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一种血浆游离 DNA 水平检测肝细胞坏死程度的方法
    【技术领域】
     本发明涉及一种血浆游离 DNA 水平检测肝细胞坏死程度的方法， 属于生物技术领域。 背景技术
     肝病是常见的临床疾病， 仅乙肝、 丙肝等病毒性肝炎患者在世界各国人数接近 5 亿， 占全球人口的 1/12， 中国是慢性乙型肝炎高发地区， 每年约有 35 万人死于乙肝相关疾 病， 如肝硬化、 肝癌、 重型肝炎等， 1％的乙型肝炎患者发生重型肝炎。重型肝炎是机体在多 种致病因子作用下， 肝脏在短期内的大量坏死所致的肝功能衰竭的一类综合症， 其临床表 现特点为病情重、 发展快、 并发症多、 病死率高， 迄今仍是肝病领域中亟待解决的难题。
     目前， 临床上检测肝细胞损害最直接的方法就是肝细胞穿刺， 但由于其有创性， 且 可能造成一定风险， 尚不能被广泛接受， 而体液中可靠的肝细胞坏死标志尚未完全探索清 楚， 有很多血液生化指标可以间接的对肝脏损害进行评价， 如转氨酶、 胆红素、 白蛋白、 胆碱 酯酶、 凝血酶原活动度等等， 但这些实验室指标都各自存在着一些缺点， 如胆红素及凝血指 标， 都是在肝细胞很大程度上死亡， 剩余肝细胞不能 代偿时才有变化， 且半衰期较长， 如白 蛋白半衰期达 15-19 天， 不能及时反应肝脏损伤状态 ； 胆红素由于直接胆红素和间接胆红 素在体内代谢的特点， 在临床上， 梗阻性黄疸和肝细胞性黄疸有时难以鉴别 ； 转氨酶、 胆碱 酯酶等的变化在重型肝炎中肝损害的检测中也只有辅助作用。因此， 在重型肝炎诊断标准 方面一直存在着一些争议， 有学者按现行的 2000 年西安会议修订的慢性乙型重型肝炎病 理学诊断标准确立 118 例患者， 其中 17.8％不符合临床诊断标准， 其中少数病例在组织学 上已呈现肝细胞大块、 亚大块坏死， PTA 仍高达 60％ ； 总胆红素有 11 例未达到诊断标准， 但 病理已证实为重型肝炎。 所以， 探索新的肝坏死标志物、 及时有效的预测重型肝炎的发生及 发展显得极为重要。
     目前在循环核酸的研究中， 循环核小体浓度的研究作为一种预测疾病进展以及预 测疾病发生的重要作用已经公认， 它作为机体的一种代谢产物， 来源与细胞凋亡与坏死、 血 细胞代谢以及淋巴细胞和肿瘤细胞的分泌， 与机体的状态、 自身免疫性疾病、 感染、 创伤、 移 植、 肿瘤、 产科疾患都有着关联， 目前在定量实验中虽然存在着一些方法学上争论， 但各种 定量技术已经非常成熟。而且， 在实验前准备、 使用血清或者血浆等方面已经达成一定的 共识。而且在肝炎研究方面中， 国外已有学者研究了急慢性肝衰竭的核小体变化并比较了 MARS 前后的变化， 发现了急性肝衰竭患者血浆核小体明显的升高。国内有学者在检测了 重型肝炎患者的血浆核小体水平， 认为其比急性肝炎、 慢性肝炎及肝硬化升高中， 并将其与 ALT 进行了相关性比较， 其他方面的研究尚未见文献报道， 重型肝炎中核小体的定量测定是 可行的。 发明内容
     本发明的目的是提供一种血浆游离 DNA 分离提取方法以及定量， 以游离 DNA 水平反映肝细胞坏死程度。
     为了达到本发明的目的， 本发明是这样实现的 ：
     本发明提供了一种血浆游离 DNA 水平检测肝细胞坏死程度的方法， 包括引物 β-globin 标准品制备， 肝病患者血浆标本血浆 DNA 的提取， 对血浆标本中提取的血浆 DNA 进行实时荧光定量聚合酶链反应， 血浆游离 DNA 的浓度测算， 其特征在于， 所述 β-globin 标准品为引物合成， 上、 下游引物分别为 ：
     上游引物 globin-F ： ACACAACTGTGTTCACTAGC
     下游引物 globin-R ： CAACTTCATCCACGTTCACC。
     所述的引物 β-globin 标准品制备方法如下 ： 反应总体积 25μl 的 β-globin 引物进行 PCR 扩增， 扩增条件为预变性 95 ℃ 1min， 然后 95 ℃ 30s， 57 ℃ 20s， 72 ℃ 20s， 共 45 个循环 ； 凝胶回收纯化 PCR 产物 ； 制备 DH5a 超级感受态细胞 ； 目的基因连接转化及转 化后测序验证 ； 提取质粒， 并进行定量 ； 所述 β-globin 重组质粒长度为 2802bp， 浓度为 13 2.58×10 copies/ml， 10 倍梯度稀释后即为所须标准品。
     所述的肝病患者血浆样本血浆 DNA 的提取方法如下 ： 取 300μl 血浆， 按1∶3 体积加入裂解液 900μl(0.1M Tri-HCL 90μl， 0.05M EDTA90μl， 1％ SDS 450μl， ddH2O 270μl)， 加入 6μl 蛋白酶 K(Proteinase K 20mg/ml) 至终浓度为 100μg/ml， 于振荡器上 混匀 10s， 短暂离心 后于 56℃水浴 2h ； 水浴混合液体于 95℃水浴 10min， 变性 Proteinase K； 短暂离心， 加入等体积 Tris 饱和酚∶氯仿∶异戊醇 ( 体积比 25 ∶ 24 ∶ 1) 混合液 1200μl， 振荡器上充分混匀， 约 2-3min ； 12,000rpm 离心 15min， 小心吸取上清， 置于新 EP 管中 ( 建议使用进口 EP 管 ) ； 于上清液中加入其 2.5 倍体积的无水乙醇 ( 约 3000μl)， 颠 倒混匀， 于 -20 ℃过夜沉淀 (12h 以上 ) ； 常温 12,000rpm 离心 20min， 小心去上清 ； 加入 2 倍体积的 70％乙醇 800μl， 常温 12,000rpm 离心 10min ； 小心去上清， 于 56℃烘箱中放置 20min， 后置于超净台 1h 彻底挥发酒精 ； 加入 40μl ddH2O2 溶解 DNA， 轻微震荡， 短暂离心， 置于 4℃ 1h 充分溶解 DNA ； DNA 标本于 -20℃保存。
     所述的血浆标本中提取的血浆 DNA 进行实时荧光定量聚合酶链反应包括以下步 骤： 反应总体积 20μl 的 β-globin 引物进行 PCR 扩增， 扩增条件为预变性 95℃ 1min， 然后 95℃ 30s， 57℃ 20s， 72℃ 32s， 共 45 个循环。
     所 述 的 血 浆 游 离 DNA 的 浓 度 测 算 包 括 将 已 知 浓 度 为 2.58×1013copies/ml 的 β-globin 重组质粒作为标准品系列 10 倍等比稀释， 使其终浓度分别为 2.58×105copies/ μl、 2.58×104copies/μl、 2.58×103copies/μl、 2.58×102copies/μl， 建立标准曲线确 立 Ct 值与标准品起始模板的对数之间的线性关系 ； 血浆中循环核小体的量按下式计算 ： C ＝ Q×(VDNA/VPCR)×(1/Vext)， 其中 C 为待测样品血浆循环核小体浓度 (GE/ml)， Q 为仪器分析 软件所计算的 DNA 量 (copies)， VDNA 为抽提出的 DNA 总量 (40μl)， VPCR 为加入到反应体 系 中 DNA 量 (9.5μl)， Vext 为用于抽提和纯化 DNA 的血浆总量 (300μl)。
     本发明在对肝病患者提取的血浆标本血浆 DNA 中， 通过引物 β-globin 标准品进 行实时荧光定量聚合酶链反应， 测算血浆游离 DNA 的浓度， 为重型肝炎的诊断提供新的诊 断指标。 具体实施方式
     图 1 为 2％琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 结果图， 图中 1， 2， 3， 4， 5 为全基因组 DNA 的PCR 扩增产物， Maker 为 DL500 marker。
     图 2 为 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒结果图， 图中 Marker 为 DL2000 marker， 1， 2 为 β-globin 重组质粒。
     图 3 为样本扩增曲线图。
     图 4 为 样 本 标 准 曲 线 图， 图中斜率为 ： -3.664065， 截距为 ： 44.995626， R2 为 0.996965。
     图 5 为血浆游离 DNA 在各肝病组间分布图， 图中 a ： 肝炎病人血浆中游离 DNA 主要 分布于 15-20(log2) ； b： log2(cell free DNA) ＜ 15 主要分布于 DLC 组 ； c： log2(cell free DNA) ＞ 20 主要分布于 LF， AH and HCC 组与 DLC 组。
     图 6 为血浆游离 DNA 在各组中平均值分布图。
     图 7 为游离 DNA 水平与各检测项目相关性图， 图中血浆游离 DNA log2 ＞ 20 ： a. 游 2 离 DNA 与 MELD 评分 ： R ＝ 0.72， P值： 0.002 ； b. 游离 DNA 与血清胆固醇水平存在相关性 ： R2 ＝ 0.575， P值： 0.011 ； c. 游离 DNA 与血清直接胆红素浓度存在相关性 ： R2 ＝ 0.591， P值： 2 0.009 ； d. 游离 DNA 与血清 Na 离子水平存在相关性 ： R ＝ 0.707， P值： 0.002 ； e. 游离 DNA 2 与白细胞水平存在相关性 ： R ＝ 0.588， P值： 0.010 ； f. 游离 DNA 与单核细胞水平存在相关 2 性： R ＝ 0.934， P值： 0.000。
     图 8 为 ALT ＞ 500U/L 时， a. 血浆游离 DNA 与 MELD 评分存在相关性 ： R2 ＝ 0.615， P值： 0.000 b. 血浆游离 DNA 与血浆胆固醇水平存在相关性 ： R2 ＝ 0.353， P值： 0.001。 2
     图 9 为肌酐大于 3mg/dl 时， 血浆游离 DNA 与血清肌酐存在相关性， R ＝ 0.756， p 值： 0.005。
     下面结合附图对本发明作进一步详细描述， 但不作为对本发明的限定。
     实施例一， 引物 β-globin 标准品的制备。
     1、 实验主要试剂及器材
     1) 氢氧化钠、 氢氧化钾、 氯化钠、 氯化钾、 无水乙醇、 冰乙酸、 乙酸氨、 乙酸钠、 异戊 醇等常用化学试剂均为西安化学试剂厂生产， 纯度级别为分析纯 ；
     2)EB(Sigma 公司产品分装， 购于华美生物工程公司 ) ；
     3)loading buffer( 宝生物 TaKaRa 产品分装， 购于西安周鼎国生物工程公司 ) ；
     4) 琼脂粉 (GEGE TECH 上海有限公司， 购于西安周鼎国生物工 程公司 ) ；
     5) 琼脂糖 (Amresco 公司原装产品， 购于西安周鼎国生物工程公司 ) ；
     6) 核酸分子量参照物 500bp DNA maker、 2000bp DNA maker( 西安沃尔森生物工程 公司 ) ；
     7) 上海生工生物工程技术服务有限公司的 UNIQ-10 柱式质粒小量抽提试剂盒 ；
     8)Promega 中量质粒提取试剂盒 ；
     9) 上海生工生物工程有限公司 UNIQ-5 柱式 DNA 胶回收试剂盒 ；
     10)β-globin 引物合成 ： 上游引物 globin-F ： ACACAACTGTGTTCACTAGC， 下游引物 globin-R ： CAACTTCATCCACGTTCACC， 由上海生工生物技术有限公司合成和标记 ；
     11)PCR 反应试剂 ： 含 Taq 酶， 反应缓冲液， 镁离子， dNTP( 宝生物 TaKaRa 产品， 购于 宝泰克生物工程公司 ) ；
     上述试剂按照说明储存。主要器械 型号或规格 生产公司 单道可调式微量移液器 1000μl 200μl 10μl 德国 Eppendorf 公司 一次性离心管 0.5ml 1.5ml 美国 BD 公司 恒温培养箱 PXY-DHS 400-BS 上海博泰有限公司 恒温振荡器 CHA-S 国华企业有限公司 全自动生化分析仪 AU5400 日本 OLYMPUS 公司 压力蒸汽灭菌器 LDZX-50KB 上海申安医疗器械厂 温度梯度程控 PCR 扩增仪 2104142 型 德国 Biometra 公司 紫外凝胶成像仪系统 T2A 型 意大利 Bio-RAD 公司 低温离心机 Sigma， 3-18K 德国 SIGMA 公司 2、 PCR 扩增 用 β-globin 引物对人全基因组 DNA 进行扩增， 反应总体积 25μl， 按以下体系进行 ： 反应液组份 加量 (μl) 终浓度 PCR 试剂混合物 2x 12.5 1x 上游引物 F10umol 0.5 0.125umol下游引物 R10umol 0.5 0.125umol
     待测样品 ( 或标准品 ) 2.0
     无菌去离子水 9.5
     扩增条件 ： 预变性 95℃ 1min， 然后 95℃ 30s， 57℃ 20s， 72℃ 20s， 共 45 个循环。
     2％琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 结果， 于 110bp 左右出现清晰条带， 即目的条带， 如图 1， 确立 β-globin 基因扩增条件。
     3、 凝胶回收
     采用切胶纯化法 ( 按上海生工生物工程有限公司 UNIQ-5 柱式 DNA 胶回收试剂盒 说明进行 ) 步骤如下 ：
     1) 取一个新鲜、 灭菌 1.5ml 离心管称重。
     2) 于紫外透射仪中铺上一块新鲜的保鲜纸， 将凝胶 ( 见图 3-1) 放在保鲜纸上 ( 以 尽量提高 DNA 回收的纯度 )， 打开长波紫外灯用干净的手术刀快速将目的片段 (110bp 左 右 ) 从琼脂糖凝胶上切下来 ( 尽可能去除多余的琼脂糖胶 )。切下来的胶块放入 1.5ml 的 离心管中， 用微量电子天平称重并作好记录。
     3) 按每 100mg 琼脂糖凝胶加入 400μl Binding buffer 的量来计算， 加入相应体 积的 Binding buffer， 混匀后置于 50-60℃水浴中 10min， 使胶彻底融化 ( 加热融胶时， 每 2min 混匀一次 )。
     4) 将融化的胶溶液转移到套放于 2ml 收集管的 UNIQ-10 柱中， 室温放置 2min， 用 台式离心机高速 (6000rpm) 离心 1min。
     5) 取下 UNIQ-10 柱， 倒掉收集管中的废液， 将 UNIQ-10 柱放回收集管中， 加入 500μl Wash solution， 离心 8000rpm 1min。
     6) 重复步骤 5 一次。
     7) 取下 UNIQ-10 柱， 倒掉收集管中的废液， 将 UNIQ-10 柱放回收集管中， 12,000rpm 1min。
     8) 将 UNIQ-10 柱放入一新鲜洁净的 1.5ml 离心管中， 在柱膜中央加 30μl ElutionBuffer 到 UNIQ-10 柱中， 室温放置 2min。( 提高洗脱温度至 55-80℃有利于提高 DNA 的洗 脱效率 )
     9)12,000rpm 室温离心 1min， 离心管中的液体即为回收的 DNA 片段， 保存于 -20℃ 备用。
     10) 取 3μl PCR 纯化产物加适量加样缓冲液混合， 1.5％琼脂糖电泳检查回收率， 出现 110bp 左右较淡的单一条带， DNA 回收纯化成功。
     4、 制备超级感受态细胞
     1) 制备前准备 ：
     (1) 配制 SOB 培养基 ：
     配制每 1L 培养基， 在 950ml 去离子水中加入 ： 胰化蛋白胨 20g， 酵母提取物 5g， NaCl 0.5g。磁力搅拌器使溶质完全溶解。加 10ml 250 mmol/L KCl 溶液。用 5mol/L NaOH 调 pH 值至 7.0。用去离子水定容至 1L。高压下蒸汽灭菌 20min 4℃保存。注意该溶液在使 用前， 加入 5ml 灭菌的 2mol/L MgCl2。
     (2) 配制 SOC 培养基 ：
     配制 1mol/L 的葡萄糖溶液 ： 将 18g 的葡萄糖溶解在 90ml 的去离子水中， 定容至 100ml， 用 0.22μm 滤膜过滤除菌。向 100ml SOB 培养基中加入除菌的 1mol/L 葡萄糖溶液 2ml， 均匀混合。4℃保存。 (3)LB 培养基配制 ：
     配制每 1L 培养基， 应该在 950ml 去离子水中加入 ： 胰化蛋白胨 10g， 酵母提取物 5g， NaCl 10g。磁力搅拌器使溶质完全溶解。用 5mol/LNaOH 调 pH 至 7.0。用去离子水定 容至 1L， 高压下蒸汽灭菌 20min。
     (a). 配制 LB-AMP 抗性培养基 ：
     配制 LB 液体培养基 100ml， 步骤同上。
     LB 液体培养基中加 1.5％琼脂粉， 高压灭菌消毒 20min。
     从高压锅中取出培养基， 轻轻旋动使溶解的琼脂粉均匀分布。
     含氨苄青霉素 Amp 的 LB 固体培养基 ： 将配好的 LB 液体培养基高压灭菌后冷却至 60℃左右， 加入氨苄青霉素储存液 ( 原浓度为 50mg/ml)120μl。
     (b).LB/AMP/X-Gal/IPTG 培养皿配制 ：
     同上配制 LB-AMP 抗性培养基， 取 100mm 无菌培养皿， 每个中倒入约 35ml， 凝固。 滴 加 20mg/ml 的 X-gal 50μl 和 24mg/ml 的 IPTG 100μl， 均匀涂布于平板培养基上。
     (4)Inoue 转化液的配制 ：
     配制 1L Inoue 转化液 ： ， 分别称取 10.88g 的 MnCl2· 2H2O、 1.665g 的 CaCl2、 18.65g 的 KCl 加入 800ml 的去离子水中， 完全溶解后加入 20ml 的 PIPES， 然后用去离子水定容至 1L， 0.45μm 滤膜过滤除菌， 分装后 -20℃保存， 备用。
     2) 使用 Inoue 方法制备超级感受态细胞
     步骤如下 ：
     (1) 挑取一个在 37℃过夜培养的 DH5α 大肠杆菌单个菌落 ( 直径 2 ～ 3mm)， 接种 至 250ml 锥形瓶中的 25ml LB 培养液中， 于 37℃摇床 250rpm 培养 8h ；
     (2)8h 后， 将上述初始培养物接种于三个盛有 250ml LB 培养液的 1L 锥形瓶中， 第
     一个加 10ml， 第二个加 4ml， 第三个加 2ml， 于 18℃ 200rpm 转速的摇床过夜培养 ；
     (3) 次日早上， 测量三瓶培养物的 OD600 值， 每 45min 测定一次， 当有一瓶的培养物 OD600 ＝ 0.55 时， 将培养瓶置于冰水浴中 10min， 摇动培养瓶使培养物充分降温， 弃去另两瓶 培养物 ；
     (4) 于 4℃以 2500g 离心 10min 收集菌体 ；
     (5) 倒去培养液， 将离心管中剩余液体尽量甩干， 用吸水纸吸干 ；
     (6) 加入 40ml 预冷的 Inoue 转化缓冲液重悬细胞沉淀， 轻轻旋转混匀， 不要用振荡 器或吹吸混匀， 4℃ 2500g 离心 10min 收集菌体， 弃去上清 ；
     (7) 将离心管中剩余液体尽量甩干， 加入 10ml 预冷的 Inoue 转 化缓冲液轻轻重悬 沉淀 ；
     (8) 加入 750μl DMSO。轻轻混匀， 放置冰水浴中 10min ；
     (9) 迅速将悬液以每管 100μl 分装到冷却的无菌 1.5ml 离心管中， 封紧管口， 没入 液氮中快速冰冻感受态细胞 ( 半小时以上 )。贮存于 -80℃备用。
     5、 目的基因的连接和转化
     连接 ： 建立 10μl 连接反应体系 ( 按照 TaKaRa pMD18T 载体说明书 ) PMD18T 载体 ： 1μl，
     β-globin DNA( 前面经过纯化 ) ： 1μl，
     ddH2O ： 3μl
     加入 5μl 的 solution I 轻轻混匀后在 16℃水浴箱内反映 30min ； 同时设置阴性 对照和阳性对照。
     转化 ： 1) 从 -80℃取 100μl(1 管 )DH5α 感受态细胞握在手心迅速融化后置冰上 10min ；
     2) 把反应 30min 后的连接反应物 (10μl) 用预冷的枪头移入感受态细胞悬液中， 轻轻混匀后冰上放置 30min ；
     3)42℃水浴热激 90s ；
     4) 快速转到冰浴 2min ； 然后加入 900μl SOC 培养基 ；
     5)37℃， 225rpm 振荡培养 60min ；
     6) 涂布 ： 取 50μl 的转化液滴在 37℃预热的平板 LB/AMP/X-Gal/IPTG 培养皿上， 用无菌涂布器将其均匀涂开， 置于 37 ℃培养箱培养， 待转化液完全吸收后， 倒置培养皿， 继 续培养 12-16h ；
     7) 将培养板取出， 4℃放置 5h， 使蓝色充分显色。目的菌落出现 ；
     8) 摇菌 ： 取 2 个 50ml 离心管， 各加入 5ml LB/AMP 培养基。用无菌牙签分别挑取 2 个白色克隆菌落， 接种到 50ml 离心管内， 标注为 1、 2；
     9)37℃、 225rpm 振荡培养。8h 后， 测 OD 值 ： OD1 ： 0.885、 OD2 ： 1.320( 取 2ml 菌液用 于提取重组质粒， 另外使用 30％甘油保存菌液， 以备后续的验证实验使用 )。
     6、 小量提取重组质粒
     1) 将培养好的 2ml 菌液 12000rpm 离心 1min， 去上清 ；
     2) 加 250μl Solution I， 用枪头或振荡器充分悬浮细菌 ；
     3) 加入 250μl Solution II， 立即上下颠倒 5 ～ 10 次， 使细菌裂解， 室温放置 2min ；
     4) 加入 350μl Solution III， 立即上下颠倒 5 ～ 10 次， 使之充分中和， 室温放置2min ； 5)12,000rpm 离心， 5min ；
     6) 将步骤 5 中的上清转移至已套放于 2.0ml 收集管内的 UNIQ-10 柱中， 12,000rpm 室温离心 1min ；
     7) 弃收集管中的废液， 将 UNIQ-10 柱放入同一只收集管中， 吸取 500μl Wash Solution 到 UNIQ-10 柱， 12,000rpm 室温离心 1min ；
     8) 重复步骤 7) ；
     9) 弃收集管中的废液， 将 UNIQ-10 柱放入同一只收集管中， 12,000rpm 室温离心 2min 以彻底去除 Wash Solution ；
     10) 将 UNIQ-10 柱 放 入 新 的 洁 净 1.5ml 离 心 管 中， 加 50μl DW( 或 Elution Buffer)， 室温放置 2min 后， 10,000rpm 室温离心 1min。离心管中的溶液即为所抽提的质粒 DNA。
     1％琼脂糖凝胶电泳鉴定是否提出质粒， 出现均一条带， 如图 2。
     7、 鉴定所提质粒 (PCR 法初步验证 )
     使用 β-globin 引物进行扩增 ： 体系 25μl， 具体组成如下 ：
     反应液组份 加量 (μl) 终浓度
     PCR 试剂混合物 (2x) 12.5 1x
     上游引物 10umol 0.5 0.2umol
     下游引物 10umol 0.5 0.2umol
     质粒 DNA 2
     无菌去离子水 9.5
     PCR 仪设置条件 ： 预变性 ： 95℃ 1min ； 变性 95℃ 30s， 退火 57℃ 20s， 延伸 72℃ 20s， 共 45 个循环。
     1％琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 结果 ： 出现大小为 110bp 目的条带。
     ( 初步证明目的基因转化 DH5a 成功， 为了进一步验证， 将保存的菌液重新增菌后 送公司测序 ) 测序结果经比对表明 ： β-globin 已连于 T 载体上并转化成功。
     8、 中量提取重组质粒
     操作过程如下 ：
     (1) 取 50μL 重组质粒转化菌液接种到 5mL 的 LB/AMP 培养基， 37℃震荡培养 6-8h。 然后取 2ml 菌液加入 100ml SOB/AMP 培养基内过夜培养 ；
     (2) 次日， 测 OD600 ＝ 1.983。室温下 5000g 离心 10min， 收集菌体， 并尽可能的吸去 上清 ；
     (3) 加入 3mL 细胞重悬液 (cell resuspension)， 涡流震荡确保细菌沉淀重新悬 浮；
     (4) 加入 3mL 细胞裂解液 (cell lysis solution)， 轻轻地颠倒 5-10 次以混合均 匀， 然后静置 3min 至溶液粘稠而澄清 ；
     (5) 加入 5mL 中和液 (Neutralization)， 立即轻柔颠倒 5 次， 静置 2min ；
     (6) 将蓝色离心柱放入 50ml 离心管， 将第 4 步所得的混合液移至柱子内， 在室温下
     1500g 离心 5 分钟 ( 若仍有液体， 可再次离心 ) ；
     (7) 将白色吸附柱放入干净的 50ml 离心管， 将第 5 步收集的液体转移至白色吸附 柱内， 3000rmp 离心 30min ；
     (8) 向白色吸附柱内加入 5mL 内毒素去除液， 室温下 3000rpm 离心 3min， 倒掉收集 管中的废液， 将柱子重新放回到收集管中 ；
     (9) 向白色吸附柱内加入 20ml 纯化洗柱液 3000rpm 离心 5min， 弃废液， 将柱子重 新放回收集管， 3000rpm 离心 5min， 以去除洗涤液中的乙醇 ；
     (10) 将白色吸附柱移到一个新的 50ml 离心管， 室温下 5,000g 开盖离心 10min， 以 彻底去除残留的乙醇 ；
     (11) 将白色吸附柱转至一个新的 50ml 离心管中， 向 DNA 柱膜的正中加入 0.6ml 的 ddH2O(pH 在 7.0-8.5 之间 )， 室温放置 1min， 2000g 离心 5min， 以洗脱质粒 DNA ；
     (12) 提高得率， 可用第 10 步所得的液体再洗脱一次， 离心后收集到离心管中， 即 所提取的质粒 DNA。
     9、 定量
     测 OD 值， 采用紫外吸收法， 测量 OD260 的吸收值。计算机直接测出 β-globin 重组 质粒的浓度为 79.4ng/μl ； 将 ng/μl 换算为 copies/ml ： copies/ml ＝ (6.02×1023)×(ng/ μl×10-6)/(DNA length×660) ；
     β-globin 重组质粒长度为 β-globin 与 T 载体碱基数之和， 为 2802bp， 最终换算 13 出浓度为 2.58×10 copies/ml， 10 倍梯度稀释后即为所须标准品。
     实施例二， 血浆核小体的提取及定量
     1、 实验主要材料
     荧光 PCR 反应混合物 SYBR Premix Ex TaqTM， 含 SYBR Green I， 反应缓冲液， dNTP， TaKaRa Ex Taq TM HS， 镁离子 ( 宝生物 TaKaRa 产品， 购于宝泰克生物工程公司 )， 试剂按照 说明储存。
     2、 研究对象
     西安交通大学医学院第一附属医院感染科 2009 年 3 月至 2010 年 6 月间收住的乙 型肝炎、 丙型肝炎以及药物性肝炎引起的急、 慢性肝损害患者、 肝癌患者共 204 例。临床诊 断符合 2000 年西安会议修订的病毒性肝炎防治方案。年龄 5-79 岁， 平均 45.14±14.547 岁； 其中男性 146 例， 年龄 5-79 岁， 女性 58 例， 年龄 16-73 岁。所有病例均排除系统性红斑 狼疮和类风湿性关节炎等全身性自身免疫性疾病。
     3、 标本的采集
     晨起后未进食前采集患者及志愿者标本， 于肘静脉抽取静脉血 3ml 置于 EDTA 抗凝 管中， 标本于 2h 内进行下一步处理。
     4、 标本处理和保存
     1) 将标本配平后置于低温超速离心机于 4℃下 1600g 离心 10min ；
     2) 轻轻地取出试管， 用 1000μl 可调式移液器 ( 使用一次性高压消毒枪头 ) 吸取 上层血浆， 置于 1.5ml 的经过高压消毒处理后的微离心管中 ；
     3) 配平微离心管后， 置于低温超速离心机于 4℃下 1,6000g 离心 10min ；
     4) 轻轻地取出离心管， 用 1000μl 可调式移液器 ( 使用一次性高压消毒枪头 ) 吸 取上清液， 装于 1.5ml 的经过高压消毒处理后的离心管中， 并按照标本登记标明编号 ；
     5) 于 -80℃保存上述血浆标本备用， 以上备用标本保存过程中， 严格注意保存条 件， 防止反复冻融。
     5、 检测临床指标
     标本采集同时采血进行以下项目检测 ： 血常规测定、 肝功十项测定、 凝血四项测 定、 肾功能测定， 所有患者血清样品检测在我院检验科完成。
     6、 血浆 DNA 提取
     血浆游离 DNA 提取采用经典酚、 氯仿、 异戊醇 ( 体积比 25 ∶ 24 ∶ 1) 抽提方法。
     1) 取 300μl 血浆， 按 1 ∶ 3 体积加入裂解液 900μl(0.1MTri-HCL 90μl， 0.05M
     EDTA 90μl， 1％ SDS 450μl， ddH2O 270μl)， 加入 6μl 蛋白酶 K(Proteinase K 20mg/ml) 至终浓度为 100μg/ml， 于振荡器上混匀 10s， 短暂离心后于 56℃水浴 2h ；
     2) 第一步混合液体于 95℃水浴 10min， 变性 Proteinase K ； 短 暂离心， 加入等体 积 Tris 饱和酚∶氯仿∶异戊醇 ( 体积比 25 ∶ 24 ∶ 1) 混合液 1200μl， 振荡器上充分混 匀， 约 2-3min ；
     3)12,000rpm 离心 15min， 小心吸取上清， 置于新 EP 管中 ( 建议使用进口 EP 管 ) ；
     4) 于上清液中加入其 2.5 倍体积的无水乙醇 ( 约 3000μl)， 颠倒混匀， 于 -20℃过 夜沉淀 (12h 以上 ) ；
     5) 常温 12,000rpm 离心 20min， 小心去上清 ；
     6) 加入 2 倍体积的 70％乙醇 800μl， 常温 12,000rpm 离心 10min ；
     7) 小心去上清， 于 56℃烘箱中放置 20min， 后置于超净台 1h 彻底挥发酒精 ；
     8) 加入 60μl ddH2O 溶解 DNA， 轻微震荡， 短暂离心， 置于 4℃ 1h 充分溶解 DNA ；
     9)DNA 标本于 -20℃保存。
     7、 对所有提取的血浆 DNA 进行实时荧光定量聚合酶链反应
     1) 引物， 即 β-globin 引物。上游引物 globin-F ： ACACAACTGTGTTCACTAGC， 下游引 物 globin-R ： CAACTTCATCCACGTTCACC。由上海生工生物技术有限公司合成和标记。
     2) 反应体系 ： 总体积 20μl， 定量标准品、 阳性、 阴性对照及待测样本均按以下体系进行。
     3) 扩增条件 ： 预变性， 95 ℃ 1min， 然后 95 ℃ 30s， 57 ℃ 20s， 72 ℃ 32s， 共 45 个 循环 ( 由于本实验使用的为 ABI 7500， 仪器要求 PCR 延伸时间即荧光采集时间不得低于 32s)。
     4) 标准曲线 ： 将已知浓度为 2.58×1013copies/ml 的 β-globin 重组质粒作为标 准品系列 10 倍等比稀释， 使其终浓度分别为 2.58×105copies/μl、 2.58×104copies/μl、 2.58×103copies/μl、 2.58×102copies/μl， 建立标准曲线。
     5) 数据处理 ： 每次分析包含一条标准曲线和两个无模板阴性对照。反应结束后， 由电脑自动分析并计算结果。所有反应采用 ABI7500 荧光定量 PCR 扩增仪及 SDS 14.0 分 析软件， 绘制标准曲线， 确立 Ct 值与标准品起始模板的对数之间的线性关系， 根据待测样 本的扩增情况， 算出反应体系中待测样本的起始量。
     血浆中循环核小体的量按下式计算 ：
     C ＝ Q×(VDNA/VPCR)×(1/Vext)， 其中 C 为待测样品血浆循环核小体浓度 (GE/ml)， Q 为仪器分析软件所计算的 DNA 量 (copies)， VDNA 为抽提出的 DNA 总量 (40μl)， VPCR 为加入 到反应体系中 DNA 量 (9.5μl)， Vext 为用于抽提和纯化 DNA 的血浆总量 (300μl)。
     实施例三， 临床实验
     1、 研究对象
     西安交通大学医学院第一附属医院医院传染科 2009 年 3 月至 2010 年 6 月份间 收住的乙型肝炎病毒、 丙型肝炎病毒和药物引起的急性、 慢性肝损害患者及肝癌患者共 204 例， 排除各种免疫性疾病。 临床诊断慢性肝炎和代偿期肝硬化在病理上并没有绝对的界限， 部分临床诊断慢性肝炎可能已呈现出早期肝硬化， 二者均以炎症反应为主 ； 重型肝炎、 急性 肝炎和肝癌均呈现出肝细胞或癌细胞坏死或凋亡， 以细胞死亡为主。 将患者分为三组 ： 第一 组为 CH and LC 组， 包括慢性肝炎和肝硬化代偿期患者 ； 第二组为 DLC 组， 包括肝硬化失代 偿期患者 ； 第三组为 LF， AH and HCC 组， 包括重型 ( 急性、 亚急性与慢性重型 ) 肝炎、 原发性 肝癌和急性黄疸型肝炎。(CH， Chronic Hepatitis 慢性肝炎 ； LC， Liver cirrhosis 肝硬化 代偿期 ； DLC， Decompensated liver cirrhosis 肝硬化失代偿期 ； AH， Acute Hepatitis 急 性肝炎 ； HCC， hepatocellular carcinoma 原发性肝癌 ； LF， Liver Failure 重型肝炎 )。
     2、 实时定量 PCR 结果 ：
     扩增曲线， 见图 3。
     标准曲线， 见图 4。
     3、 病人一般资料及实验室检查结果
     病人一般资料及实验室检查结果如下表所示 ：
     各组间血浆游离 DNA 浓度存在明显差异， P ＝ 0.002 ； LF， AH and HCC 组与 CH and LC 组及 DLC 组间血浆游离 DNA 浓度存在明显差异， P ＝ 0.000， 0.049， 均有统计学意义， 如下表所示。
     4. 血浆游离 DNA 在各肝病组间分布 血浆游离 DNA 在各肝病组间分布见图 5， 血浆游离 DNA 在各组中平均值分布见图 5. 游离 DNA 水平与各检测项目相关性6。
     其各相关性见图 7， 图 8 和图 9。
     本发明应用实时荧光定量 PCR 检测 204 例肝病患者血浆游离 DNA 水平， 其中包括 急性肝炎、 慢性肝炎、 代偿期及失代偿期肝硬化、 重型肝炎、 肝癌五种不同程度和类型肝病， 将 204 例患者按性别和年龄进行分析， 发现性别和年龄对血浆核小体影响不大 ； 将肝病患 者按不同临床分组分析发现， LF， AH and HCC 组 DNA 水平处于最高， 依次为 CH and LC 组 及 DLC 组 ( 图 6)， LF， AH and HCC 组与 CH and LC 组和 DLC 组游离 DNA 水平存在统计学差 异， P 值分别为 0.049， 0.000( 图表 2)。急性肝损伤状态下大量肝细胞坏死， 伴发炎症反应， 在肝癌患者中， 已有研究证实恶性肿瘤患者血浆游离 DNA 水平高于正 大量 DNA 释放入血 ； 常人 ； 失代偿肝硬化， 肝脏内大量纤维及假小叶形成， 呈现出以肝脏代偿功能丧失表现出来 的症状， 肝内细胞坏死程度相对较轻 ； 慢性肝炎患者肝脏及代偿期肝硬化肝内均仍以炎症 表现为主， 肝细胞坏死或凋亡释放入血相对于失代偿期高， 但肝细胞损伤程度仍不及 LF， AH and HCC 组。 重型肝炎在病理上大量肝脏细胞坏死， 释放大量 DNA 入血， 理论上血浆游离 DNA 水平高于其他慢性炎症损伤， 但由于部分患者肝脏坏死程度较重， 肝脏体积严重缩小， 肝脏 大部分细胞已坏死， 部分患者已经过正规的治疗， 病情已经平稳 ； 而血浆游离 DNA 半衰期为 16.3 分钟， 使得收取标本时机成为一个重要影响因素， 因此所检测标本并未呈现出重型肝 炎 DNA 水平均高于其他肝炎标本。血浆游离 DNA 水平以 20 为界限 ( 图 5)， 高于 20 仅 10 例 而重型肝炎及肝癌占 50％， 血浆游离 DNA 在 患者， 包括重型肝炎， 肝癌及失代偿期肝硬化， 肿瘤领域有广泛的研究， 均证明血浆游离 DNA 高于正常人群， 而重型肝炎肝细胞大量坏死 释放 DNA 入血 ； 高水平 DNA 出现在失代偿期肝硬化患者血浆， 可能提示病情加重或向重型肝 炎转化可能。
     MELD 评 分 能 准 确 的 反 应 肝 脏 功 能 状 态， MELD 是 一 个 从 6( 轻 微 疾 病 ) 到 40( 严 重 疾 病 ) 变 化 的 数 字 范 围， 其计算公式为： R ＝ 3.8×ln[ 胆 红 素 (mg/ dl)]+11.2×ln(INR)+9.6×ln[ 肌酐 (mg/dl)]+6.4×( 病因 ： 胆汁性或酒精性 0， 其他 1)。 血浆游离 DNA 水平与各项检查项目均不存在相关性， 但 log2(cell free DNA) ＞ 20 时， DNA
     水平与 MELD 评分存在强相关性， 提示在 DNA 高水平状态时， 血浆游离 DNA 能准确的反应肝 功能状态， 是一项较为准确的指标 ； 肝细胞严重损伤时， 胆固醇在肝内合成减少， 胆固醇越 低提示预后越差， DNA 水平与胆固醇存在负相关性 ； 大多数肝硬化病人的肾功能一场是功 能性异常， 是对全身血流动力紊乱的反应， 钠水潴留是肝硬化病人肾功能失常最常见的结 果， 间接反应肝脏功能， DNA 水平与体内钠浓度呈负相关性 ； 同时还和体内白细胞存在相关 性， 有研究证实游离 DNA 水平与体内炎症反应呈正相关。
     选择转氨酶较高患者， 以 500U/L 为界限 ( 图 8)， 大于 500U/L 者， 血浆中游离 DNA 水平与 MELD 评分及胆固醇存在统计学上的相关性， ALT 主要存在于肝细胞中， 肝细胞损伤 后， 转氨酶释放入血， 是目前临床上反应肝细胞功能的常用指标， 转氨酶水平高低能一定程 度上反应肝脏损伤程度。在肝脏损伤严重时， 血浆游离 DNA 水平与 MELD 评分强正相关， 结 合肝功能检查能准确的评价肝功能状态及肝炎预后。
     肝肾综合症发生在慢性肝病及后期的肝功能衰竭和门静脉高压症的患者， 表现为 肾功能障碍、 明显的动脉循环异常和内源性血管活性系统活动， 明显的血管收缩导致低肾 小球滤过率。血肌酐作为评价肝脏功能和病情程度的一项指标， 当大于 3mg/dL 时 ( 图 9)， 血浆游离 DNA 与其存在强相关性， 在肾功能严重损伤时， 游离 DNA 能作为反应肾功的一项指 标， 可能与部分游离 DNA 经肾脏排泄有关。