ -AGAGGGGAGCCTTGGGGTT-3’ ( 第 1006-1024 位区域的互补序列 ) 序列号 47 ： 5’ -TGGATTTGTCATGGTTTCCAGGAT-3’ ( 第 981-1004 位区域的互补序列 ) 序列号 48 ： 5’ -TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTT-3’ ( 第 988-1012 位区域的互补序列 ) 序列号 49 ： 5’ -GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3’ ( 第 989-1011 位区域的互补序列 ) 序列号 50 ： 5’ -CCTTGGGGTTCTGGATTTGTCATG-3’ ( 第 992-1015 位区域的互补序列 ) 序列号 51 ： 5’ -TGGATTTGTCATGGTTTCCAGGA-3’ ( 第 982-1004 位区域的互补序列 ) 序列号 52 ： 5’ -GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTT-3’ ( 第 988-1011 位区域的互补序列 ) 序列号 53 ： 5’ -TTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3’ ( 第 989-1013 位区域的互补序列 ) 序列号 54 ： 5’ -AGGGGAGCCTTGGGGTTCTG-3’ ( 第 1003-1022 位区域的互补序列 )序列号 55 ： 5’ -TGAAGTTTTCATCTCCTGTCAGCTT-3’ ( 第 752-776 位区域的互补序列 )
( 环状引物 R)
序列号 56 ： 5’ -AAAGCTGCCAATTTCAGCTTTAG-3’ ( 与第 1082-1104 位区域相同的序列 )
序列号 57 ： 5’ -AGCTGCCAATTTCAGCTTTAGA-3’ ( 与第 1084-1105 位区域相同的序列 )
序列号 58 ： 5’ -GCTGCCAATTTCAGCTTTAGAAA-3’ ( 与第 1085-1107 位区域相同的序列 )
序列号 59 ： 5’ -AAGCTGCCAATTTCAGCTTTAGA-3’ ( 与第 1083-1105 位区域相同的序列 )
序列号 60 ： 5’ -ATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCC-3’ ( 与第 1066-1090 位区域相同的序列 )
序列号 61 ： 5’ -AATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGC-3’ ( 与第 1065-1089 位区域相同的序列 )
序列号 62 ： 5’ -CTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAA-3’ ( 与第 1068-1092 位区域相同的序列 )
序列号 63 ： 5’ -TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAA-3’ ( 与第 1069-1092 位区域相同的序列 )
序列号 64 ： 5’ -GGTTCCATGGATAAAGCTGCCAAT-3’ ( 与第 1070-1093 位区域相同的序列 )
序列号 65 ： 5’ -TCCATGGATAAAGCTGCCAATTTCA-3’ ( 与第 1073-1097 位区域相同的序列 )
序列号 66 ： 5’ -CTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCA-3’ ( 与第 1068-1091 位区域相同的序列 )
序列号 67 ： 5’ -TCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCC-3’ ( 与第 1067-1090 位区域相同的序列 )
序列号 68 ： 5’ -TGAATCTGGTTCCATGGATAAAGCT-3’ ( 与第 1063-1087 位区域相同的序列 )
序列号 69 ： 5’ -TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCA-3’ ( 与第 1069-1091 位区域相同的序列 )
序列号 70 ： 5’ -CATGGATAAAGCTGCCAATTTCAGC-3’ ( 与第 1075-1099 位区域相同的序列 )
序列号 71 ： 5’ -GGTTCCATGGATAAAGCTGCCAATT-3’ ( 与第 1070-1094 位区域相同的序列 )
序列号 72 ： 5’ -CCATGGATAAAGCTGCCAATTTCAG-3’ ( 与第 1074-1098 位区域相同的序列 )
序列号 73 ： 5’ -TCTGGTTCCATGGATAAAGCTGC-3’ ( 与第 1067-1089 位区域相同的序列 )
序列号 74 ： 5’ -TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAAT-3’ ( 与第 1069-1093 位区域相同的序列 )
序列号 75 ： 5’ -CCTAACTTACTCAGCCCAGCATCAT-3’ ( 与第 860-884 位区域相同的序列 )
上述引物中， 序列号 19 所示核苷酸序列构成的引物， 可与含有外显子连接点 1 的 区域杂交。
序列号 14-18 的引物， 可与含有外显子连接点 2 的区域杂交。
上述引物中， 可根据扩增区域适当组合 F3 引物、 FIP、 RIP 以及 R3 引物， 并将其作 为含有四种引物的引物对使用。也可以再加上环状引物 F 和 R 可以组成含有六种引物的引 物对使用。这种引物对的具体例示见以下表 1。
[ 表 1]
逆转录酶和链置换型 DNA 聚合酶可以使用众所周知的酶。也可以使用具有以 RNA 为模板合成 DNA 的作用和在进行链置换的同时以 DNA 为模板合成 DNA 的作用的一种酶取代 这二种酶 ( 逆转录酶和链置换型 DNA 聚合酶 )。
最好还使用为酶反应创造适宜条件的缓冲剂。
上述物质可以分别装在不同的容器中， 也可以将逆转录酶和链置换型 DNA 聚合酶 装在同一容器中。 dNTPs、 缓冲剂以及各种引物中， 可以将至少两种物质放在同一个容器中。 向用户提供这些试剂时， 也可以提供含有上述部分或全部试剂的试剂盒。
[TYR mRNA 的检测方法及 TYR mRNA 检测用试剂盒 ]
下面说明 TYR mRNA 的检测方法。本发明的 TYR mRNA 的检测方法可以通过以下二 种途径实现 ：
使用上述引物对、 RNA 依赖性 DNA 聚合酶及 DNA 依赖性 DNA 聚合酶 ( 以下称 “实施 方式 1 的检测方法” )； 或者
使用上述引物对、 以及具有以 RNA 为模板合成 DNA 作用和边进行链置换边以 DNA 为模板合成 DNA 作用的酶 ( 以下称 “实施方式 2 的检测方法” )。
上述实施方式 1 的检测方法包括以下步骤 ：
(I-1) 使试样、 上述引物对及 RNA 依赖性 DNA 聚合酶发生反应， 由上述试样中的酪 氨酸酶 mRNA 合成 cDNA ；
(II-1) 使上述引物对、 DNA 依赖性 DNA 聚合酶和在上述步骤 (I-1) 合成的 cDNA 发 生反应， 扩增 cDNA ；
(III-1) 通过检测在上述步骤 (II-1) 扩增的 cDNA， 检测上述试样中的酪氨酸酶 mRNA。
上述实施方式 2 的检测方法包括以下步骤 ：
(I-2) 使试样和上述引物对与具有以 RNA 为模板合成 DNA 作用和边进行链置换 边以 DNA 为模板合成 DNA 作用的酶发生反应， 以上述试样中的酪氨酸酶 mRNA 为模板合成 cDNA， 并以此 cDNA 为模板再合成该 cDNA， 进行扩增 ； 及
(II-2) 通过检测在上述步骤扩增的 cDNA， 检测上述试样中的酪氨酸酶 mRNA。
实施方式 1 和 2 的检测方法从高效、 准确、 快速地检测 TYR mRNA 的角度看， 最好使 用 RT-LAMP 法进行。
在上述实施方式 1 的检测方法中， 当使用 RT-LAMP 法时， 通过混合上述引物对、 RNA 依赖性 DNA 聚合酶 ( 以下称 “逆转录酶” )、 有链置换活性的 DNA 依赖性 DNA 聚合酶 ( 以下称 “链置换型 DNA 聚合酶” )、 dNTPs( 包括 dATP、 dGTP、 dTTP 及 dCTP) 及试样， 使其进行反应， 就 可检测出试样中的 TYR mRNA。因此， 此时上述步骤 (I-1) 及 (II-1) 可以一步进行。
另一方面， 在上述实施方式 2 的检测方法中， 如果使用 RT-LAMP 法， 则混合上述引 物对、 具有以 RNA 为模板合成 DNA 作用和边进行链置换边以 DNA 为模板合成 DNA 作用的酶、 dNTPs 及试样， 使其产生反应， 就可检测出试样中的 TYRmRNA。
逆转录酶和链置换型 DNA 聚合酶可以使用众所周知的酶。
另外， 实施方式 1 的检测方法的步骤 (I-1) 及 (II-1) 以及实施方式 2 的检测方法 的步骤 (I-2) 最好还使用为各步骤的酶反应创造适宜条件的缓冲剂。
用于 TYR mRNA 检测的试样如采自生物体的组织 ( 淋巴结、 淋巴液、 血液等 ) 和粪 便等。
在实施方式 1 的检测方法中， 在使用 RT-LAMP 法的情况下， 检测 TYR mRNA 要经过 扩增步骤 [ 上述步骤 (I-1) 及 (II-1)] 和检测步骤 [ 上述步骤 (III-1)]。
首先， 将含有从生物体采集的 TYR mRNA 的试样与上述引物对、 逆转录酶、 dNTPs 以 及链置换型 DNA 聚合酶混合在一起。再将所得混合物加热到一定温度 ( 例如 65℃ )， 进行 RT 反应和 LAMP 反应， 以 TYR mRNA 为模板合成 TYR cDNA， 同时以此 TYR cDNA 为模板再合成 该 TYR cDNA， 进行扩增 [ 上述步骤 (I-1) 及 (II-1)]。
RT 反应和 LAMP 反应的反应机理如下 ：
首先， RIP 的第二序列与反应液中 TYR mRNA 的 R2c 区域杂交。然后， 通过逆转录 酶， 从该 RIP 的 3’ 末端开始， 以 TYR mRNA 为模板合成 TYR cDNA 。通过这一反应， 合成由 TYR mRNA 与从该 RIP 延长出的 TYR cDNA(RIP 延长链 ) 组成的双链核酸。
接着， R3 引物与 TYR mRNA 的 R3c 区域杂交。由于链置换型 DNA 聚合酶的作用， 从 该 R3 引物的 3’ 末端开始， 以 TYR mRNA 为模板， 剥离 ( 置换 ) 已与 TYRmRNA 结合的上述 RIP 延长链， 同时合成 TYR cDNA。
上述 RIP 延长链为单链状态， 具有与 TYR mRNA 互补的序列， 因此， 该 RIP 延长链中包含与 TYR mRNA 的 F2 区域互补的 F2c 区域。FIP 的第四序列与此 RIP 延长链的 F2c 区域 杂交。
然后， 由于链置换型 DNA 聚合酶的作用， 以上述 RIP 延长链为模板从 FIP 的 3’ 末 端开始合成 DNA。在此合成的 DNA 因为在其 5’ 末端有第三序列 ( 与 F1 区域杂交的多聚核 苷酸序列 )， 该第三序列构成的多聚核苷酸与此 DNA 上的 F1 区域杂交， 形成茎环结构。此 DNA 在 3’ 末端有第一序列的互补序列 ( 与 R1c 区域杂交的序列 )， 该第一序列的互补序列 与此 DNA 上的 R1c 区域杂交， 形成茎环结构。因此， 此 DNA 形成在 5’ 末端以及 3’ 末端两端 有茎环结构的哑铃结构。
上述哑铃结构的 DNA( 哑铃 DNA) 以该哑铃 DNA 中的其他部分为模板， 从其 3’ 末端 开始， 在解开 5’ 末端茎环结构的同时， 通过链置换型 DNA 聚合酶进行延长， 获得延长链。这 个延伸链在其 5’ 末端、 3’ 末端以及它们的中间部分分别具有相互互补的序列， 因此， 在该延 长链中形成了三个茎环结构。而且， 该延长链从其 3’ 末端开始， 以该延长链的其他部分为 模板， 一边解开上述茎环结构， 一边通过链置换型 DNA 聚合酶的作用进行延长。通过这个反 应实际上在恒温下反复进行， 合成分子中含有多个特定序列的核酸 ( 该反应的具体内容参 阅美国专利第 6410278 号公报以及美国专利第 6974670 号公报 )。
如此获得的扩增产物中的核酸大部分为 dsDNA( 双链 DNA)， 因此在检测步骤 [ 上 述步骤 (III-1)] 中， 可将这些扩增产物用像溴化乙锭、 SYBR( 注册商标 )GREEN 1、 Pico Green( 注册商标 ) 等荧光嵌入剂进行荧光染色后， 照射紫外线使其产生荧光， 来检测该扩 增产物。
荧光染色也可通过在扩增反应后 [ 上述步骤 (II-1) 后 ] 的反应液中添加荧光色 素来实施， 也可以预先在上述反应液中添加荧光色素， 在有荧光色素存在的情况下进行核 酸扩增。 在检测步骤 [ 上述步骤 (III-1)]， 可通过是否检测出荧光来判断试样中是否有 TYR mRNA。另外， 还可以通过测定扩增反应后 [ 上述步骤 (II-1) 后 ] 的反应液的荧光强度来对 扩增产物进行定量， 也可以此定量结果为基础， 对试样中含有的 TYR mRNA 进行定量。特别 是在荧光色素存在的情况下进行核酸扩增时， 通过实时测定反应液中荧光强度的增大， 以 及测定达到一定荧光强度所需的时间， 可以换算出试样中的 TYR mRNA 含量 ( 实时 RT-PCR 法、 实时 RT-LAMP 法等 )。
此外， 在上述步骤 (II-1) 中的 LAMP 反应中， 会生成不溶于水的副产物焦磷酸镁。 该焦磷酸镁随着核酸扩增的进行而增多， 反应液随着焦磷酸镁的增多而变得白浊。 为此， 可 以通过 i) 目视判断反应液的浊度 ； ii) 测定反应液的吸光度及散射光强度来测定其浊度 ； 或 iii) 使用有色过滤器过滤反应液， 确认过滤器上的残渣， 检测出靶核酸 ( 参照国际公开 第 01/83817 号 )。当通过测定反应液的吸光度或散射光强度来测定浊度时， 和上述使用荧 光色素时一样， 可通过实时监测浊度的变化， 在封闭系统中追踪 DNA 扩增以及浊度的增加 情况。因此， 在检测步骤 [ 上述步骤 (III-1)] 中， 可根据反应液是否白浊化， 判断试样中是 否存在 TYR mRNA。 此外， 通过测定扩增产物的浊度， 可以对该扩增产物定量， 根据定量结果， 还可以对试样中含有的 TYR mRNA 进行定量。在实时测定浊度增加的时候， 也可以测定到 达一定浊度所需要的时间 ( 以下， 称为 “扩增上升时间” )， 再将该时间换算成试样中的 TYR mRNA 含量。
另一方面， 在实施方式 2 的检测方法中， 步骤 (I-2) 是对应于上述实施方式 1 的检测方法中的扩增步骤 [ 上述步骤 (I-1) 和 (II-1)] 的扩增步骤。此步骤 (I-2) 除用一种既 能以 RNA 为模板合成 DNA 又可在进行链置换的同时以 DNA 为模板合成 DNA 的酶取代上述步 骤 (I-1) 和 (II-1) 中的两种酶 ( 逆转录酶和链置换 DNA 聚合酶 ) 外， 其他均可与上述步骤 (I-1) 和 (II-1) 相同。
在实施方式 2 的检测方法中， 步骤 (II-2) 可与上述实施方式 1 的检测方法中的检 测步骤 [ 上述步骤 (III-1)] 相同。
本发明可提供 mRNA 检测用试剂盒作为上述步骤 (I-1)、 步骤 (II-1) 和步骤 (I-2) 使用的试剂。该 mRNA 检测用试剂盒包括上述引物对、 dNTPs 及兼具以 RNA 为模板合成 DNA 功能和在进行链置换同时以 DNA 为模板合成 DNA 功能的酶或 RNA 依赖性 DNA 聚合酶和 DNA 依赖性 DNA 聚合酶。
上述各试剂可以分别装于不同的容器中。逆转录酶和链置换型 DNA 聚合酶也可以 装于同一容器中。也可以将 dNTPs、 缓冲剂和各种引物中的至少二种试剂装于同一容器中。
下面举实施例详细说明本发明。不过， 本发明不限于这些实施例。
( 实施例 1)
如下验证使用表 1 中列出的引物对 1-45 能否检测出 TYR mRNA。
(1) 制备试样
用无核糖核酸酶 (RNase-free) 的超纯水对 5×1010 拷贝 /μL 的 TYR mRNA 进行阶 段性稀释， 制备出 2.5×103 拷贝 /μL 的 TYR mRNA。
(2) 制备反应液
将表 1 所示 F3 引物、 FIP、 RIP 以及 R3 引物按如下配比加入缓冲液 [10mM 三羟甲 基氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCI)(pH8.0)]， 制备混合引物 ( 引物 MIX)。
16μM FIP
16μM RIP
1μM F3 引物
1μM R3 引物
12μM 环状引物 F
12μM 环状引物 R
10mM Tris-HCI(pH8.0)
混合各种试剂， 制备出如下配比的 RT-LAMP 反应用缓冲液。
53m MTris-HCI(pH8.8)
1.8×Thermopol 缓冲液 (New England Biolabs 制 )
1.43mM dNTPs(Invitrogen 公司制 )
5.36mM MgSO4(NACALAI TESQUE( 株 ) 制 )
8.93mM DTT( 和光纯药 ( 株 ) 制 )
2 体积％ Tergitol(Sigma 制 )
混合各种试剂， 制备出配比如下的酶溶液 (3.04μL)。
10U/μL AMV 逆转录酶 (Promega 制 ) 0.14μL
8U/μL Bst DNA 聚合酶 (New England Biolabs 制 ) 2.27μL
40U/μL Rnase 抑制剂 (Promega 制 ) 0.63μL混合各试剂， 制备 25μL 如下配比的反应液。反应液分别针对 45 种引物对制备。
RT-LAMP 反应用缓冲液 14.0μL
酶溶液 3.0μL
混合引物 5.0μL
10mM Tris-HCI(pH8.0) 1.0μL
RNA 试样 2.0μL
此外， 作为与 45 种反应液分别对应的阴性对照 (NC)， 还添加 2.0μL 超纯水取代 2.0μL RNA 试样， 制备了 NC 用反应液 (45 种 )。
(3) 检测及检测结果
将装有含 45 种引物对中某一种的反应液的试管放置到预先加温至 65℃的浊度实 时测定装置 (TERAMECS 公司制， 商品名 ： LA-200) 中。然后， 在 65℃温度下， 培养上述试管 中的反应液， 进行 LAMP 反应。测定从反应开始到反应液浊度达到 0.1 时所需的时间。阴性 对照测定进行一次， 含 RNA 试样的反应液测定进行 3 次 (n ＝ 3)。阴性对照测定结果和含 RNA 试样反应液测定结果的平均值见表 2。表中， “NC” 表示阴性对照时的测定结果。表中 的 “-( 连字符 )” 表示在 60 分钟以内浊度未达到 0.1。
[ 表 2]
从表 2 所示结果可以看出， 阴性对照时， 60 分钟内未发生非特异性核酸扩增， 未能 检测到 TYR mRNA 的存在。然而， 含 RNA 试样的反应液中， 在 60 分钟内反应液的浊度达到 0.1， 故使用本发明一实施方式涉及的引物对 1-45 种中的任意一种， 都能快速检测出 TYR mRNA。23102046789 A CN 102046793
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(i) 序列号 1 的第 901 及 902 位核苷酸、 或
(ii) 序列号 1 的第 1118 及 1119 位核苷酸 ；
[2] 一种酪氨酸酶 mRNA 检测用引物对， 该酪氨酸酶 mRNA 检测用引物对用于检测试 样中的酪氨酸酶的 mRNA，
其包括第一引物、 第二引物及第三引物，
上述第一引物是权利要求 1 所记述的引物，
上述第二引物在 5’ 末端一侧含有第三序列， 在 3’ 末端一侧含有第四序列，
上述第三序列
(a2) 长度为 10-30 个核苷酸
(b2) 是一种可与序列号 1 中比第一区域靠近 5’ 末端一侧的第三区域杂交的多聚 核苷酸序列，
上述第四序列
(c2) 长度为 10-30 个核苷酸
(d2) 是一种可与上述序列号 1 中比第三区域靠近 5’ 末端一侧的第四区域的互补 链杂交的多聚核苷酸序列， 上述第三引物由可与上述序列号 1 中比第四区域靠近 5’ 末端一侧的第五区域的 互补链杂交的多聚核苷酸序列组成 ；
[3] 一种酪氨酸酶 mRNA 检测用试剂盒， 包括
上述 [2] 所记述的引物对、
dNTPs、
具有以 RNA 为模板合成 DNA 的作用和边进行链置换边以 DNA 为模板合成 DNA 的作 用的酶、 或 RNA 依赖性 DNA 聚合酶及 DNA 依赖性 DNA 聚合酶 ；
[4] 一种酪氨酸酶 mRNA 检测方法， 包括以下步骤 ：
使试样、 上述 [2] 所述引物对及 RNA 依赖性 DNA 聚合酶发生反应， 由上述试样中的 酪氨酸酶 mRNA 合成 cDNA，
使上述引物对、 DNA 依赖性 DNA 聚合酶和在上述步骤合成的 cDNA 发生反应， 扩增 上述 cDNA， 以及
通过检测在上述步骤扩增的 cDNA， 检测上述试样中的酪氨酸酶 mRNA ；
[5] 一种酪氨酸酶 mRNA 检测方法， 包括以下步骤 ：
使试样和上述 [2] 所述引物对与具有以 RNA 为模板合成 DNA 的作用和边进行链置 换边以 DNA 为模板合成 DNA 的作用的酶发生反应， 以上述试样中的酪氨酸酶 mRNA 为模板合 成 cDNA， 并以此 cDNA 为模板再合成该 cDNA 进行扩增，
通过检测在上述步骤扩增的 cDNA， 检测上述试样中的酪氨酸酶 mRNA。
采用本发明的 TYR mRNA 检测用引物、 TYR mRNA 检测用引物对、 TYR mRNA 检测用试 剂盒以及 TYR mRNA 检测方法， 可以在短时间内检测出 TYR mRNA。
附图说明 ：
图 1 为引物及引物杂交的区域的示意图。具体实施方式 ：
( 引物及引物对 )
首先就检测 TYR mRNA 用的 TYR mRNA 检测用引物进行说明。
在本说明书中， 所谓 “检测” 不仅指判断试样中是否存在靶物质—— TYR mRNA， 还 包括定量试样中的 TYR mRNA。
在本说明书中， 所谓 “引物”指在 LAMP( 环介导等温扩增反应， Loop-mediated Isothermal Amplification) 法 ( 参照美国专利第 6410278 号公报以及美国专利第 6974670 号公报 ) 等核酸扩增技术中， 与扩增目标核酸的特定区域杂交的多聚核苷酸， 该多聚核苷 酸具有能作为聚合酶扩增反应起点的功能 ( 以下， 称为 “引物功能” )。待检测核酸是 mRNA， 故可以通过包括逆转录反应的核酸扩增反应 ( 例如 ： RT-LAMP 法等等 ) 加以检测。
所谓 “杂交” 是指在严格条件下， 基于多聚核苷酸碱基之间的互补性， 某多聚核苷 酸的一部分或全部序列通过氢键与其它多聚核苷酸的一部分或全部序列结合。
所谓 “严格条件” 指进行多聚核苷酸杂交时该行业专业人士普遍使用的条件， 只要 满足本实施方式的引物能与 TYR mRNA 或其 cDNA 杂交这一条件即可， 无特别限定。已知， 杂 交时的严格条件是指温度、 盐浓度、 引物链长、 引物中 GC 含量以及杂交缓冲液中的离液剂 浓度函数。例如作为严格条件， 可以使用 Sambrook， J. 等， 1998， 分子克隆 ： 实验室手册 ( 第 2 版 )， 冷泉港实验室， 纽约 (1998， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(2nd ed.)， Cold Spring Harbor Laboratory Press， New York) 所记载的条件等。更具体地， 比如可 以列举出 ： “在含有 50％甲酰胺、 5×SSC(150mM NaCl， 15mM 柠檬酸钠 )、 50mM 磷酸钠、 pH7.6， 5× 登哈特 (Denhardt’ s) 溶液、 10％硫酸葡聚糖以及 20μg/ml 核酸的溶液中， 杂交温度为 42℃” ， 但不限定于此。
TYR mRNA 的核苷酸序列是与序列号 1 所示序列相对应的序列。虽然 mRNA 中含有 的是尿嘧啶而不是胸腺嘧啶， 但在序列号 1 为方便起见， 将尿嘧啶表示为胸腺嘧啶 (t)。这 个序列在基因库 (GenBank) 数据库中的登录号为 ： NM_000372。
本发明一实施方式 ( 实施方式 1) 涉及的引物是用于从试样中检测酪氨酸酶 mRNA 的 TYR mRNA 检测用引物， 其特征在于 ：
它在 5’ 末端一侧包含第一序列， 在 3’ 末端一侧包含第二序列，
上述第一序列
(a1) 长度为 10-30 个核苷酸，
(b1) 是一种能与序列号 1 的部分区域——第一区域的互补链杂交的多聚核苷酸 序列，
上述第二序列
(c1) 长度为 10-30 个核苷酸，
(d1) 是一种可与序列号 1 中比第一区域靠近 3’ 末端一侧的第二区域杂交的多聚 核苷酸序列，
上述第二区域含有
(i) 序列号 1 的第 901 及 902 位核苷酸 ； 或
(ii) 序列号 1 的第 1118 及 1119 位核苷酸。本实施方式 1 的引物是一种特别适用于通过 RT-LAMP 法检测 TYR mRNA 的引物。 用 本实施方式 1 的引物， 由于其在 5’ 末端一侧包含上述第一序列， 在 3’ 末端一侧包含上述第 二序列， 因此， 可以高效地、 高再现性地检测出 TYR mRNA。
在上述 RT-LAMP 法中， 首先通过逆转录反应 (RT 反应 ) 从 TYR mRNA 合成 cDNA， 再 通过 LAMP 反应扩增合成的 cDNA。
使用 RT-LAMP 法检测 TYR mRNA 时， 比如如图 1 所示， 可以使用由下述多聚核苷酸构 成的引物作为本实施方式 1 的引物， 该多聚核苷酸在 5’ 末端侧有第一序列——即可与 TYR mRNA 的一部分区域 ( 图 1 中 “R1c” ) 的互补区域 ( 图 1 中 “R1” ) 杂交的多聚核苷酸序列， 在 3’ 末端侧有第二序列——即可与 TYRmRNA 中位于上述 R1c 区域下游 (3’ 末端 ) 的区域 (图1中 “R2c” ) 杂交的多聚核苷酸序列。
上述第一序列和第二序列， 从本实施方式 1 的引物和该引物杂交的区域之间的杂 交特异性的角度考虑， 其各自长度最好分别为 10 个核苷酸以上， 检测 TYR mRNA 时， 为保证 易于进行操作的杂交温度， 其最好长度是 30 个核苷酸以下。
在本实施方式 1 的引物中， 第一序列与第二序列既可直接连接， 也可通过间插 序列连接。间插序列最好是与 TYR mRNA 或 TYR cDNA 相关性低的序列。例如， 可举出 5’ -tttt-3’ 等。间插序列长度以 1-50 个核苷酸为宜， 1-40 个核苷酸更好。 本实施方式 1 的引物在上述 RT-LAMP 法所使用的引物当中， 可以作为反向内引物 ( 以下， 称为 “RIP” ) 发挥作用。
要用 RT-LAMP 法检测 TYR mRNA， 可以使用上述实施方式 1 的引物 (RIP)、 正向内引 物 ( 以下称 “FIP” ) 以及 F3 引物。本发明中也包括含有这些引物的 TYR mRNA 检测用引物 对。
本发明一实施方式涉及的 TYR mRNA 检测用引物对是一种用于检测试样中的酪氨 酸酶 mRNA 的 TYR mRNA 检测用引物对， 其特征在于 ：
该引物对包括第一引物、 第二引物及第三引物，
上述第一引物是上述实施方式 1 的引物，
上述第二引物在 5’ 末端一侧含有第三序列， 在 3’ 末端一侧含有第四序列，
上述第三序列
(a2) 长度为 10-30 个核苷酸
(b2) 是一种可与在序列号 1 中比第一区域靠近 5’ 末端一侧的第三区域杂交的多 聚核苷酸序列，
上述第四序列
(c2) 长度为 10-30 个核苷酸，
(d2) 是一种可与序列号 1 中比第三区域靠近 5’ 末端一侧的第四区域的互补链杂 交的多聚核苷酸序列，
上述第三引物由可与比上述序列号 1 中第四区域靠近 5’ 末端一侧的第五区域的 互补链杂交的多聚核苷酸序列组成。
使用本实施方式的引物对， 由于其包含上述第一引物、 第二引物及第三引物， 可以 高效、 快速、 高再现性地检测出 TYR mRNA。
本实施方式的引物对也可以包含第四引物， 该第四引物可以与比上述序列号 1 中
第二区域靠近 3’ 末端一侧的第六区域杂交。本实施方式的引物对还可以包含第五引物， 该 第五引物可以与位于上述序列号 1 中第三区域和第四区域之间的第七区域杂交。本实施方 式的引物对还可以包含第六引物， 该第六引物与位于上述序列号 1 中第一区域和第二区域 之间的第八区域的互补区域杂交。
下面根据图 1 进一步说明上述引物及引物对。
图 1 是引物和引物杂交区域的示意图。图 1 中， F1、 F2、 L、 F1、 R1c、 R2c 及 R3c 各 区域为 TYR mRNA 上的区域， F3c、 F2c、 F1c、 R1、 M、 R2 及 R3 各区域是 TYR mRNA 互补链 TYR cDNA 上的区域。F1 和 F1c、 F2 和 F2c、 F3 和 F3c、 R1 和 R1c、 R2 和 R2c 及 R3 和 R3c 分别互 补。这些区域在考虑 TYR mRNA 的检测效率和再现性等的基础上进行选择。
在图 1， RIP 对应上述第一引物， FIP 对应上述第二引物， F3 引物对应上述第三引 物， R3 引物对应上述第四引物， 环状引物 F 对应上述第五引物， 环状引物 R 对应上述第六引 物。
FIP( 第二引物 ) 为多聚核苷酸， 其在 5’ 末端一侧有可与 TYR mRNA 的互补链 TYR cDNA 的 F1 区域 (F1c 互补区域 ) 杂交的多聚核苷酸序列——第三序列， 在 3’ 末端一侧有可 与 TYR cDNA 的 F2c 区域杂交的多聚核苷酸序列——第四序列。第三序列和第四序列可以 直接连接， 也可以通过上述间插序列连接。在 FIP， 第三序列和第四序列的长度与上述第一 序列和第二序列的长度相同。 F3 引物 ( 第三引物 ) 由可以与比 TYR cDNA 的 F2c 更靠近下游 (3’ 末端一侧 ) 的 F3c 区域杂交的多聚核苷酸构成。
本发明的引物对除 FIP、 RIP 及 F3 引物外， 还也可以包含 R3 引物。此 R3 引物由可 与比 TYR mRNA 的 R2c 更靠近下游 (3’ 末端一侧 ) 的 R3c 区域杂交的多聚核苷酸构成。
本发明的引物对还可以含有环状引物。环状引物如有可与 TYR mRNA 上位于 F2 与 F1 之间的 L 区域杂交的多聚核苷酸——环状引物 F、 及可与在 TYR cDNA 上位于 R1 和 R2 之 间的 M 区域杂交的多聚核苷酸——环状引物 R 等。本发明的引物对也可以包含环状引物 F 及 R 其中之一或二者均包括。
当本发明的引物对包含环状引物 F 及 R 其中之一或全部时， 利用该引物对可以更 快速地通过 LAMP 反应进行 cDNA 扩增。
F3 引物、 R3 引物、 环状引物 F 及 R 的链长只要足够表达引物功能即可， 无特别限 定。众所周知的催化核酸合成反应的聚合酶所识别的引物链长为 5 个核苷酸以上， 因此， 上 述各引物的链长最好分别是 5-100 个核苷酸。从引物的核苷酸序列与引物杂交的区域之间 的特异性来考虑， 所述各引物的链长最好为 10 个核苷酸以上， 从引物的杂交温度来考虑， 引物链长最好在 30 个核苷酸以下。FIP 以及 RIP 的链长以 20-200 个核苷酸为宜， 20-60 个 核苷酸更好。
在本发明的引物对中， 最好上述引物中至少有一个与 TYR mRNA 含有外显子连接点 的区域杂交。TYR 基因由 9 个外显子组成， 外显子与外显子之间由内含子连接。当在细胞中 由 TYR 基因合成 mRNA 时， 剪接作用切掉了内含子， 外显子与外显子直接连接起来。外显子 与外显子之间连接处的部分称为外显子连接点。例如， 在基因组中外显子 1 与外显子 2 被 内含子隔离， 但是在 mRNA 合成过程中上述内含子被剪切， 所以 mRNA 中， 外显子 1 的 3’ 末端 与外显子 2 的 5’ 末端挨着。因为序列号 1 由 5 个外显子组成， 所以序列号 1 有以下 4 个外
显子连接点 ( 外显子连接点 1-4)。
外显子 1 与 2 之间的外显子连接点 1 ： 序列号 1 的第 901 位与 902 位的结合部分
外显子 2 与 3 之间的外显子连接点 2 ： 序列号 1 的第 1118 位与 1119 位的结合部 分
外显子 3 与 4 之间的外显子连接点 3 ： 序列号 1 的第 1266 位与 1267 位的结合部 分
外显子 4 与 5 之间的外显子连接点 4 ： 序列号 1 的第 1448 位与 1449 位的结合部 分
可与包含外显子连接点的区域杂交的引物虽然能与 TYR 基因的 mRNA 杂交， 但是与 TYR 基因的基因组 DNA 杂交的可能性极低。通过使用这样的引物， 可以防止以上述 RT-LAMP 反应检测 mRNA 时非特异性地扩增核酸。
根据 RT-LAMP 反应的反应机理 ( 参照美国专利第 6410278 号公报以及美国专利第 6974670 号公报 )， 最先与试样中的 TYR mRNA 杂交的是 RIP 的由第二序列构成的多聚核苷 酸部分。因此， 本发明的引物对更为理想的是， 上述引物中， RIP 的第二序列构成的多聚核 苷酸部分与含有外显子连接点的区域杂交。即， 较为理想的是上述 R2c 区域中含有外显子 连接点。这样， 能够防止在反应初期阶段非特异性地扩增核酸。 从 TYR mRNA 与来源于试样中其它基因的 mRNA 的相同性及检测速度、 检测再现性 等观点出发， 本发明的引物对最好包括与含有上述外显子连接点中外显子连接点 1 或 2 的 区域杂交的引物， 包括与含有外显子连接点 2 的区域杂交的引物更好。
本实施方式的引物与该引物杂交的 TYR mRNA 的特定区域， 不要求完全互补， 二者 只要具有可杂交的互补性即可 ( 这一点美国专利第 4800159 号公报上也有记述 )。即只 要是有引物功能的多聚核苷酸， 此引物也可以是在与上述特定区域完全互补的序列中导入 了一个或复数个即多个置换、 缺失、 插入、 附加等变异的多聚核苷酸。这种变异的多聚核苷 酸与未变异的多聚核苷酸相比， 以具有 80％以上的相同性为宜， 具有 90％以上的相同性更 好， 最好是具有 95％以上的相同性。
在 RT-LAMP 反应中， 引物与靶核酸 TYR mRNA 杂交后， 通过聚合酶的作用， 以引物 3’ 末端为起点进行核酸合成反应。为此， 引物的 3’ 末端部分与 TYRmRNA 的互补性越高， 核酸 合成反应越容易进行。所以， 本发明的引物最好 3’ 末端的 3 个核苷酸是与该引物杂交的区 域完全互补的多聚核苷酸， 如果 3’ 末端的 5 个核苷酸是完全互补的多聚核苷酸就更好了。
尤其当检测 TYR mRNA 时， 从提高特异性的角度看， 上述第二序列最好在 3 末’ 端含 有与上述第二区域的序列完全互补的连续 3 个核苷酸构成的序列， 含有与上述第二区域的 序列完全互补的连续 5 个核苷酸构成的序列更好。
各区域 F3、 F2、 F1、 R1c、 R2c、 R3c、 L 以及 M 设定在序列号 1 所示的 TYR mRNA 序列 中。以下列举这些区域的具体例子。
(F1)
第 795-817 位区域
第 1005-1024 位区域
第 1015-1036 位区域
第 1016-1040 位区域
第 1031-1054 位区域 (F2) 第 731-751 位区域 第 963-977 位区域 第 964-986 位区域 第 971-992 位区域 第 972-992 位区域 第 986-1008 位区域 (F3) 第 703-722 位区域 第 931-953 位区域 第 945-962 位区域 第 950-962 位区域 第 966-985 位区域 (R1c) 第 825-848 位区域 第 1026-1049 位区域 第 1041-1062 位区域 第 1044-1064 位区域 第 1044-1068 位区域 第 1057-1080 位区域 (R2c) 第 886-908 位区域 第 1110-1133 位区域 第 1114-1131 位区域 第 1114-1133 位区域 (R3c) 第 917-936 位区域 第 1135-1153 位区域 第 1138-1155 位区域 第 1138-1156 位区域 第 1141-1160 位区域 第 1142-1161 位区域 (L) 第 752-776 位区域 第 981-1004 位区域 第 982-1004 位区域 第 982-1006 位区域 第 986-1010 位区域第 987-1011 位区域 第 988-1011 位区域 第 988-1012 位区域 第 989-1011 位区域 第 989-1012 位区域 第 989-1013 位区域 第 990-1012 位区域 第 990-1013 位区域 第 990-1014 位区域 第 992-1015 位区域 第 993-1016 位区域 第 994-1016 位区域 第 995-1016 位区域 第 995-1018 位区域 第 996-1018 位区域 第 1000-1019 位区域 第 1001-1020 位区域 第 1003-1022 位区域 第 1004-1022 位区域 第 1005-1024 位区域 第 1006-1024 位区域 第 1008-1027 位区域 第 1009-1027 位区域 第 1009-1028 位区域 第 1010-1029 位区域 (M) 第 860-884 位区域 第 1063-1087 位区域 第 1065-1089 位区域 第 1066-1090 位区域 第 1067-1089 位区域 第 1067-1090 位区域 第 1068-1091 位区域 第 1068-1092 位区域 第 1069-1091 位区域 第 1069-1092 位区域 第 1069-1093 位区域 第 1070-1093 位区域 第 1070-1094 位区域第 1073-1097 位区域
第 1074-1098 位区域
第 1075-1099 位区域
第 1082-1104 位区域
第 1083-1105 位区域
第 1084-1105 位区域
第 1085-1107 位区域
(F3 引物 )
序列号 2 ： 5’ -AATGGAACGCCCGAGGGA-3’ ( 与第 950-967 位区域是相同的序列 )
序列号 3 ： 5’ -GACCTTTACGGCGTAATCCT-3’ ( 与第 966-985 位区域是相同的序列 )
序列号 4 ： 5’ -TATGCAATGGAACGCCCG-3’ ( 与第 945-962 位区域是相同的序列 )
序列号 5 ： 5’ -CAGCCATCAGTCTTTATGCAATG-3’ ( 与第 931-953 位区域是相同序列 )
序列号 6 ： 5’ -TCTGCCTTGGCATAGACTCT-3’ ( 与第 703-722 位区域是相同序列 )
(FIP)
序列号 7 ： 5’ -CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCTTACGGCGTAATCCTGGAAACC-3’ ( 连接第 1031-1054 位区域的互补序列和与第 971-992 位区域相同的序列的序列 )
序列号 8 ： 5’ -CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCGGAAACCATGACAAATCCAGAAC-3’ ( 连接第 1031-1054 位区域的互补序列和与第 986-1008 位区域相同的序列的序列 )
序列号 9 ： 5’ -TACATCAGCTGAAGAGGGGAGCAGGGACCTTTACGGC-3’ ( 连接第 1015-1036 位区域的互补序列和与第 963-977 位区域相同的序列的序列 )
序列号 10 ： 5’ -CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCTACGGCGTAATCCTGGAAACC-3’ ( 连接第 1031-1054 位区域的互补序列和与第 972-992 位区域相同的序列的序列 )
序列号 11 ： 5’ -AGAGGGGAGCCTTGGGGTTCAGGGACCTTTACGGC-3’ ( 连接第 1005-1024 位区域的互补序列和与第 963-977 位区域相同的序列的序列 )
序列号 12 ： 5’ -ATTCTACATCAGCTGAAGAGGGGAGGGGACCTTTACGGCGTAATCCTG-3’ ( 连接 第 1016-1040 位区域的互补序列和与第 964-986 位区域相同的序列的序列 )
序 列 号 13 ： 5’ -GTCACACTTTTCTGCATCCCGCCCGGTGGGAACAAGAAATCCAG-3’ ( 连接第 795-817 位区域的互补序列和与第 731-751 位区域相同的序列的序列 )
(RIP)
序列号 14 ： 5’ -CCAATATGAATCTGGTTCCATGGAGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3’ ( 连接与第 1057-1080 位区域相同的序列和第 1114-1133 位区域的互补序列的序列 )
序 列 号 15 ： 5’ -TTTGCCTGAGTTTGACCCAATAGGACTAGCAAATCCTTCC-3’ (连接与第 1041-1062 位区域相同的序列和第 1114-1131 位区域的互补序列的序列 )
序 列 号 16 ： 5’ -GCCTGAGTTTGACCCAATATGGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3’ ( 连接与第 1044-1064 位区域相同的序列和第 1114-1133 位区域的互补序列的序列 )
序列号 17 ： 5’ -CAGCTGATGTAGAATTTTGCCTGAGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3’ ( 连接与第 1026-1049 位区域相同的序列和第 1114-1133 位区域的互补序列的序列 )
序列号 18 ： 5’ -GCCTGAGTTTGACCCAATATGAATCGTGGACTAGCAAATCCTTCCAGTG-3’ (连 接与第 1044-1068 位区域相同的序列和 1110-1133 位区域的互补序列的序列 )序列号 19 ： 5’ -CAGATGAGTACATGGGAGGTCAGCAGACAATCTGCCAAGAGGAGAAG-3’ ( 连接 与第 825-848 位区域相同的序列和第 886-908 位区域的互补序列的序列 )
(R3 引物 )
序列号 20 ： 5’ -GAGGCATCCGCTATCCCA-3’ ( 第 1138-1155 位区域的互补序列 )
序列号 21 ： 5’ -TTTGAGAGGCATCCGCTATC-3’ ( 第 1141-1160 位区域的互补序列 )
序列号 22 ： 5’ -GGCATCCGCTATCCCAGTA-3’ ( 第 1135-1153 位区域的互补序列 )
序列号 23 ： 5’ -AGAGGCATCCGCTATCCCA-3’ ( 第 1138-1156 位区域的互补序列 )
序列号 24 ： 5’ -CTTTGAGAGGCATCCGCTAT-3’ ( 第 1142-1161 位区域的互补序列 )
序列号 25 ： 5’ -TGGCTGTTGTACTCCTCCAA-3’ ( 第 917-936 位区域的互补序列 )
( 环状引物 F)
序列号 26 ： 5’ -GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTCA-3’ ( 第 994-1016 位区域的互补序列 )
序列号 27 ： 5’ -CTGAAGAGGGGAGCCTTGGG-3’ ( 第 1009-1028 位区域的互补序列 )
序列号 28 ： 5’ -GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTCAT-3’ ( 第 993-1016 位区域的互补序列 )
序列号 29 ： 5’ -TGAAGAGGGGAGCCTTGGG-3’ ( 第 1009-1027 位区域的互补序列 )
序列号 30 ： 5’ -GGAGCCTTGGGGTTCTGGAT-3’ ( 第 1000-1019 位区域的互补序列 )
序列号 31 ： 5’ -GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTC-3’ ( 第 995-1016 位区域的互补序列 ) 序列号 32 ： 5’ -GGGTTCTGGATTTGTCATGGTTTCC-3’ ( 第 986-1010 位区域的互补序列 ) 序列号 33 ： 5’ -GGGAGCCTTGGGGTTCTGGA-3’ ( 第 1001-1020 位区域的互补序列 ) 序列号 34 ： 5’ -GAGCCTTGGGGTTCTGGATTTGT-3’ ( 第 996-1018 位区域的互补序列 ) 序列号 35 ： 5’ -GCTGAAGAGGGGAGCCTTGG-3’ ( 第 1010-1029 位区域的互补序列 ) 序列号 36 ： 5’ -TCTGGATTTGTCATGGTTTCCAGGA-3’ ( 第 982-1006 位区域的互补序列 ) 序列号 37 ： 5’ -GAGCCTTGGGGTTCTGGATTTGTC-3’ ( 第 995-1018 位区域的互补序列 ) 序列号 38 ： 5’ -TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3’ ( 第 989-1012 位区域的互补序列 ) 序列号 39 ： 5’ -GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTTC-3’ ( 第 987-1011 位区域的互补序列 ) 序列号 40 ： 5’ -TGAAGAGGGGAGCCTTGGGG-3’ ( 第 1008-1027 位区域的互补序列 ) 序列号 41 ： 5’ -CTTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3’ ( 第 990-1014 位区域的互补序列 ) 序列号 42 ： 5’ -TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3’ ( 第 990-1012 位区域的互补序列 ) 序列号 43 ： 5’ -AGGGGAGCCTTGGGGTTCT-3’ ( 第 1004-1022 位区域的互补序列 ) 序列号 44 ： 5’ -AGAGGGGAGCCTTGGGGTTC-3’ ( 第 1005-1024 位区域的互补序列 ) 序列号 45 ： 5’ -TTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3’ ( 第 990-1013 位区域的互补序列 ) 序列号 46 ： 5’ -AGAGGGGAGCCTTGGGGTT-3’ ( 第 1006-1024 位区域的互补序列 ) 序列号 47 ： 5’ -TGGATTTGTCATGGTTTCCAGGAT-3’ ( 第 981-1004 位区域的互补序列 ) 序列号 48 ： 5’ -TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTT-3’ ( 第 988-1012 位区域的互补序列 ) 序列号 49 ： 5’ -GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3’ ( 第 989-1011 位区域的互补序列 ) 序列号 50 ： 5’ -CCTTGGGGTTCTGGATTTGTCATG-3’ ( 第 992-1015 位区域的互补序列 ) 序列号 51 ： 5’ -TGGATTTGTCATGGTTTCCAGGA-3’ ( 第 982-1004 位区域的互补序列 ) 序列号 52 ： 5’ -GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTT-3’ ( 第 988-1011 位区域的互补序列 ) 序列号 53 ： 5’ -TTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3’ ( 第 989-1013 位区域的互补序列 ) 序列号 54 ： 5’ -AGGGGAGCCTTGGGGTTCTG-3’ ( 第 1003-1022 位区域的互补序列 )序列号 55 ： 5’ -TGAAGTTTTCATCTCCTGTCAGCTT-3’ ( 第 752-776 位区域的互补序列 )
( 环状引物 R)
序列号 56 ： 5’ -AAAGCTGCCAATTTCAGCTTTAG-3’ ( 与第 1082-1104 位区域相同的序列 )
序列号 57 ： 5’ -AGCTGCCAATTTCAGCTTTAGA-3’ ( 与第 1084-1105 位区域相同的序列 )
序列号 58 ： 5’ -GCTGCCAATTTCAGCTTTAGAAA-3’ ( 与第 1085-1107 位区域相同的序列 )
序列号 59 ： 5’ -AAGCTGCCAATTTCAGCTTTAGA-3’ ( 与第 1083-1105 位区域相同的序列 )
序列号 60 ： 5’ -ATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCC-3’ ( 与第 1066-1090 位区域相同的序列 )
序列号 61 ： 5’ -AATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGC-3’ ( 与第 1065-1089 位区域相同的序列 )
序列号 62 ： 5’ -CTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAA-3’ ( 与第 1068-1092 位区域相同的序列 )
序列号 63 ： 5’ -TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAA-3’ ( 与第 1069-1092 位区域相同的序列 )
序列号 64 ： 5’ -GGTTCCATGGATAAAGCTGCCAAT-3’ ( 与第 1070-1093 位区域相同的序列 )
序列号 65 ： 5’ -TCCATGGATAAAGCTGCCAATTTCA-3’ ( 与第 1073-1097 位区域相同的序列 )
序列号 66 ： 5’ -CTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCA-3’ ( 与第 1068-1091 位区域相同的序列 )
序列号 67 ： 5’ -TCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCC-3’ ( 与第 1067-1090 位区域相同的序列 )
序列号 68 ： 5’ -TGAATCTGGTTCCATGGATAAAGCT-3’ ( 与第 1063-1087 位区域相同的序列 )
序列号 69 ： 5’ -TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCA-3’ ( 与第 1069-1091 位区域相同的序列 )
序列号 70 ： 5’ -CATGGATAAAGCTGCCAATTTCAGC-3’ ( 与第 1075-1099 位区域相同的序列 )
序列号 71 ： 5’ -GGTTCCATGGATAAAGCTGCCAATT-3’ ( 与第 1070-1094 位区域相同的序列 )
序列号 72 ： 5’ -CCATGGATAAAGCTGCCAATTTCAG-3’ ( 与第 1074-1098 位区域相同的序列 )
序列号 73 ： 5’ -TCTGGTTCCATGGATAAAGCTGC-3’ ( 与第 1067-1089 位区域相同的序列 )
序列号 74 ： 5’ -TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAAT-3’ ( 与第 1069-1093 位区域相同的序列 )
序列号 75 ： 5’ -CCTAACTTACTCAGCCCAGCATCAT-3’ ( 与第 860-884 位区域相同的序列 )
上述引物中， 序列号 19 所示核苷酸序列构成的引物， 可与含有外显子连接点 1 的 区域杂交。
序列号 14-18 的引物， 可与含有外显子连接点 2 的区域杂交。
上述引物中， 可根据扩增区域适当组合 F3 引物、 FIP、 RIP 以及 R3 引物， 并将其作 为含有四种引物的引物对使用。也可以再加上环状引物 F 和 R 可以组成含有六种引物的引 物对使用。这种引物对的具体例示见以下表 1。
[ 表 1]
逆转录酶和链置换型 DNA 聚合酶可以使用众所周知的酶。也可以使用具有以 RNA 为模板合成 DNA 的作用和在进行链置换的同时以 DNA 为模板合成 DNA 的作用的一种酶取代 这二种酶 ( 逆转录酶和链置换型 DNA 聚合酶 )。
最好还使用为酶反应创造适宜条件的缓冲剂。
上述物质可以分别装在不同的容器中， 也可以将逆转录酶和链置换型 DNA 聚合酶 装在同一容器中。 dNTPs、 缓冲剂以及各种引物中， 可以将至少两种物质放在同一个容器中。 向用户提供这些试剂时， 也可以提供含有上述部分或全部试剂的试剂盒。
[TYR mRNA 的检测方法及 TYR mRNA 检测用试剂盒 ]
下面说明 TYR mRNA 的检测方法。本发明的 TYR mRNA 的检测方法可以通过以下二 种途径实现 ：
使用上述引物对、 RNA 依赖性 DNA 聚合酶及 DNA 依赖性 DNA 聚合酶 ( 以下称 “实施 方式 1 的检测方法” )； 或者
使用上述引物对、 以及具有以 RNA 为模板合成 DNA 作用和边进行链置换边以 DNA 为模板合成 DNA 作用的酶 ( 以下称 “实施方式 2 的检测方法” )。
上述实施方式 1 的检测方法包括以下步骤 ：
(I-1) 使试样、 上述引物对及 RNA 依赖性 DNA 聚合酶发生反应， 由上述试样中的酪 氨酸酶 mRNA 合成 cDNA ；
(II-1) 使上述引物对、 DNA 依赖性 DNA 聚合酶和在上述步骤 (I-1) 合成的 cDNA 发 生反应， 扩增 cDNA ；
(III-1) 通过检测在上述步骤 (II-1) 扩增的 cDNA， 检测上述试样中的酪氨酸酶 mRNA。
上述实施方式 2 的检测方法包括以下步骤 ：
(I-2) 使试样和上述引物对与具有以 RNA 为模板合成 DNA 作用和边进行链置换 边以 DNA 为模板合成 DNA 作用的酶发生反应， 以上述试样中的酪氨酸酶 mRNA 为模板合成 cDNA， 并以此 cDNA 为模板再合成该 cDNA， 进行扩增 ； 及
(II-2) 通过检测在上述步骤扩增的 cDNA， 检测上述试样中的酪氨酸酶 mRNA。
实施方式 1 和 2 的检测方法从高效、 准确、 快速地检测 TYR mRNA 的角度看， 最好使 用 RT-LAMP 法进行。
在上述实施方式 1 的检测方法中， 当使用 RT-LAMP 法时， 通过混合上述引物对、 RNA 依赖性 DNA 聚合酶 ( 以下称 “逆转录酶” )、 有链置换活性的 DNA 依赖性 DNA 聚合酶 ( 以下称 “链置换型 DNA 聚合酶” )、 dNTPs( 包括 dATP、 dGTP、 dTTP 及 dCTP) 及试样， 使其进行反应， 就 可检测出试样中的 TYR mRNA。因此， 此时上述步骤 (I-1) 及 (II-1) 可以一步进行。
另一方面， 在上述实施方式 2 的检测方法中， 如果使用 RT-LAMP 法， 则混合上述引 物对、 具有以 RNA 为模板合成 DNA 作用和边进行链置换边以 DNA 为模板合成 DNA 作用的酶、 dNTPs 及试样， 使其产生反应， 就可检测出试样中的 TYRmRNA。
逆转录酶和链置换型 DNA 聚合酶可以使用众所周知的酶。
另外， 实施方式 1 的检测方法的步骤 (I-1) 及 (II-1) 以及实施方式 2 的检测方法 的步骤 (I-2) 最好还使用为各步骤的酶反应创造适宜条件的缓冲剂。
用于 TYR mRNA 检测的试样如采自生物体的组织 ( 淋巴结、 淋巴液、 血液等 ) 和粪 便等。
在实施方式 1 的检测方法中， 在使用 RT-LAMP 法的情况下， 检测 TYR mRNA 要经过 扩增步骤 [ 上述步骤 (I-1) 及 (II-1)] 和检测步骤 [ 上述步骤 (III-1)]。
首先， 将含有从生物体采集的 TYR mRNA 的试样与上述引物对、 逆转录酶、 dNTPs 以 及链置换型 DNA 聚合酶混合在一起。再将所得混合物加热到一定温度 ( 例如 65℃ )， 进行 RT 反应和 LAMP 反应， 以 TYR mRNA 为模板合成 TYR cDNA， 同时以此 TYR cDNA 为模板再合成 该 TYR cDNA， 进行扩增 [ 上述步骤 (I-1) 及 (II-1)]。
RT 反应和 LAMP 反应的反应机理如下 ：
首先， RIP 的第二序列与反应液中 TYR mRNA 的 R2c 区域杂交。然后， 通过逆转录 酶， 从该 RIP 的 3’ 末端开始， 以 TYR mRNA 为模板合成 TYR cDNA 。通过这一反应， 合成由 TYR mRNA 与从该 RIP 延长出的 TYR cDNA(RIP 延长链 ) 组成的双链核酸。
接着， R3 引物与 TYR mRNA 的 R3c 区域杂交。由于链置换型 DNA 聚合酶的作用， 从 该 R3 引物的 3’ 末端开始， 以 TYR mRNA 为模板， 剥离 ( 置换 ) 已与 TYRmRNA 结合的上述 RIP 延长链， 同时合成 TYR cDNA。
上述 RIP 延长链为单链状态， 具有与 TYR mRNA 互补的序列， 因此， 该 RIP 延长链中包含与 TYR mRNA 的 F2 区域互补的 F2c 区域。FIP 的第四序列与此 RIP 延长链的 F2c 区域 杂交。
然后， 由于链置换型 DNA 聚合酶的作用， 以上述 RIP 延长链为模板从 FIP 的 3’ 末 端开始合成 DNA。在此合成的 DNA 因为在其 5’ 末端有第三序列 ( 与 F1 区域杂交的多聚核 苷酸序列 )， 该第三序列构成的多聚核苷酸与此 DNA 上的 F1 区域杂交， 形成茎环结构。此 DNA 在 3’ 末端有第一序列的互补序列 ( 与 R1c 区域杂交的序列 )， 该第一序列的互补序列 与此 DNA 上的 R1c 区域杂交， 形成茎环结构。因此， 此 DNA 形成在 5’ 末端以及 3’ 末端两端 有茎环结构的哑铃结构。
上述哑铃结构的 DNA( 哑铃 DNA) 以该哑铃 DNA 中的其他部分为模板， 从其 3’ 末端 开始， 在解开 5’ 末端茎环结构的同时， 通过链置换型 DNA 聚合酶进行延长， 获得延长链。这 个延伸链在其 5’ 末端、 3’ 末端以及它们的中间部分分别具有相互互补的序列， 因此， 在该延 长链中形成了三个茎环结构。而且， 该延长链从其 3’ 末端开始， 以该延长链的其他部分为 模板， 一边解开上述茎环结构， 一边通过链置换型 DNA 聚合酶的作用进行延长。通过这个反 应实际上在恒温下反复进行， 合成分子中含有多个特定序列的核酸 ( 该反应的具体内容参 阅美国专利第 6410278 号公报以及美国专利第 6974670 号公报 )。
如此获得的扩增产物中的核酸大部分为 dsDNA( 双链 DNA)， 因此在检测步骤 [ 上 述步骤 (III-1)] 中， 可将这些扩增产物用像溴化乙锭、 SYBR( 注册商标 )GREEN 1、 Pico Green( 注册商标 ) 等荧光嵌入剂进行荧光染色后， 照射紫外线使其产生荧光， 来检测该扩 增产物。
荧光染色也可通过在扩增反应后 [ 上述步骤 (II-1) 后 ] 的反应液中添加荧光色 素来实施， 也可以预先在上述反应液中添加荧光色素， 在有荧光色素存在的情况下进行核 酸扩增。 在检测步骤 [ 上述步骤 (III-1)]， 可通过是否检测出荧光来判断试样中是否有 TYR mRNA。另外， 还可以通过测定扩增反应后 [ 上述步骤 (II-1) 后 ] 的反应液的荧光强度来对 扩增产物进行定量， 也可以此定量结果为基础， 对试样中含有的 TYR mRNA 进行定量。特别 是在荧光色素存在的情况下进行核酸扩增时， 通过实时测定反应液中荧光强度的增大， 以 及测定达到一定荧光强度所需的时间， 可以换算出试样中的 TYR mRNA 含量 ( 实时 RT-PCR 法、 实时 RT-LAMP 法等 )。
此外， 在上述步骤 (II-1) 中的 LAMP 反应中， 会生成不溶于水的副产物焦磷酸镁。 该焦磷酸镁随着核酸扩增的进行而增多， 反应液随着焦磷酸镁的增多而变得白浊。 为此， 可 以通过 i) 目视判断反应液的浊度 ； ii) 测定反应液的吸光度及散射光强度来测定其浊度 ； 或 iii) 使用有色过滤器过滤反应液， 确认过滤器上的残渣， 检测出靶核酸 ( 参照国际公开 第 01/83817 号 )。当通过测定反应液的吸光度或散射光强度来测定浊度时， 和上述使用荧 光色素时一样， 可通过实时监测浊度的变化， 在封闭系统中追踪 DNA 扩增以及浊度的增加 情况。因此， 在检测步骤 [ 上述步骤 (III-1)] 中， 可根据反应液是否白浊化， 判断试样中是 否存在 TYR mRNA。 此外， 通过测定扩增产物的浊度， 可以对该扩增产物定量， 根据定量结果， 还可以对试样中含有的 TYR mRNA 进行定量。在实时测定浊度增加的时候， 也可以测定到 达一定浊度所需要的时间 ( 以下， 称为 “扩增上升时间” )， 再将该时间换算成试样中的 TYR mRNA 含量。
另一方面， 在实施方式 2 的检测方法中， 步骤 (I-2) 是对应于上述实施方式 1 的检测方法中的扩增步骤 [ 上述步骤 (I-1) 和 (II-1)] 的扩增步骤。此步骤 (I-2) 除用一种既 能以 RNA 为模板合成 DNA 又可在进行链置换的同时以 DNA 为模板合成 DNA 的酶取代上述步 骤 (I-1) 和 (II-1) 中的两种酶 ( 逆转录酶和链置换 DNA 聚合酶 ) 外， 其他均可与上述步骤 (I-1) 和 (II-1) 相同。
在实施方式 2 的检测方法中， 步骤 (II-2) 可与上述实施方式 1 的检测方法中的检 测步骤 [ 上述步骤 (III-1)] 相同。
本发明可提供 mRNA 检测用试剂盒作为上述步骤 (I-1)、 步骤 (II-1) 和步骤 (I-2) 使用的试剂。该 mRNA 检测用试剂盒包括上述引物对、 dNTPs 及兼具以 RNA 为模板合成 DNA 功能和在进行链置换同时以 DNA 为模板合成 DNA 功能的酶或 RNA 依赖性 DNA 聚合酶和 DNA 依赖性 DNA 聚合酶。
上述各试剂可以分别装于不同的容器中。逆转录酶和链置换型 DNA 聚合酶也可以 装于同一容器中。也可以将 dNTPs、 缓冲剂和各种引物中的至少二种试剂装于同一容器中。
下面举实施例详细说明本发明。不过， 本发明不限于这些实施例。
( 实施例 1)
如下验证使用表 1 中列出的引物对 1-45 能否检测出 TYR mRNA。
(1) 制备试样
用无核糖核酸酶 (RNase-free) 的超纯水对 5×1010 拷贝 /μL 的 TYR mRNA 进行阶 段性稀释， 制备出 2.5×103 拷贝 /μL 的 TYR mRNA。
(2) 制备反应液
将表 1 所示 F3 引物、 FIP、 RIP 以及 R3 引物按如下配比加入缓冲液 [10mM 三羟甲 基氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCI)(pH8.0)]， 制备混合引物 ( 引物 MIX)。
16μM FIP
16μM RIP
1μM F3 引物
1μM R3 引物
12μM 环状引物 F
12μM 环状引物 R
10mM Tris-HCI(pH8.0)
混合各种试剂， 制备出如下配比的 RT-LAMP 反应用缓冲液。
53m MTris-HCI(pH8.8)
1.8×Thermopol 缓冲液 (New England Biolabs 制 )
1.43mM dNTPs(Invitrogen 公司制 )
5.36mM MgSO4(NACALAI TESQUE( 株 ) 制 )
8.93mM DTT( 和光纯药 ( 株 ) 制 )
2 体积％ Tergitol(Sigma 制 )
混合各种试剂， 制备出配比如下的酶溶液 (3.04μL)。
10U/μL AMV 逆转录酶 (Promega 制 ) 0.14μL
8U/μL Bst DNA 聚合酶 (New England Biolabs 制 ) 2.27μL
40U/μL Rnase 抑制剂 (Promega 制 ) 0.63μL混合各试剂， 制备 25μL 如下配比的反应液。反应液分别针对 45 种引物对制备。
RT-LAMP 反应用缓冲液 14.0μL
酶溶液 3.0μL
混合引物 5.0μL
10mM Tris-HCI(pH8.0) 1.0μL
RNA 试样 2.0μL
此外， 作为与 45 种反应液分别对应的阴性对照 (NC)， 还添加 2.0μL 超纯水取代 2.0μL RNA 试样， 制备了 NC 用反应液 (45 种 )。
(3) 检测及检测结果
将装有含 45 种引物对中某一种的反应液的试管放置到预先加温至 65℃的浊度实 时测定装置 (TERAMECS 公司制， 商品名 ： LA-200) 中。然后， 在 65℃温度下， 培养上述试管 中的反应液， 进行 LAMP 反应。测定从反应开始到反应液浊度达到 0.1 时所需的时间。阴性 对照测定进行一次， 含 RNA 试样的反应液测定进行 3 次 (n ＝ 3)。阴性对照测定结果和含 RNA 试样反应液测定结果的平均值见表 2。表中， “NC” 表示阴性对照时的测定结果。表中 的 “-( 连字符 )” 表示在 60 分钟以内浊度未达到 0.1。
[ 表 2]
从表 2 所示结果可以看出， 阴性对照时， 60 分钟内未发生非特异性核酸扩增， 未能 检测到 TYR mRNA 的存在。然而， 含 RNA 试样的反应液中， 在 60 分钟内反应液的浊度达到 0.1， 故使用本发明一实施方式涉及的引物对 1-45 种中的任意一种， 都能快速检测出 TYR mRNA。23102046789 A CN 102046793
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