一种体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法.pdf

本发明是一种体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，具体是一种草鱼呼肠孤病毒GCRV核心与杆状病毒表达系统表达外衣壳蛋白VP5和VP7的体外组装的方法，该方法包括增殖GCRV873、含有核酸的病毒核心的获取及离心纯化、外衣壳蛋白VP5和VP7的表达、体外组装和离心纯化步骤。该方法简单、操作方便，其制备的纯化的体外组装病毒粒子R-GCRV为研究VP5及VP7介导的病毒侵染宿主细胞的机制提供了有效工具。

1.  一种体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，其特征是一种草鱼呼肠孤病毒GCRV核 心与杆状病毒表达系统表达外衣壳蛋白VP5和VP7的体外组装的方法，该方法包括以下 步骤：
(1)增殖GCRV873：
采用草鱼肾细胞系即CIK细胞增殖GCRV873，GCRV873是草鱼呼肠孤病毒湖南邵阳 株；
(2)含有核酸的病毒核心的获取及离心纯化：
采用胰蛋白酶处理纯化的病毒，以降解外衣壳蛋白VP5和VP7，获得含有核酸的病 毒核心，并采用氯化铯CsCl密度梯度进行离心纯化；
(3)外衣壳蛋白VP5和VP7的表达：
采用重组杆状病毒vAcGCRV-VP5/VP7感染昆虫细胞系即Sf9细胞进行外衣壳蛋白 VP5和VP7大量表达；
(4)破碎细胞：
将收集的表达外衣壳蛋白VP5和VP7的Sf9细胞进行冻融处理，以破碎细胞；
(5)体外组装：
将纯化的GCRV核心与在Sf9细胞中表达的外衣壳蛋白VP5和VP7按照合适的化学 计量比进行混合孵育，实现GCRV的体外组装；
(6)离心纯化：
采用CsCl密度梯度对体外组装后的病毒颗粒进行离心纯化，得到纯化的体外组装 病毒粒子R-GCRV，其为具有感染性的体外组装草鱼呼肠孤病毒颗粒。

2.  根据权利要求1所述的体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，其特征是体外组装 草鱼呼肠孤病毒颗粒，其所用核心颗粒浓度或颗粒数应达到1.2mg/mL或10¹²个/mL。

3.  根据权利要求1所述的体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，其特征是采用Sf9 细胞大量表达外衣壳蛋白VP5和VP7后，其细胞数应达到10⁷个/mL。

4.  根据权利要求1所述的体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，其特征在于体外组 装过程是：采用10mmol/L磷酸盐缓冲液PBS将纯化的病毒核心稀释成浓度1mg/mL或 颗粒数约为10¹⁰个/mL，将vAcGCRV-VP5/VP7感染的Sf9细胞稀释成细胞数为10⁶个/mL。

5.  根据权利要求1所述的体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，其特征在于将 vAcGCRV-VP5/VP7感染的Sf9细胞经-80℃及37℃反复冻融3次，4000g离心15min沉 淀细胞碎片。

6.  根据权利要求1所述的体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，其特征在于取含有 VP5/VP7蛋白的上清液与纯化的病毒核心进行混合，28℃孵育3h，完成体外组装。

7.  根据权利要求1所述的体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，其特征在于离心纯 化时，采用30-50％CsCl密度梯度离心进行体外组装病毒的纯化，大约在40％CsCl密度 梯度中获得大量体外组装的重组病毒完整颗粒R-GCRV。

8.  根据权利要求1所述的体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，其特征在于采用空 斑分析法对R-GCRV的感染性进行测定。

9.  根据权利要求1所述的体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，其特征在于采用20 mM NH₄Cl进行阻断实验，对R-GCRV与原始病毒N-GCRV的感染性差异进行分析，以 验证二者的感染途径。

10.  根据权利要求1所述的体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，其特征在于将纯化 的病毒核心与在Sf9细胞中表达外衣壳蛋白VP5和VP7按照最适的化学计量比混合孵育， 其二者比例不能低于10¹⁰:10⁶/mL。

一种体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法
技术领域
本发明涉及病毒学领域，特别是一种采用纯化的草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)核心与采用杆状病毒表达系统表达的外衣壳蛋白VP5和VP7进行体外重组形成完整 病毒颗粒的方法。所用病毒株为草鱼呼肠孤病毒湖南邵阳株GCRV873，已由中国典型培养物 保藏中心保藏，保藏日期是2004年7月23日，保藏编号是CCTCC NO：V200414。
背景技术
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的淡水养殖鱼类之一，在幼苗时易感染草鱼 呼肠孤病毒，该病毒可引暴流行性草鱼出血病，并造成大批草鱼鱼苗死亡，给淡水养殖业造 成严重的经济损失。对于病毒侵染机制的研究有利于找到抗病毒药物作用的靶点，为抗病毒 药物的研制及病毒性疾病的预防提供有效途径。GCRV是由双层衣壳组成的无囊膜病毒，内 衣壳包括VP1-VP4和VP6五种蛋白，而外衣壳由VP5和VP7异源三聚体复合物组成。不同 于囊膜病毒采用膜融合进入细胞的途径，GCRV的早期感染可能与外衣壳蛋白VP5和VP7介 导的膜渗透有关，但对其进入细胞的分子机制知之甚少。
目前，结构生物学数据已经显示外衣壳蛋白VP5和VP7在GCRV侵染过程中有着重要 功能，鉴于GCRV基因组是由11条分段的双链RNA组成，与其他双链分段RNA病毒一样， 目前尚无法利用反向遗传学即通过基因水平的改变来实现对蛋白功能的研究，限制了对外衣 壳蛋白在GCRV侵染过程中介导的膜渗透机制的研究，故有必要提供一种能有效地从分子水 平揭示外衣壳蛋白VP5和VP7所介导的GCRV侵染机制的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的问题，本研究提供一种体外组装草 鱼呼肠孤病毒制备方法，以便为从分子水平揭示GCRV侵染的分子机制及抗病毒药物的研发 以及为草鱼出血病防治开辟新的有效途径。
本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：
本发明提供的体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，是一种草鱼呼肠孤病毒GCRV核心与杆 状病毒表达系统表达外衣壳蛋白VP5和VP7的体外组装的方法，该方法包括以下步骤：
(1)增殖GCRV873：
采用草鱼肾细胞系即CIK细胞增殖GCRV873，GCRV873是草鱼呼肠孤病毒湖南邵阳株；
(2)含有核酸的病毒核心的获取及离心纯化：
采用胰蛋白酶处理纯化的病毒，以降解外衣壳蛋白VP5和VP7，获得含有核酸的病毒核 心，并采用氯化铯(CsCl)密度梯度进行离心纯化；
(3)外衣壳蛋白VP5和VP7的表达：
采用重组杆状病毒vAcGCRV-VP5/VP7感染昆虫细胞系即Sf9细胞，以进行外衣壳蛋白VP5 和VP7的大量表达；
(4)体外组装：
将纯化的GCRV核心与在Sf9细胞中表达的外衣壳蛋白VP5和VP7按照合适的化学计量比 进行混合孵育，实现GCRV的体外组装；
(5)离心纯化：
采用CsCl密度梯度对体外组装后的病毒颗粒进行离心纯化，得到纯化的体外组装病毒粒 子(R-GCRV)，其为具有感染性的体外组装草鱼呼肠孤病毒颗粒。
所述的体外组装草鱼呼肠孤病毒颗粒，其所用核心颗粒浓度或颗粒数应达到1.2mg/mL 或10¹²个/mL。
采用Sf9细胞大量表达外衣壳蛋白VP5和VP7后，其细胞数应达到10⁷个/mL。
体外组装过程是：采用10mmol/L PBS(磷酸盐缓冲液)将纯化的病毒核心分别稀释成 浓度为0.8-1.2mg/mL或颗粒数约为10⁸-10¹²个/mL，将vAcGCRV-VP5/VP7感染的Sf9细胞 分别稀释成细胞数为10⁵-10⁷个/mL，其稀释的细胞经冻融后，将二者按照不同的化学计量比 进行混合，28℃孵育3h，完成体外组装。
离心纯化时，采用30-50％CsCl密度梯度离心进行体外组装病毒的纯化，大约在40％CsCl 密度梯度中获得大量体外组装的重组病毒完整颗粒。
本发明可以采用空斑分析法对R-GCRV的感染性进行测定。
本发明采用20mM NH₄Cl进行阻断实验，对R-GCRV与N-GCRV的感染性进行分析， 以验证二者的感染途径。
本发明将纯化的病毒核心与在Sf9细胞中表达外衣壳蛋白VP5和VP7至少按照10¹⁰:10⁶个/mL比例混合孵育。
本发明与现有技术相比，具有以下主要优点：
其一.此方法简单、操作方便，有效克服了分段基因组病毒难于实施反向遗传学操作技 术的局限性；
其二.此方法包装效率高，将外衣壳蛋白VP5和VP7与纯化的GCRV核心按照最适化学 计量比混合孵育，可获取大量具有较高感染性的R-GCRV；
其三.实验证实R-GCRV与N-GCRV具有相同的感染机制，该体外组装病毒方法将成为 研究GCRV侵染机制的一个有效工具。
附图说明
图1是空斑实验测定体外重组病毒的感染性示意图。
图中：A行1、2列为R-GCRV感染CIK细胞的结果，为实验组；3、4列为GCRV核心 感染CIK细胞的结果，为阴性对照组；
B行1、2列为N-GCRV感染CIK细胞的结果，为阳性对照组；3、4列为VP5和VP7 的细胞裂解液上清感染CIK细胞的结果，为阴性对照组。
从图中可以看出R-GCRV及N-GCRV感染CIK贴壁细胞后，培养皿底部出现了很多明 显的分布均匀的空斑或空洞(图A,B；1、2列)，表明R-GCRV感染CIK细胞后，病毒可 以在敏感细胞中复制，导致细胞裂解产生空斑。这一感染特征与N-GCRV一样。而图中A行、 B行的3、4列为采用GCRV核心及表达VP5和VP7的细胞裂解液上清感染CIK细胞，无空 洞产生，表明细胞未能受到感染。
具体实施方式
本发明提供的体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，是在已实现了利用杆状病毒表达系统 大量表达GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7基础上进行的(专利号：200710168642.2)。采用表 达的外衣壳蛋白VP5和VP7与纯化的GCRV核心进行体外组装，由此获得具有感染性的重 组病毒颗粒。此方法可用于研究外衣壳蛋白VP5和VP7在GCRV侵染宿主细胞过程中的作 用，从而揭示GCRV侵染的分子机制。
本发明提供的上述体外组装草鱼呼肠孤病毒制备方法，包括以下步骤：
(1)采用CIK细胞(草鱼肾细胞系)进行病毒增殖，获得大量感染CIK细胞的草鱼呼 肠孤病毒湖南邵阳株GCRV873的病毒悬液；
(2)通过离心法，对感染了GCRV873的细胞病毒悬液进行浓缩和纯化；
(3)采用胰蛋白酶处理纯化的病毒，使完整病毒外衣壳蛋白VP5和VP7完全降解，形 成含有核酸的病毒核心颗粒，通过25-55％(w/v)CsCl密度梯度离心纯化，在50％CsCl梯 度溶液中得到大量的病毒核心颗粒；
(4)采用重组杆状病毒vAcGCRV-VP5/VP7感染Sf9细胞，大量表达外衣壳蛋白VP5 和VP7；
(5)将vAcGCRV-VP5/VP7感染的Sf9细胞经-80℃及37℃反复冻融3次，4000g离心 15min沉淀细胞碎片；
(6)将纯化的病毒核心与杆状病毒表达系统大量表达的外衣壳蛋白VP5和VP7细胞裂 解液上清按照不同化学计量比进行混合孵育，28℃孵育3h，完成体外组装；
(7)采用30-50％(w/v)CsCl密度梯度离心纯化，在大约40％CsCl梯度中得到大量纯 化的R-GCRV颗粒；
(8)采用电镜技术，SDS-PAGE及空斑测定，进行R-GCRV形态结构、蛋白组分及感染 性分析。结果表明，R-GCRV与N-GCRV在形态结构、蛋白组分和感染性等方面极为相似。
下面结合实施例对上述制备方法作进一步说明。
一.GCRV873的增殖及核心制备
采用CIK细胞(草鱼肾细胞系)进行GCRV873增殖。
1.CIK细胞培养：
细胞培养液为含10％胎牛血清的Eagle's MEM培养基(MEM-10,Invitrogen公司产品)， PH 7.2。取液氮中保存的CIK细胞，37℃温育融化。在台式离心机上以5000g离心1min后 转移至T25细胞培养瓶(Corning公司产品)中，加5mL的MEM-10培养液进行培养。CIK 细胞最适培养温度为28℃，待细胞基本铺满培养瓶底后，采用0.25％的胰蛋白酶消化贴壁细 胞，进行传代培养。
2.GCRV873的增殖：
传代的CIK细胞基本铺满培养瓶底时进行接毒，首先用10mmol/L磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered salient,简称PBS)将预接种的CIK细胞冲洗2-3次，以除去牛血清蛋白 组分；然后将GCRV悬液用无血清的MEM稀释后，按照病毒的感染复数MOI(Multiplicity of  infection)约为1PFU/cell加入适当培养体积的病毒悬液至单层细胞培养瓶中，吸附细胞30min 后倒掉上清液，再用10mmol/L PBS清洗细胞2-3次，去除未吸附的病毒粒子。随后加入约 1/10细胞瓶体积的含2％胎牛血清的MEM(MEM-2)维持液进行病毒增殖。待85％左右的细 胞产生细胞病变(cytopathic effect,CPE)后，收集病毒悬液，于4℃保存备用。
3.GCRV873的纯化：
将4℃保存的病毒悬液，以3800g低速离心30min，除去游离的细胞碎片。将除去细胞 碎片的病毒悬液置超速离心机(Beckman公司产品)以100,000g超速离心2h,沉淀GCRV873 颗粒。弃上清液，沉淀按1:250倍体积溶于10mmol/L PBS中。随后在台式离心机上再以12,000 g高速离心5min，除去残余的细胞碎片。
4.GCRV873的核心制备：
将胰蛋白酶(Sigma公司产品)加入到纯化的病毒悬液中，其工作浓度为200μg/mL，在 28℃水浴锅中孵育2h，使病毒外衣壳蛋白成分完全降解。然后经25-55％(w/v)的CsCl密 度梯度以200,000g超速离心4h，在50％CsCl梯度溶液中取出含有大量GCRV873核心的样 品，经10mmol/L PBS透析过夜得到纯净的病毒核心粒子。采用分光光度计(美国Biotek公 司产品)测定纯化的病毒核心浓度或粒子数。经测定，纯化的GCRV873核心颗粒浓度约为 1.2mg/mL或颗粒数约为1×10¹²个/mL，其样品于-20℃保存备用。
二.杆状病毒表达系统大量表达外衣壳蛋白VP5和VP7
采用Sf9细胞(昆虫细胞系)进行外衣壳蛋白VP5和VP7的大量表达。
Sf9细胞培养液为含10％胎牛血清的Grace培养基(Grace-10，Invitrogen公司产品)，pH 6.5。
1.Sf9细胞培养：
取液氮中保存的Sf9细胞，37℃温育融化。在台式离心机上以5000g离心1min后转移 至T25培养瓶中(Corning公司产品)，加入5mL Grace-10培养液进行培养。Sf9细胞最适培 养温度为28℃，待培养细胞基本铺满培养瓶底后，采用玻璃弯管轻轻吹打贴壁细胞，进行传 代培养。
2.外衣壳蛋白VP5和VP7的大量表达：
传代Sf9细胞在细胞瓶底铺满单层后，首先用10mmol/L PBS将预接种的细胞冲洗2-3 次，除去牛血清蛋白组分；然后按病毒的感染复数MOI约为5PFU/cell加入适当培养体积的 vAcGCRV-VP5/VP7悬液，吸附细胞30min后，倒掉未吸附的重组病毒悬液，再用10mmol/L  PBS清洗细胞2-3次，以彻底去除未吸附的病毒颗粒。然后加入约1/10细胞瓶体积的含2％ 胎牛血清的Grace(Grace-2)维持液进行病毒增殖。培养48h后，加入Aprotinin(抑肽酶， Sigma公司产品)和Leupeptin(亮抑蛋白酶，Sigma公司产品)蛋白酶抑制剂至终浓度各为 0.5μg/ml。在病毒感染72h后，将培养上清与感染细胞一起收集到50mL离心管中，以3800 g离心30min沉淀细胞，将其沉淀的细胞溶于适量体积的PBS中。采用细胞计数仪(美国 Bio-Rad公司产品)测定表达外衣壳蛋白VP5和VP7的细胞数。经测定，表达VP5和VP7的 细胞数为10⁷个/mL，于-80℃保存备用。经冻融，可获得含有大量表达外衣壳蛋白VP5和VP7 的细胞裂解液。
三.纯化的GCRV873核心与外衣壳蛋白VP5和VP7的体外组装
采用10mmol/L PBS将纯化的浓度约为1.2mg/mL或颗粒数为1×10¹²个/mL病毒核心分 别稀释成浓度为0.8-1.2mg/mL或颗粒数约为10⁸-10¹²个/mL；此外，将vAcGCRV-VP5/VP7 感染的Sf9细胞分别稀释成细胞数为10⁵-10⁷个/mL，经-80℃及37℃反复冻融3次，4000g离 心15min沉淀细胞碎片。然后将不同稀释倍数的病毒核心与不同稀释倍数的细胞裂解液上清 按照不同的化学计量比进行混合，在28℃孵育组装，每隔半小时进行手动缓慢摇匀，直到3h 后完成体外重组。采用30-50％(w/v)CsCl密度梯度离心分离纯化，获得纯化的重组病毒粒 子(R-GCRV)。采用空斑实验测定不同化学计量比混合后组装得到的R-GCRV的感染性。结 果表明，10¹⁰个病毒核心颗粒数与10⁶个共表达VP5和VP7蛋白的细胞裂解液上清孵育反应， 即至少按照10¹⁰:10⁶/mL化学计量比进行体外孵育组装时，可得到具有较高感染性的R-GCRV， 与原始的病毒粒子(N-GCRV)具有几乎相同的病毒滴度。
四.R-GCRV的生物学特性分析
1.采用电镜技术对分离纯化的R-GCRV进行形态鉴定。取3μL经CsCl密度梯度离心分离 纯化的R-GCRV滴于喷有碳膜的铜网上，室温下吸附病毒3-5min后用滤纸条吸干。然后用 2％的磷钨酸(pH6.9)负染约1min左右，再用滤纸吸去多余的染料，放置空气中干燥。在 Hitachi 7000-FA透射电子显微镜下观察。结果表明R-GCRV与N-GCRV在透射电镜下形态极 为相似，均为正二十面体的双层衣壳病毒粒子，直径约为75nm。
2.采用10％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术进行R-GCRV蛋白组分分析， 经考马斯亮蓝染色后可显示目的蛋白条带。结果表明，R-GCRV与N-GCRV含有完全相同的 蛋白组分，均含有完整的7种结构蛋白(VP1-VP7)。
3.采用空斑实验测定R-GCRV的感染性，实验中同时设置了N-GCRV为阳性对照，纯化 的GCRV核心与表达VP5和VP7的细胞裂解液上清作为阴性对照。
结果如图1所示，与N-GCRV相似，R-GCRV感染CIK细胞产生典型的空斑，而病毒核 心或表达VP5和VP7的细胞裂解液上清感染的细胞并未产生明显的空斑。
4.采用20mM NH₄Cl进行R-GCRV与N-GCRV的感染阻断实验，结果显示，R-GCRV与 N-GCRV感染细胞的能力都在加入弱碱NH₄Cl后受到极大抑制，表明二者采用了相同的感染 途径。
上述实施例中，采用Sf9昆虫细胞系增殖重组的GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7的重组杆 状病毒(vAcGCRV-VP5/VP7)，其构建方法参见“表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的重组杆 状病毒及其构建”专利文献(专利号：200710168642.2)，该方法主要是：通过RT－PCR扩 增，分别得到2条编码GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7基因的特异片段；通过基因克隆筛选 获得插入了GCRV VP5与VP7基因的重组pFastBacdual双表达载体pFbDGCRV-VP5/VP7； 将筛选得到的重组双表达载体转化DH10Bac细胞，得到转座的AcGCRV-VP5/VP7Bacmid； 并将其转染Sf9昆虫细胞，在Sf9昆虫细胞中获得重组病毒vAcGCRV-VP5/VP7。