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1、10申请公布号CN101955927A43申请公布日20110126CN101955927ACN101955927A21申请号200910069718522申请日20090714C12N15/01200601C12Q1/04200601C12R1/7420060171申请人南开大学地址300071天津市南开区卫津路94号南开大学环境科学与工程学院72发明人孙红文姜春晓王婷张彦峰张清敏54发明名称一种通过诱变提高热带假丝酵母菌对镉的耐受性的方法57摘要本发明公开了一种通过诱变提高热带假丝酵母菌对镉的耐受性的方法，包括以下步骤1制备热带假丝酵母菌原生质体，2预培养后的活菌落进行亚硝酸诱变于终浓度为。
2、0025MOL/L的亚硝酸溶液处理1020MIN，诱变后在含镉培养基平板和摇瓶发酵筛选，所得活菌落即为对镉具耐受性的突变菌。通过本方法，得到对高浓度镉充分耐受的突变菌C44，其对镉的耐受浓度达到08MMOL/L。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页CN101955927A1/1页21一种通过诱变提高酵母菌对镉的耐受性的方法，其特征依次包括以下步骤1首先将热带假丝酵母菌接种于葡萄糖蛋白胨液体培养基YEPD斜面，培养至处于对数生长期中段。取5ML菌悬液于离心管中，加入巯基乙醇PB溶液和006MOL/LEDTA溶液预处理。加入2的蜗牛酶高渗缓冲液悬浮。
3、，在2830下，低速振荡恒温水解6090MIN，定时取样镜检观察，当大部分细胞转化成球形的原生质体时，在3500R/MIN下离心约10MIN，弃去上清液，终止酶解，用高渗缓冲液洗涤2次，重新将原生质体悬浮于高渗缓冲液中。2对步骤1中所制备的菌悬液3ML106CELLS/ML置于直径7CM的平底培养皿中，进行亚硝酸诱变于终浓度为0025MOL/L的亚硝酸溶液处理10MIN，对诱变后的活菌落进行筛选，获得对镉具耐受性的突变酵母菌。3对步骤2诱变后的突变菌株进行筛选的方法为浓度梯度平板初筛和摇瓶发酵复筛相结合的两步筛选法。2根据权利要求1所述的通过诱变提高酵母菌对镉的耐受性的方法，其特征在于步骤1中。
4、镉对出发菌热带假丝酵母菌的最小抑制浓度MIC为008MMOL/L。3根据权利要求1所述的通过诱变提高酵母菌对镉的耐受性的方法，其特征在于步骤1的每升培养基以及步骤3的摇瓶发酵培养基成分为，葡萄糖20G，蛋白胨20G，酵母膏10G，PH70。步骤3的浓度梯度平板培养基成分为，每升含有葡萄糖20G，蛋白胨20G，酵母膏10G，琼脂20G、PH70。4根据权利要求1所述的通过诱变提高酵母菌对镉的耐受性的方法，其特征在于步骤2的亚硝酸诱变结束后，加入007MOL/L、PH86的磷酸氢二钠溶液20ML，使PH值下降至68左右，以终止诱变反应。根据权利要求1所述的通过诱变提高酵母菌对镉的耐受性的方法，其特。
5、征在于步骤3的浓度梯度平板初筛和摇瓶发酵复筛的培养基中含镉浓度为009MMOL/L。权利要求书CN101955927A1/3页3一种通过诱变提高热带假丝酵母菌对镉的耐受性的方法技术领域0001本发明涉及一种通过微生物诱变手段提高微生物对镉的耐受性的方法。技术背景0002镉CD是生物毒性极强的重金属元素，与PB、CR、AS和HG合称为“五毒”，位列第二。近年来，现代工业的发展以及镉在冶炼、化工、造纸和电子工业等方面的广泛应用，使得CD污染日趋严重。因此，如何修复环境中的镉污染，成为国内外研究的热点。目前，关于微生物修复镉污染的研究主要集中于对耐镉微生物的选择策略上。传统的耐镉微生物的筛选主要是采。
6、用“驯化”的方法，许多研究表明，在起始阶段经过“驯化”的微生物对镉能表现出较好的耐性，而在后期这种耐性却几乎消失。利用亚硝酸诱变对微生物进行诱变处理，是简单有效的诱变育种技术。国内外主要是利用亚硝酸诱变育种技术来获得大量高产的工业微生物菌株，但是利用该诱变技术来选育高效耐镉微生物的研究较少。0003本发明的目的旨在提供一种通过微生物诱变手段提高微生物对镉的耐受性，以修复环境中镉污染的新方法。发明内容0004针对目前选择高效耐镉微生物技术中存在的问题，本发明提供一种通过诱变手段提高热带假丝酵母菌对镉的耐受性，从而修复环境中镉污染的方法。0005本发明的一种通过亚硝酸诱变提高热带假丝酵母菌对镉的耐。
7、受性的方法，其包括以下步骤00061首先将热带假丝酵母菌接种于葡萄糖蛋白胨液体培养基YEPD斜面，培养至处于对数生长期中段。取5ML菌悬液于离心管中，加入巯基乙醇PB溶液和006MOL/LEDTA溶液预处理。加入2的蜗牛酶高渗缓冲液悬浮，在2830下，低速振荡恒温水解6090MIN，定时取样镜检观察，当大部分细胞转化成球形的原生质体时，在3500R/MIN下离心约10MIN，弃去上清液，终止酶解，用高渗缓冲液洗涤2次，重新将原生质体悬浮于高渗缓冲液中。00072对步骤1中所制备的菌悬液3ML106CELLS/ML置于直径7CM的平底培养皿中，进行亚硝酸诱变于终浓度为0025MOL/L的亚硝酸溶。
8、液处理10MIN，对诱变后的活菌落进行筛选，获得对镉具耐受性的突变酵母菌。00083对步骤2诱变后的突变菌株进行筛选的方法为浓度梯度平板初筛和摇瓶发酵复筛相结合的两步筛选法。0009步骤1的每升培养基以及步骤3的摇瓶发酵培养基成分为，葡萄糖20G，蛋白胨20G，酵母膏10G，PH70。步骤3的浓度梯度平板培养基成分为，每升含有葡萄糖20G，蛋白胨20G，酵母膏10G，琼脂20G，PH70。0010步骤2的亚硝酸诱变结束后，加入007MOL/L、PH86的磷酸氢二钠溶液20ML，使PH值下降至68左右，以终止诱变反应。说明书CN101955927A2/3页40011步骤3的浓度梯度平板初筛和摇瓶。
9、发酵复筛的培养基中含镉浓度009MMOL/L。0012本发明的优点0013本发明通过亚硝酸诱变、两次筛选，得到对高浓度镉充分耐受的突变菌C44，其对镉的耐受浓度达到08MMOL/L，是出发菌热带假丝酵母菌的耐镉浓度的10倍。通过本方法，提高了热带假丝酵母菌对镉的耐受性。具体实施方式0014出发菌热带假丝酵母菌难以耐受高浓度的镉。将出发菌亚硝酸诱变后会形成耐镉能力不同的酵母菌突变库，其中很可能含有少量对镉具有高耐受能力的菌株，关键是将这部分在突变库中占极少比例的镉的耐受型突变酵母菌从大量无义突变中筛选出来，如果镉耐受型突变酵母菌确实在突变库中存在，将突变库接入高浓度镉的培养基后，镉耐受型突变酵母。
10、菌就会生长，而大量无义突变酵母菌则死亡，从而诱变并筛选得到镉耐受型突变酵母菌。0015以下通过实施例进一步对本发明进行描述0016实施例10017亚硝酸诱变与第一次筛选将菌落数为1106个/ML的热带假丝酵母菌1ML接种于100ML液体葡萄糖蛋白胨中，放入250ML带硅胶塞的三角瓶中，200R/MIN振荡培养14H后。离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液。加入玻璃球振荡分散，以脱脂棉过滤，使形成单细胞，分散程度达9095。取菌悬液1ML106CELLS/ML，PH45醋酸缓冲液1MOL/L2ML及01MOL/L亚硝酸钠溶液1ML于培养皿中，最后亚硝酸的处理浓度为0025MOL/L，于2526恒。
11、温10MIN，进行诱变反应。诱变结束后，加入007MOL/L、PH86的磷酸氢二钠溶液20ML，使PH值下降至68左右，以终止诱变反应。取诱变后的酵母菌01ML，将菌液涂在含镉009MMOL/L的浓度梯度平板上，培养基平板成分为葡萄糖20G，蛋白胨20G，酵母膏10G，琼脂20G，在平板上生长的菌落即为初次诱变成功的能耐受镉的突变酵母菌。0018第二次筛选对第一次诱变成功的能耐受镉的初次突变酵母菌和出发菌热带假丝酵母菌进行预培养。将菌落数为1106个/ML的初次突变酵母菌1ML接种于100ML的葡萄糖蛋白胨液体培养基中，接种两份，一份含009MMOL/L的镉，另一份不含镉。分别放入250ML三。
12、角瓶中，200R/MIN振荡培养14H。在分光光度计上测定两份摇瓶中微生物的OD600值，计算镉对突变耐受微生物的致死率，其中致死率ODCKODCD/ODCK，ODCK代表菌株在不含镉培养基中的OD600值，ODCD代表菌株在含镉培养基中的OD600值。按照上述步骤将出发菌接种后，也进行摇瓶培养14H后，计算镉对出发菌的致死率。比较初次突变酵母菌和出发菌的致死率大小，挑选致死率小于出发菌的突变酵母菌，即为高效耐镉突变酵母菌。将第二次筛选出的耐镉突变酵母菌进行遗传稳定性试验，共转接10代，证明其是否是遗传稳定的耐镉突变酵母菌。0019实例20020将菌落数为1106个/ML的耐镉突变酵母菌C44和出发菌，接种于100ML的含镉08MMOL/L的牛肉膏蛋白胨培养基中，在200R/MIN振荡培养14H后，C44突变酵母菌可以生长，而出发菌无法生长。0021最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不说明书CN101955927A3/3页5限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。说明书。