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1、(10)授权公告号 CN 101880695 B (45)授权公告日 2014.01.22 CN 101880695 B (21)申请号 201010114462.8 (22)申请日 2010.02.26 C12P 7/40(2006.01) C12P 41/00(2006.01) (73)专利权人 华东理工大学 地址 200237 上海市徐汇区梅陇路 130 号 (72)发明人 许建和 刘想 潘江 赵晶 (74)专利代理机构 上海智信专利代理有限公司 31002 代理人 薛琦 钟华 CN 1131196 C,2003.12.17, 全文 . CN 1584037 A,2005.02.23, 。
2、全文 . 崔玉敏 魏东芝 周文瑜 俞俊棠 . 酶促萘普生酯的选择性水解拆分 . 华东理 工大学学报 .2001, 第 27 卷 ( 第 2 期 ),121-123. (54) 发明名称 一种酶拆分外消旋萘普生酯制备 (S)- 萘普 生的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种酶拆分外消旋萘普生酯 制备 (S)- 萘普生的方法， 包括在水相介质中利 用酯酶或脂肪酶拆分外消旋萘普生酯水解形成 (S)- 萘普生， 其中， 所述的外消旋萘普生酯经机 械破碎分散于水相介质中形成悬浮浆液后， 再加 入酯酶或脂肪酶进行水解反应。本发明还利用醇 钠作为碱催化剂对 (R)- 萘普生酯进行消旋， 降低 了生产成本，。
3、 提高了反应收率。本发明实现了萘 普生酯在单一水相反应介质中的有效分散， 使反 应底物浓度大大提高， 反应速度加快， 反应收率提 高， (S)- 萘普生综合收率可达 86， 光学纯度可 达 97以上。本发明工艺方法简便， 可以不使用 有机溶剂或者表面活性剂， 环境污染小。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 彭郁葱 权利要求书 1 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书7页 (10)授权公告号 CN 101880695 B CN 101880695 B 1/1 页 2 1. 一种酶拆分外消旋萘普生酯制备 (S)- 萘普生。
4、的方法， 包括在单一水相介质中利用 酯酶拆分外消旋萘普生酯水解形成 (S)- 萘普生， 其特征在于， 所述的外消旋萘普生酯经机 械破碎分散于单一水相介质中形成悬浮浆液后， 再加入酯酶进行水解反应， 将反应液过滤 分离出滤液和滤饼， 在搅拌状态下调节滤液 pH 至 1 2， 所述反应时间为 1 10 小时， 有 沉淀析出， 即 (S)- 萘普生， 所述的酯酶是重组枯草芽孢杆菌羧酯酶， 其基因序列如序列表 中SEQ ID NO.1所示， 所述的萘普生酯是萘普生甲酯， 所述的单一水相介质是水或者缓冲溶 液， 所述的机械破碎是高压匀浆法或高速捣碎匀浆法。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于。
5、， 所述的滤饼即是 (R)- 萘普生酯， 将 (R)- 萘 普生酯进行消旋化， 得消旋的萘普生酯。 3. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 所述的消旋的萘普生酯与新鲜萘普生酯混 合重新用于酶促拆分反应。 4. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 所述的将 (R)- 萘普生酯进行消旋化包括将 (R)- 萘普生酯溶解于醇溶剂中， 加入强碱醇钠作为催化剂， 在加热条件下进行碱催化消旋 即得消旋的萘普生酯。 5. 如权利要求 4 所述的方法， 其特征在于， 所述的醇钠是甲醇钠， 所述的醇溶剂是甲 醇。 6. 如权利要求 4 所述的方法， 其特征在于， 加热条件是加热至 60 80进行。
6、回流反 应。 权 利 要 求 书 CN 101880695 B 2 1/7 页 3 一种酶拆分外消旋萘普生酯制备 (S)- 萘普生的方法 技术领域 0001 本发明属于生物化工领域， 特别涉及一种酶拆分外消旋萘普生酯制备 (S)- 萘普 生的方法。 背景技术 0002 萘普生是一种重要的 2- 芳基丙酸类非甾体抗炎药， 在医药行业中有着十分广泛 的应用。(S)- 萘普生的消炎活性是 (R)- 萘普生的 28 倍 ； 为了提高药效， 降低 (R)- 萘普生 的毒副作用， 扩大用药安全范围， 有必要制备光学纯的单一对映体 (S)- 萘普生。 0003 单一构型的 (S)- 萘普生可以通过化学拆分、。
7、 酶催化不对称合成或者酶法拆分等 方法获得。从产品得率、 分离难易以及光学纯度等角度考虑， 酯酶催化的外消旋萘普生酯 的对映选择性水解已成为制备高光学纯度 (S)- 萘普生的首选方法。目前已经有很多酯酶 / 脂肪酶应用于萘普生酯的水解拆分， 包括柱状假丝酵母脂肪酶、 枯草芽胞杆菌酯酶以及沙 雷氏菌脂肪酶等。 0004 萘普生酯的水溶性较差， 研究人员采用了很多方法提高萘普生酯的溶解度， 促进 其在反应介质中的分散， 包括采用非水相反应体系以及使用表面活性剂。辛嘉英等使用柱 状假丝酵母脂肪酶， 在非水介质中催化萘普生甲酯的水解拆分， 反应分别在水饱和有机溶 剂 ( 中国 ZL 99126583.。
8、1)、 水 - 异辛烷两相体系 ( 中国 ZL 00133042.X) 以及水 - 离子液 两相体系 ( 中国 ZL 03152790.6) 中进行。非水相体系的应用在一定程度上提高了底物的 溶解度， 尽管如此， 在上述体系中， 萘普生甲酯的最高浓度仅 15g/L， 并且有机溶剂或非离子 液等非水溶剂的采用， 不仅增加了反应体系的复杂性， 而且面临着有机溶剂挥发、 易燃， 非 水介质对环境的污染以及反应体系乳化、 反应物分离困难等问题。 Steenkamp 等采用来自 DSM 公司的枯草芽孢杆菌羧酯酶 (carboxylesterase NP) 催化萘普生甲酯的立体选择性水 解 Process。
9、 Biochem.， 2008， 43 ： 1419-1426， 反应在磷酸盐缓冲液中进行， 研究人员在反 应体系中加入表面活性剂吐温 80 以促进底物萘普生甲酯的分散。与非水相体系相比， 在水 相反应体系中加入添加剂的方法简便易行， 并且表面活性剂的加入有效地提高了反应底物 的浓度或分散度， 尽管如此， 表面活性剂的使用增加了后续产物分离的难度， 并且对产品有 较大的污染。针对上述问题， 有必要开发一种新的方法， 既能促进底物固体萘普生酯的分 散， 从而提高底物浓度， 又简便易行， 不产生新的污染。 0005 在萘普生酯的对映选择性水解拆分路线中， (S)- 萘普生酯被立体选择性水解生 成 。
10、(S)- 萘普生， 留下较低光学纯度的未水解的 (R)- 萘普生酯。为提高产品得率， 必须对 (R)- 萘普生酯进行消旋化处理， 生成消旋的萘普生酯， 以便重新作为酶促水解的底物循环 使用。将未反应的 (R)- 萘普生酯溶解于含有氢氧化钠、 氢氧化钾等强碱的醇溶剂中， 在加 热条件下进行碱催化消旋是芳基丙酸酯消旋化常用的方法。此外， 也有文献报道选择二氮 杂环 5.4.0 十一碳 -7- 烯 (DBU) 等有机碱作为消旋化试剂， 在加热条件下进行消旋。这 些碱类化合物都能实现萘普生酯的消旋， 但是都存在着缺陷。使用氢氧化物进行消旋容易 导致萘普生酯的水解， 而 DBU 等有机碱价格较昂贵， 而。
11、且其使用会造成反应产物的污染。因 说 明 书 CN 101880695 B 3 2/7 页 4 此有必要选择一种更有效的廉价碱催化剂进行 (R)- 萘普生甲酯的消旋化。 发明内容 0006 因此， 本发明要解决的技术问题就是针对现有的酶法拆分外消旋萘普生酯制备 (S)- 萘普生的方法存在萘普生酯在单一水相反应介质中溶解性差， 减慢了酶促反应的速 度， 需要引入非水相反应体系或外加添加剂， 从而导致环境污染和反应物分离困难的缺陷， 提供一种萘普生酯酶法拆分制备 (S)- 萘普 生的的新方法， 其能够促进底物萘普生酯在单 一水相反应介质中的分散， 从而提高底物浓度， 提高反应效率， 又简便易行， 。
12、不产生新的污 染。本发明还针对 (R)- 萘普生酯的消旋方法中使用导致萘普生酯水解的氢氧化物强碱或 者价格昂贵的DBU等有机碱作为消旋催化剂的不足， 提供一种新的(R)-萘普生酯的消旋方 法， 其使用的消旋催化剂价格便宜而且不会引起萘普生酯的水解。 0007 本发明人经过广泛的研究和反复的试验发现， 萘普生酯在水中溶解性差， 从而在 单一水相介质中萘普生酯分散性差， 水相介质中浓度很低， 与酶接触面积小， 从而导致产生 反应速率慢的问题， 因此， 本发明人特别的采用机械破碎的方法， 将萘普生酯分散于水相反 应介质中， 形成悬浮浆液， 从而极大地增加了萘普生酯颗粒的表面积， 有效地提高了酶促反 。
13、应的速率， 即使不借助非水溶剂或者表面活性剂等添加剂即可实现高浓度萘普生酯的高效 酶促转化。本发明人还发现， 选择醇钠作为碱催化剂， 在 (R)- 萘普生酯的醇溶液中， 加入醇 钠， 加热回流， 即可进行萘普生酯的消旋。醇钠价廉、 用量少， 对产品无污染， 而且在消旋反 应条件下萘普生酯不会发生自发水解， 从而完成了本发明。 0008 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是 ： 一种酶拆分外消旋萘普生酯 制备 (S)- 萘普生的方法， 包括在水相介质中利用酯酶或脂肪酶拆分外消旋萘普生酯水解 形成 (S)- 萘普生， 其中， 所述的外消旋萘普生酯经机械破碎分散于水相介质中形成悬浮浆 液后，。
14、 再加入酯酶或脂肪酶进行水解反应。 0009 根据本发明， 所述的机械破碎较佳的是匀浆， 所述匀浆优选高压匀浆法或者高速 捣碎匀浆法。所述的高压匀浆或者高速匀浆都是本领域常规技术， 可利用高压匀浆机或高 速匀浆机进行， 一般较佳的高压匀浆采用2001000bar的压力， 高速匀浆采用10,000rpm， 1 20 分钟。 0010 所述的水相介质可以是现有技术的任何水相介质， 优选水或者缓冲溶 液。 所述的 缓冲溶液可以是常规的缓冲对水溶液， 较佳的选自磷酸盐、 Tris-HCl、 硼酸盐缓冲溶液。所 述的水相介质中较佳的不包括表面活性剂。 0011 所述的酯酶或脂肪酶可以是现有技术， 包括能。
15、够酶法拆分外消旋萘普生酯水解形 成 (S)- 萘普生的任何酯酶或脂肪酶。所述的酯酶较佳的是羧酯酶， 更佳的如枯草芽孢杆菌 羧酯酶， 更优选重组枯草芽孢杆菌羧酯酶， 如其基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示的枯 草芽孢杆菌羧酯酶， 其是来源于枯草芽胞杆菌 Bacillus subtilis CGMCC 2548 的羧酯酶， 已经在 GENBANK 中注册， 注册号为 GQ868652。 0012 所述的萘普生酯可以是现有技术中的任何萘普生酯， 最常用的是萘普生甲酯， 为 本发明优选。萘普生酯作为底物， 其浓度较佳的为 1 100g/L。 0013 根据本发明， 所述的酶拆分反应的反应温度。
16、、 反应时间、 反应液 pH 值都同现有技 术， 较佳的， 反应温度为2050， 更优选2535， 反应液的pH为610， 更优选pH7 说 明 书 CN 101880695 B 4 3/7 页 5 9， 反应过程中连续补加碱液以维持反应液的 pH 恒定不变， 反应时间为 1 10 小时。 0014 所述的酯酶或脂肪酶的加入量也同现有技术， 较佳的以外消旋萘普生酯的重量为 基准为 1 100U/g 底物， 最适用量为 5 10U/g 底物。 0015 根据本发明， 酶拆分反应终止后， 可以按照常规方法将反应液过滤分离出滤液和 滤饼。水解生成的 (S)- 萘普生以盐的形式溶解于滤液中， 而未反应。
17、的 (R)- 萘普生酯则被 截留在滤布上， 实现 (R)- 和 (S)- 萘普生的拆分。其中， 含有 (S)- 萘普生盐的滤液可以按 照常规方法， 从中分离得到 (S)- 萘普生。如在搅拌状态下， 可通过向滤液中加入硫酸或盐 酸， 调节滤液 pH 至 1 2， 滤液中的 (S)- 萘普生以沉淀的形式析出， 经过滤分离、 精制即可 得到目标产品 (S)- 萘普生。而 (R)- 萘普生酯可以按照常规的方法进行消旋化， 也可以按 照本发明的方法进行消旋化， 本发明的方法见下文所述。消旋化的萘普生酯即可进一步作 为酶促拆分制备 (S)- 萘普生的低物。本发明较佳的选择将消旋化的萘普生酯与新鲜萘普 生酯。
18、混合重新用于酶促拆分反应， 反复套用， 从而减少产 品的物料消耗， 提高生产效率， 获 得更高的经济效益和环境效益。 0016 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是 ： 一种 (R)- 萘普生的消旋方 法， 包括将 (R)- 萘普生酯溶解于醇溶剂中， 加入强碱作为催化剂， 在加热条件下进行碱催 化消旋即得， 其中， 所述的强碱是醇钠。 0017 根据本发明， 所述的醇钠可以是任何有机醇钠， 如甲醇钠、 乙醇钠等， 优选甲醇钠。 所述的醇钠的浓度较佳的为 1 20g/L， 更佳的为 5 10g/L。所述的醇溶剂可以是任何有 机醇， 如甲醇、 乙醇等， 优选甲醇。所述的加热条件是常规条件，。
19、 较佳的是加热至 60 80 进行回流反应。所述的回流较佳的进行 0.5 4 小时， 更佳的进行 2 小时。 0018 本发明中， 上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合， 即得本发明各 较佳实例。 0019 本发明的一较佳实施例为 ： 一种从外消旋萘普生酯酶法拆分制备 S- 萘普生的方 法， 包括以下步骤 ： 0020 (1) 外消旋萘普生酯经机械破碎分散于水或者缓冲液中形成悬浮浆液 ； 0021 (2) 加入羧酯酶进行酶拆分反应 ； 0022 (3) 酶拆分反应终止后， 将反应液过滤分离出滤液和滤饼 ； 0023 (4)在搅拌状态下， 调节滤液pH至12， 滤液中析出沉淀， 过滤分。
20、离， 即得(S)-萘 普生 ； 0024 (5) 滤饼溶解于醇溶剂中， 加入醇钠， 加热回流， 即得外消旋萘普生酯 ； 0025 (6) 步骤 (5) 所得的外消旋的萘普生酯与新鲜萘普生酯混合重新用于酶促拆分反 应。 0026 本发明所用的原料或试剂除特别说明之外， 均市售可得。 0027 相比于现有技术， 本发明的有益效果如下 ： 本发明实现了底物萘普生酯在单一水 相反应介质中的有效分散， 使酶法拆分外消旋萘普生酯制备 (S)- 萘普生的反应速度加快， 底物浓度高， 反应收率高， (S)- 萘普生总收率高， 综 合收率可达 86， 化学纯度及光学纯 度均高， 光学纯度可达97以上。 并且本发。
21、明工艺方法简便， 可以不使用有机溶剂或者表面 活性剂， 环境污染很小。 反应体系简单， 反应产物容易分离， 生产成本低， 适合在现有化学法 (S)- 萘普生生产企业中推广应用。 说 明 书 CN 101880695 B 5 4/7 页 6 具体实施方式 0028 下面用实施例来进一步说明本发明， 但本发明并不受其限制。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 0029 实施例 1 羧酯酶 BsE-NP01 的制备 0030 设计引物 ： 0031 引物 1 ： 5 -TTCCATATGTCAAACCATTCATCTAGTATTCCCG-3 ； 。
22、0032 引物 2 ： 5 -GGATCCTTACCGTGAAATGCCTGTTTCTGCATTG-3 。 0033 以提取的枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis CGMCC 2548基因组DNA为模板， 用上 述引物进行 PCR 扩增， 所得 PCR 产物连接到质粒 pMD 18-T( 购自 Takara 公司 ) 上， 转化到 大肠杆菌 DH 5 中， 筛选阳性克隆。对阳性克隆质粒进行核苷酸测序， 其中插入的重组片 段的羧酯酶 BsE-NP01 基因的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO.1 所示， 该 DNA 序列已经在 GENBANK中注册， 注册号为GQ868652。 。
23、使用限制性内切核苷酸酶NdeI和BamHI(购自Takara 公司 ) 分别对如上获得的重组质粒以及质粒 pET-11a( 购自 Takara 公司 ) 进行酶切、 连接， 并转化到大肠杆菌 BL21 中， 筛选阳性克隆。对阳性克隆质粒核苷酸测序， 证明目标羧酯酶 BsE-NP01 的基因 DNA 片段已经正确插入载体 pET-11a 中。 0034 将重组大肠杆菌 BL21 接种到液体培养基中进行目标酯酶的高效表达。在 5L 体积 的搅拌发酵罐中， 加入 3L 的 LB 培养基 ( 蛋白胨 10g/L， 酵母膏 5g/L， 氯化钠 5g/L)， 高压灭 菌后按 2的比例接入在 LB 培养基中。
24、预培养的 种子液， 在 37， 培养至对数生长中期后， 加入0.1mmol/L的诱导物异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)， 于接种9h后离心收集菌体， 经高压匀浆破碎后， 离心收集含酶的上清液， 作为酯酶粗酶液直接用于萘普生甲酯的酶促 水解拆分。 0035 枯草芽胞杆菌羧酯酶 BsE-NP01 的酶活单位 (U) 定义为 ： 将 100l 粗酶液加到 2.87ml 磷酸钾缓冲液 (100mM， pH 7.0) 中， 在 30保温 3min 之后， 加入 30l100mM 的对硝 基苯酚丁酸酯的二甲基亚砜溶液， 混匀后利用分光光度计， 跟踪 405nm 下吸光值的变化， 计 算对硝基苯酚丁酸酯。
25、酶促水解反应的转化速率。1 个羧酯酶活力单位 (U) 定义为 ： 在上述 反应条件下， 每分钟催化对硝基苯酚丁酸酯水解生成 1.0mol 对硝基苯酚所需的酶量。 0036 实施例 2 0037 将 80g 消旋萘普生甲酯与 500ml 自来水混合， 置于高速捣碎匀浆机 JJ-2( 上海浦 东物理光学仪器厂金坛实验仪器分厂 ) 中， 高速匀浆 (10,000rpm、 20min) 捣碎。将所得外 消旋萘普生甲酯的悬浮浆液加置于 2-L 玻璃反应釜中， 加入实施例 1 中得到的羧酯酶粗酶 600U， 加自来水补足至总体积 2.0L， 恒温于 28反应， 搅拌转速为 300rpm， 通过自动流加浓 。
26、氨水将反应液 pH 恒定于 7.5， 5 小时后终止反应， 此时转化率约 36。 0038 反应终止后， 将反应混合物抽滤， 滤饼为未参与反应的 (R)- 萘普生甲酯， 滤液中 含有 (S)- 萘普生的铵盐。在滤液中小心加入少量 50 (w/v) 的浓硫酸调节 pH 至 1 2， 析出 (S)- 萘普生沉淀， 经抽滤、 水洗和干燥， 获得 24.0g 目标产品 (S)- 萘普生， 纯度高于 99， ee 值为 96.2。 0039 实施例 3 0040 将实施例 2 中收集的 (R)- 萘普生甲酯滤饼烘干， 约 50g， 加入 100ml 甲醇和 0.6g 说 明 书 CN 101880695。
27、 B 6 5/7 页 7 甲醇钠， 加热至回流， 持续回流反应 2h， 冷却后抽滤， 获得消旋萘普生甲酯 46.5g。获得的消 旋萘普生甲酯可直接与新鲜底物混合， 匀浆后用于下一批酶促水解反应。 0041 实施例 4 0042 将 80g 消旋萘普生甲酯匀浆所得的悬浮液置于 2-L 玻璃反应釜中， 按实施例 2 中 描述的方法， 酶促反应并分离后获得 (S)- 萘普生和 (R)- 萘普生甲酯。未反应的 (R)- 萘普 生甲酯按实施例 3 中描述的方法进行消旋化后与新合成的 (R， S)- 萘普生甲酯混合套用。 每轮反应中补加新鲜的消旋萘普生甲酯至总重量 80g， 然后再次按实施例 2 中描述的。
28、方法， 进行酶促拆分反应。如此重复反应 10 批， 重复反应的结果见表 1。总体而言， (S)- 萘普生 的综合收率达 86， 光学纯度可达 97 ee， 再经一次结晶精制后即满足制药的要求。 0043 表 1 (S)- 萘普生的重复拆分结果 0044 0045 实施例 5 0046 使用高速捣碎匀浆法制备萘普生甲酯的悬浮浆液。 将5g消旋萘普生甲酯与100ml 水混合， 置于高速捣碎匀浆机 JJ-2( 上海浦东物理光学仪器厂金坛实验仪器分厂 ) 中， 10,000rpm 高速捣碎匀浆， 处理 20min 后， 取 20ml 消旋萘普生甲酯的悬浮浆液置于 250ml 三口烧瓶中， 加入 80m。
29、l 磷酸钾缓冲 液 (100mM， pH 7.0)， 分别加入柱状假丝酵母脂肪酶 CRL( 购自 Sigma 公司 )、 皱褶假丝酵母脂肪酶 Lipase OF( 购自 Meito Sangyo 公司 ) 以及 实施例 1 中得到的羧酯酶粗酶各 30U( 活力测定方法同实施例 1)， 在恒温震荡摇床上反应， 反应温度为 28， 震荡频率为 200rpm， 反应 0.5 小时后终止反应， 反应结果见表 2。 0047 表 2 不同酯酶 / 脂肪酶催化外消旋萘普生甲酯水解的转化率 0048 酯酶 / 脂肪酶 转化率 ( ) 0049 Lipase OF 2.3 说 明 书 CN 101880695。
30、 B 7 6/7 页 8 0050 CRL 10.2 0051 BsE-NP01 17.8 0052 实施例 6 0053 使用高压匀浆法制备萘普生甲酯的悬浮浆液。 分别将4g消旋萘普生甲酯与100ml 水混合， 用高压匀浆机 AH110B(ATS 工业系统有限公司 ) 在不同压力下进行高压匀浆， 将生 成的消旋萘普生甲酯的悬浮浆液置于 250ml 三口烧瓶中， 加入实施例 1 中得到的羧酯酶粗 酶 30U， 加入少量硼酸钠调节初始 pH 为 7.5。恒温于 28反应， 搅拌转速为 300rpm， 通过自 动流加浓氨水将反应液 pH 恒定于 7.5， 5 小时后终止反应， 反应结果见表 3。 。
31、0054 表 3 高压匀浆对酶法水解外消旋萘普生甲酯转化率的影响 0055 消旋萘普生甲酯高压匀浆处理压力 (bar) 转化率 ( ) 0056 0 10.2 0057 200 18.7 0058 500 39.3 0059 800 48.8 0060 1000 51.8 0061 实施例 7 0062 使用高速捣碎匀浆法制备萘普生甲酯的悬浮浆液。将 20g 消旋萘普生甲酯与 500ml 水混合， 置于高速捣碎匀浆机 JJ-2( 上海浦东物理光学仪器厂金坛实验仪器分厂 ) 中， 10,000rpm 高速捣碎匀浆， 处理不同时间后， 取 100ml 消旋萘普生甲酯的悬浮浆液置于 250ml三口烧。
32、瓶中， 加入实施例1中得到的羧酯酶粗酶30U， 加入1ml Tris-HCl缓冲液(2M， pH 7.5)， 恒温于 28反应， 搅拌转速为 300rpm， 通过自动流加浓氨水将反应液 pH 恒定于 7.5， 5 小时后终止反应， 反应结果见表 4。 0063 表 4 高速匀浆捣碎对酶法水解外消旋萘普生甲酯转化率的影响 0064 萘普生甲酯高速捣碎匀浆处理时间 (min) 反应转化率 ( ) 0065 0 10.2 0066 1 15.7 0067 5 30.9 0068 10 35.5 0069 15 38.7 0070 20 39.8 0071 0080 序列表 0072 华东理工大学 0。
33、073 一种酶拆分外消旋萘普生酯制备 (S)- 萘普生的方法 0074 P4-101121C 0075 1 0076 PatentIn version 3.4 0077 1 0078 903 0079 DNA 说 明 书 CN 101880695 B 8 7/7 页 9 0080 Bacillus subtilis 0081 1 0082 atgtcaaacc attcatctag tattcccgaa ttaagtgaca acggtatccg ctattatcaa 60 0083 acttataatg aaagccttag tctttggccg gtccgttgca aatcattcta 。
34、tatatctact 120 0084 cgttttggtc aaacacatgt gattgcaagc ggcccagagg atgccccgcc gcttgtatta 180 0085 ctccacggag cattattcag ctcgacgatg tggtatccca acatcgccga ttggagcagc 240 0086 aaatacagaa cttatgcagt tgatatcata ggtgataaaa acaagagtat tcctgagaat 300 0087 gtaagcggta caagaacgga ttacgccaat tggcttcttg atgtgtttga 。
35、caatctgggg 360 0088 atcgaaaagt cccacatgat cggactttcg cttggcggtc tccatacgat gaatttcctt 420 0089 ttacgtatgc ctgagagagt aaaaagcgca gctatactga gtccggcaga aacgtttttg 480 0090 ccatttcatc acgatttcta caaatacgct cttggcctta cagcgtcaaa tggagttgaa 540 0091 acattcttaa attggatgat gaatgatcag aatgtgctgc acccgatttt 。
36、tgtgaagcag 600 0092 tttcaggcag gggtaatgtg gcaggatgga tcaagaaatc caaatcctaa agccgacgga 660 0093 tttccgtatg tttttaccga tgaggaatta cgttcagcaa gagttcctat cctattatta 720 0094 cttggtgaac atgaagtcat ctatgatccc cactcagccc tgcaccgagc ctcttcattc 780 0095 gttcctgata ttgaggcgga agtcattaaa aatgccggac atgttttatc gatggaacaa 840 0096 cccgcttacg taaatgaacg tgtaatgcgt tttttcaatg cagaaacagg catttcacgg 900 0097 taa 903 说 明 书 CN 101880695 B 9 。