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1、(10)授权公告号 CN 101812517 B (45)授权公告日 2012.09.05 CN 101812517 B *CN101812517B* (21)申请号 201010028986.5 (22)申请日 2010.01.18 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 1/04(2006.01) C12R 1/77(2006.01) (73)专利权人 华中农业大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街 1 号 (72)发明人 廖玉才 李和平 李旭 瞿波 张静柏 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 。
2、CN 1459226 A,2003.01.28,说明书及权利要 求书 . US 79584904 A,2004.03.08, 说明书及权利 要求书全文 . Bernardo A et al.Fusarium graminearum-induced changes in gene expression between fusarium head blight-resistant and susceptible wheat cultivars .Funct Integr Genomics .2007, 第 7 卷 ( 第 1 期 ),249-257. 余桂红 等 .分子标记在小麦抗赤霉病辅助 育种。
3、中的应用 .江苏农业学报 .2006, 第 22 卷 ( 第 3 期 ),189-191. (54) 发明名称 一种小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记 (57) 摘要 本发明属于植物抗病育种领域， 具体涉及一 种小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记的制备 及应用。 本发明的特征是， 通过自行设计的一对引 物， 从小麦基因组扩增出 CYP709C1 基因的特异片 段， 以该基因的特异性片段制备小麦赤霉病穗腐 和苗腐抗性的分子标记。 检测分析表明， 该基因的 相对表达量与植物的抗赤霉病和苗腐病抗性紧密 相关。本发明仅仅采用一个分子标记， 即可鉴定 不同小麦品种的在苗期和花期的小麦赤霉病穗腐 和苗腐的。
4、抗性水平。本发明的分子标记可应用于 小麦抗赤霉病苗腐和穗腐材料的筛选及分子育种 上。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 杨莹跃 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 小麦 CYP709C1 基因的特异片段作为小麦赤霉病苗腐及穗腐分子标记的应用， 所述 CYP709C1 基因的特异片段的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 1 所示， 序列全长为 171bp。 2. 用于扩增权利要求 1 所述基因的特异片段的引物对， 它的核苷酸序列如序。
5、列表 SEQ ID NO ： 2 和 3 所示。 3. 一种鉴定小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性水平的分子标记的方法， 其步骤包括 ： 1) 在温室中分别用亚洲镰刀菌或脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素接种扬花期的小麦以及苗 龄为3天的小麦幼苗的胚芽鞘， 亚洲镰刀菌接种的72h取材， 脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素接种 的 24h 取材 ； 2)将步骤1)得到的材料在液氮中研磨成粉末， 用Trizol法抽提RNA， 去除基因组DNA， 逆转录得到 cDNA 样品 ； 2) 用序列表 SEQ ID NO ： 2-5 所示的引物对对步骤 2) 所述的 cDNA 样品进行实时定量 PCR 分析， 扩增获得 CYP709C1 基。
6、因的特异片段， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 1 所示 ； 4) 根据实时定量 PCR 数据分析在接种镰刀菌的穗子和幼苗中 CYP709C1 基因相对于水 处理对照的表达量， 用来辅助鉴定小麦品种的赤霉病或苗腐病的抗性水平 ； 上述步骤 4) 的 PCR 步骤是 ： 1) 扩增反应体系 ： 在 25l PCR 反应液中， 含有 12.5l 的 Sybr Greeen I 染料 PCR 预混缓冲液， 10l 模板 cDNA， 按体积比为 1 10 稀释 ； 10pmol/l 的 SEQ ID NO ： 2-3 或 SEQ ID NO ： 4-5 所示的引物对各 0.5l， 补水至。
7、 25l ； 2) 实时定量 PCR 反应条件 ： 95 4min ； 94 15s， 62 20s， 72 20s， 40 个循环， 读板 温度 72 30s. 绘制融解曲线分析 PCR 反应中的非特异性扩增， 反应程序如下 ： 95 20s， 55 10s， 以 0.5 /10s 的速率升温至 95 ； 3) 反应完成后， 利用 IQ5 软件及相对定量分析方法分析 CYP709C1 基因的相对 表达量。 4. 检测小麦品种赤霉病苗腐及穗腐抗性水平的引物对， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 3 所述。 权 利 要 求 书 CN 101812517 B 。
8、2 1/8 页 3 一种小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记 技术领域 0001 本发明属于植物分子标记技术领域， 具体涉及一种小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的 分子标记。 背景技术 0002 由镰刀菌在花期和苗期分别引起的赤霉病穗腐 (Fusarium head blight， FHB) 和 苗腐 (Fusarium seedling blight， FSB) 是在世界范围内严重危害麦类作物的重要病害之 一。它不仅造成产量损失和质量下降， 而且产生单端孢霉烯毒素严重危害人畜健康。赤霉 病发病时， 穗子上产生红色霉层， 聚集大量的镰刀菌毒素。同时， 镰刀菌真菌在种子萌发后 会侵染幼苗， 引起苗腐， 并。
9、在幼苗发育的各个时期持续发生， 但是症状较花期轻。苗腐可以 为花期赤霉病穗腐提供病原菌， 同种的F.graminearum或F.culmorum都可以引起小麦赤霉 病穗腐或苗腐。 0003 赤霉病没有天然抗源， 传统的赤霉病抗性品种筛选主要集中在花期接种鉴定， 受 季节限制， 工作量大且受自然条件影响较大。 离体接种鉴定较花期接种更为简便， 但是其结 果往往不稳定。随着分子生物学的发展， 赤霉病抗病小麦育种在传统育种的基础上以得到 了很好的发展， 例如利用分子标记技术可以用来检测不同品种的抗性 QTL 位点， 并将这些 分子标记用于抗病材料育种， 但是一个分子标记往往只能代表一个发育时期的抗性。
10、， 即有 报道表明花期赤霉病穗腐抗性与苗腐抗性 QTL 不在同一位点， 说明赤霉病穗腐和苗腐的抗 病途径并不一致。因此需要发明一种更为快速， 稳定且受环境影响小的花期和苗期通用抗 性分子标记， 为抗赤霉病穗腐及苗腐小麦育种提供基础。 0004 小麦幼苗与禾谷镰刀菌互作的机制与花期的抗性机制不一致， 而且还存在着抗性 转换， 即花期表现为赤霉病穗腐抗性的品种在苗期却表现为感病， 例如苏麦3号(来源于中 国江苏省农业科学院 )， 而苗期的抗苗腐品种在花期可能表现为感穗腐， 例如安农 8455( 来 源于中国安徽农业大学 )。这种现象给苗腐及穗腐双抗材料的筛选带来了一定的困难。目 前的研究主要单独集。
11、中在花期抗性或苗期抗性， 例如研究表明花期赤霉病穗腐抗性 QTL 位 点位于染色体的 3BS， 5AS， 3AS(Anderson J.A.et al.2007.Marker-assisted selection for Fusarium head blightresistance in wheat.International Journal of Food Microbiology.119 ： 51-53)， 苗期苗腐抗性位点则位于染色体 5B， 在花期抗病 QTL 定位中则 没有发现过该位点 (Tamburic-Ilincic， L.et al.2009.Different quantit。
12、ative trait loci for Fusarium resistance in wheat seedlings and adult stage in theWuhan/ Nyubai wheat population.Euphytica 165 ： 453-458)。 因此花期的赤霉病穗腐抗病QTL位 点不能用于苗期的抗病育种中去。 基于以上的研究发现还不能满足全生育期抗赤霉病穗腐 和苗腐小麦育种的要求。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺限和不足， 制备一种小麦赤霉病穗腐和 说 明 书 CN 101812517 B 3 2/8 页 4 苗腐抗性的分子标记， 以适。
13、用于小麦稳定的花期和苗期通用抗赤霉病分子标记， 用于检测 及辅助选择小麦抗苗腐和穗腐的双抗品种。 0006 本发明是这样实现的 ： 利用 Genbank 中已经公开发表的小麦 CYP709C1 基因序 列 (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY641449.1 ？ ordinalpos 1&itool EntrezSystem2.PEntrez.Sequence.Sequence_ResultsPanel.Sequence_RVDocSum)，设 计 一对特异性引物 ( 该引物对的核苷酸序列见序列表 SEQ ID NO ： 2-3 所示， 或参阅 具体实 。
14、施方式 的描述 )， 经过实时定量 PCR 分析分别比较不同小麦品种在接种过镰刀菌或脱氧雪 腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol， 简称DON)处理的幼苗和穗子中CYP709C1基因的表达量差 异。具体步骤如下 ： 0007 CYP709C1 基因片段作为一种鉴定小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记的应用， 它的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 1 所示， 序列全长为 171bp。 0008 扩增上述 CYP709C1 基因的引物对的核苷酸序列如下 ( 以序列表 SEQ ID NO ： 2-3 表示 ) ： 0009 正向引物 ： 5 -3 TGGCATCAAAGTGACCGAA。
15、GG， 0010 反向引物 ： 5 -3 GGCCCACTGGAGAAAGACAAT。 0011 上述 CYP709C1 基因片段的内参 -actin 基因的引物对的核苷酸序列如下 ( 以序 列表 SEQ IDNO ： 4-5 所示 )。 0012 正向引物 ： 5 -3 GCTGTTCCAGCCATCTCATGT， 0013 反向引物 ： 5 -3 CGATCAGCAATTCCAGGAAAC。 0014 申请人提供了一种小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记， 其步骤包括 ： 0015 1) 在温室中分别用镰刀菌或脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON) 毒素接种扬花期的小麦 以及苗龄为 3 天的小麦幼苗。
16、的胚芽鞘， 镰刀菌接种 72h 取材， DON 毒素处理的为 24h 取材 ； 0016 2) 将步骤 1) 得到的材料在液氮中研磨成粉末， 用 Trizol 法抽提 RNA， 去除基因组 DNA， 逆转录为 cDNA 样品 ； 0017 2) 用序列表 SEQ ID NO ： 2-5 所示的引物对对步骤 2) 所述的 cDNA 样品进行实时 定量 PCR 分析， 扩增获得 CYP709C1 基因的特异片段， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 1 所示 ； 0018 4) 根据实时定量 PCR 数据分析在接种镰刀菌的穗子和幼苗中 CYP709C1 基因相对 水处理对照的表达量， 用。
17、来辅助鉴定小麦品种的赤霉病穗腐或苗腐抗性水平。 0019 上述步骤 4) 的 PCR 具体步骤是 ： 0020 1) 扩增反应体系 ： 在 25l PCR 反应液中， 含有 12.5l 含 Sybr Green I 染料的 PCR预混缓冲液(购自日本Toyobo公司)， 10l模板cDNA， 体积比为110稀释 ； 10pmol/ l 的 SEQ ID NO ： 2-3 或 SEQ ID NO ： 4-5 所示的引物对各 0.5l， 补水至 25l ； 0021 2)实时定量PCR反应条件 ： 954min ； 9415s， 6220s， 7220s， 40个循环， 读 板温度 72 30s.。
18、 并通过绘制融解曲线来分析 PCR 反应中的非特异性扩增， 反应程序如下 ： 95 20s， 55 10s， 以 0.5 /10s 的速率升温到 95 ； 0022 3) 反应完成后， 利用 IQ5( 购自美国伯乐公司 ) 软件及 2-CT相对定量分析方法 (Livak， K.J.， and Schmittgen， T.D.2001.Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and the 2-CT Method.Methods 25 ： 402-408) 分析 说 明 书 CN 1018。
19、12517 B 4 3/8 页 5 基因相对表达量。 0023 很显然， 应用上面的技术方案， 本发明可以作为一种鉴定小麦赤霉病穗腐和苗腐 抗性的分子标记， 并可以应用于小麦抗病材料育种的辅助选择上。 0024 更详细的技术方案如下所述 ： 0025 1.1 孢子液制备 0026 将由华中农业大学麦类作物分子生物技术实验室从湖北武汉分离的亚洲镰刀菌 菌株5035(Qu， B等.2008.Geographic distribution and genetic diversity of Fusarium graminearum andF-asiaticum on wheat spikes thro。
20、ughout China.Plant Pathology 57(1) ： 15-24)接种到CMC液体培养基(配方 ： 羧甲基纤维素7.5g， 硝酸铵0.5g， 磷酸氢二钾 0.5g， 七水硫酸镁 0.25g， 酵母膏 0.5g， 加蒸馏水定容至 1L， 121高压灭菌 15min 后使用， pH 7.0) 中振荡培养 (25， 150r/min)5 天， 产生分生孢子后， 10000r/min 离心 10min， 弃上 清， 用无菌水洗去残留的 CMC， 血球计数板计数将分生孢子的浓度调为 5105个 /ml 左右， 用于接种试验。 0027 1.2 胚芽鞘及小穗接种 0028 按 武 爱 。
21、波 等 (Wu， A.B.2005.Comparative pathogenicity of Fusarium graminearum isolatesfrom China revealed by wheat coleoptile and floret inoculations.Mycopathologia 160 ： 75-83.) 描述方法用新鲜孢子液即上述 CMC 液体培养 基培养的孢子接种小麦胚芽鞘， 同时每一品种都以同样的方法接种， 对照不接种上述含有 新鲜孢子液的 CMC 液体培养基， 只接种无菌水。具体操作步骤是 ： 将小麦的种子用 0.1升 汞消毒 5min， 无菌水洗三次后再。
22、浸泡 2h， 均匀置于铺有双层滤纸 ( 无菌 ) 的塑料盒中， 每盒 放置 25-35 粒种子， 在培养温度 25， 相对湿度为 90 -100， 每天用 12h 光照培养， 光照 强度为 7000 勒克斯， 3 天后用灭菌剪刀快速剪去芽尖， 将蘸有上述孢子液 (5105个 /ml)、 20g/ml 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON) 毒素或无菌水的滤纸片分别接于去掉芽尖的胚芽鞘 上， 孢子液及无菌水接种 72h 揭掉纸片取整株， DON 毒素及无菌水处理 24h 同样揭掉纸片取 整株， 立即至于 -80冰箱保存。 0029 采用单小花定位定量分生孢子悬浮液注射接种， 即在小麦扬花初期， 用不锈钢。
23、剪 刀剪去麦芒及麦穗中部小穗的内外颖顶部少许， 用微量注射器注入 10l， 5105个 /ml 的 孢子液、 15l 1.5mg/ml 的 DON 毒素或 10l 无菌水对照， 每株接种 1 个小穗， 套透明塑料 袋保湿， 孢子液及无菌水接种72h后取接种小穗， DON毒素及无菌水处理24h后取接种小穗， 立即至于液氮中保存， 取回后置于 -80冰箱保存。 0030 1.3 总 RNA 提取及逆转录 0031 利用 Trizol 试剂 ( 购自美国 Invitrogen 公司 ) 提取总 RNA， 10 个小穗或幼苗为 一组， 液氮研磨后每管分约 0.1g， 加入 1ml 的 Trizol 试。
24、剂 ( 购自美国 Invitrogen 公司 )， 摇匀室温静置 10min ； 加入 200l 的三氯甲烷后立即剧烈摇晃 30s， 室温静置 5min ； 4， 12000r/m 离心 10min ； 取上清溶液转移置新的离心管中， 并加入等体积的异丙醇， 颠倒混匀 后室温静置 10min， 4， 12000r/m 离心 10min ； 弃上清， 沉淀用 70乙醇溶液洗一次， 4， 12000r/m 离心 5min 收集沉淀 ； 室温干燥后溶于 20l 的以 1 1000 体积比稀释的焦碳酸 二乙酯(DEPC)水中。 提取的总RNA首先用0.8的琼脂糖凝胶电泳初步检测其完整性， 然后 用紫外。
25、分光光度法测定 RNA 的得率 (OD260/OD280， Ratio， R)， R 值介于 1.8-2.2 之间时， 说 说 明 书 CN 101812517 B 5 4/8 页 6 明提取的 RNA 质量良好。利用 DNA 酶 I( 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ) 除去总 RNA 中 的基因组DNA。 反应体系如下 ： 购自宝生物工程(大连)有限公司的10倍的DNA酶I缓冲液 5l， DNA 酶 I 2l， RNA 酶抑制剂 (40U/ml)1l， 总 RNA 20l( 约 40g) 补水至 50l。 37反应 30min 后， 加入 50l 的 DEPC 水， 再加入等量的苯。
26、酚 / 氯仿 / 异戊醇 ( 体积比为 25 24 1)， 充分混匀， 12000r/m 离心 10min， 取上层移至新的离心管中， 加入等量的氯仿 /异戊醇(体积比为241)， 充分混匀， 12000r/m离心10min， 取上层移至新的离心管中， 加 入 1/10 体积的 3M 醋酸钠 (pH5.2) 和 2.5 倍体积的冷无水乙醇， -20放置 60min， 12000r/ m 离心 10min 回收沉淀， 每管加入 1ml 70的冷乙醇清洗沉淀， 12000r/m 离心 10min 收集 沉淀， 室温干燥后用 20l 的 DEPC 水溶解并进行凝胶电泳确认是否除去基因组 DNA。确 。
27、定获得高质量的 RNA 后， 利用 SuperScriptTM Reverse Transcriptase 试剂盒 ( 购自美国 Invitrogen 公司 ) 进行 cDNA 第一链的合成， 简述如下 ： Oligo(dT)15-18(100mg/l)3l， dNTPs(10mM)1l， 总RNA 6l(约5g)， 补无菌超纯水至13l， 65水浴5min， 立即置于 冰上至少1min ； 快速离心几秒后， 再加入SuperScriptTM Reverse Transcriptase试剂盒中 的以下反应混合液 ： 5倍第一链合成缓冲液4l， 二硫苏糖醇(0.1M)1l， 逆转录酶(200U/。
28、 l)1l， 以及购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司的 RNA 酶抑制剂 (40U/l)1l， 轻轻混 匀， 50温浴 45min 后 70加热 15min 使酶失活。 0032 1.4 荧光定量 -PCR(qRT-PCR) 0033 以 -actin( 序列登录号 ： AB181991) 作为内参基因， 实时定量 PCR 反应分析 CYP709C1基因相对表达倍数(CYP709C1基因及扩增引物对的核苷酸序列信息见序列表SEQ ID NO ： 1 和序列表 SEQ ID NO ： 2-3 所示 )。扩增反应体系 ： 在 25l PCR 反应液中， 含有 12.5l 含 SybrGreee。
29、n I 染料的 PCR 预混缓冲液 ( 购自日本 Toyobo 公司 )， 10l 模板 cDNA( 体积比为 1 10 稀释 )， 10pmol/l 的 SEQ ID NO ： 2-3 或 SEQ ID NO ： 4-5 所示的引 物对各 0.5l， 补水至 25l。扩增条件 ： 95 4min ； 94 15s， 62 20s， 72 20s， 40 个循 环， 读板温度 72 30s. 并通过绘制融解曲线来分析 PCR 反应中的非特异性扩增， 反应程序 如下 ： 95 20s， 55 10s， 以 0.5 /10s 的速率升温到 95。 0034 1.5 数据分析 0035 利 用 IQ。
30、5(bio-rad， USA) 软 件 和 2-CT相 对 定 量 分 析 方 法 (Livak， K.J.et al.2001.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-CTMethod.Methods 25 ： 402-408) 通过比较同一处理条件下小麦中的 CYP709C1基因与-actin基因的表达倍数差异来达到比较CYP709C1基因在接种亚洲镰刀 菌菌株 5035 小穗或幼苗相对接水对照小穗或幼苗样品中的相对表达倍数。花期 CYP709C1 基因在接种镰。
31、刀菌的小穗后相对与接水小穗中的相对表达量高于 200 倍的定义为赤霉病 穗腐抗性， 而在苗期接种镰刀菌的幼苗相对与接水幼苗中的相对表达量高于 30 倍的定义 为赤霉病苗腐抗性。 0036 本发明的有益的效果 0037 本发明通过设计一对特异引物， 即可以用于小麦赤霉病穗腐和苗腐的通用分子标 记。附图 2A 显示， 亚洲镰刀菌菌株 5035 侵染花期抗赤霉病穗腐品种苏麦 3 号 ( 来源于中 国江苏省农业科学院)小穗72h后， CYP709C1基因的表达量是接水对照的464倍， 而在同样 条件下， 该 CYP709C1 基因在花期感赤霉病穗腐品种安农 8455( 来源于中国安徽农业大学 ) 说 。
32、明 书 CN 101812517 B 6 5/8 页 7 小穗中的表达量是接水对照的66倍。 在小麦胚芽鞘接种后进行相似的比较， 如附图2B所示 苗期抗苗腐品种安农 8455 在接种 72h 后的相对表达量为接水对照的 58 倍， 然而在相同的 接种时间点， 苗期感苗腐品种苏麦3号中该基因的相对水对照的表达量为0.7倍。 进一步分 析发现花期抗赤霉病穗腐品种苏麦 3 号相对于花期感赤霉病穗腐品种安农 8455， CYP709C1 基因的相对表达量的倍数变化为 7.1 倍， 而苗期抗苗腐品种安农 8455 中， CYP709C1 基因的 相对表达量变化是苗期感苗腐品种苏麦 3 号的 83.9 倍。
33、 ( 见表 1)。图 2C 显示花期抗赤霉病 穗腐品种苏麦 3 号中 CYP709C1 基因在 DON 诱导 24h 后相对于水对照的诱导表达量达 2229 倍， CYP709C1 基因在花期感赤霉病穗腐品种安农 8455 中相对与水对照的表达量为 995 倍。 在 DON 毒素处理小麦幼苗后， CYP709C1 基因在苗期抗苗腐品种安农 8455 相对水处理的转 录聚集量为 158 倍， 而在苗期感苗腐品种苏麦 3 号中， 该基因的相对聚集量则为 68 倍。同 样， DON 诱导 CYP709C1 基因的模式与抗性反应显著相关。因此 CYP709C1 基因的快速和大 量诱导与赤霉病穗腐和苗腐。
34、抗性紧密相关。 0038 表 1 本发明中所用到的抗感小麦品种中 CYP709C1 基因的诱导表达量 0039 0040 表 1 说明 ： 利用定量 PCR 分析在受亚洲镰刀菌菌株 (5035) 或 DON 处理 24h 后的 小穗和幼苗中的 RNA 样品相对于对照的转录量。a表示接种后 72h ； b 表示处理后 24h， *P 0.05.， *P 0.01。 附图说明 0041 序列表 SEQ ID NO ： 1 是本发明克隆的小麦 CYP709C1 基因的特异片段的核苷酸序 列， 序列全长为 171bp。 0042 序列表 SEQ ID NO ： 2-5 是扩增小麦 CYP709C1 基。
35、因的特异片段的引物对的核苷酸 序列。 0043 图 1 ： 是本发明的技术流程图。 0044 图 2 ： 定量 PCR 分析亚洲镰刀菌菌株 5035 接种或毒素处理的小穗和幼苗中的 CYP709C1 基因的相对表达倍数。A 和 B， 在接种亚洲镰刀菌菌株 5035 后 CYP709C1 基因在小 穗和幼苗中的相对表达倍数 ； C， DON 处理小穗和幼苗 24h 以后 CYP709C1 基因的相对表达倍 数。相对表达倍数是指相对于水处理中表达倍数。 说 明 书 CN 101812517 B 7 6/8 页 8 具体实施方式 0045 实施例 1 花期抗赤霉病穗腐病品种苏麦 3 号和花期感赤霉病。
36、穗腐品种安农 8455 的抗性鉴定 0046 利用 Trizol 试剂 ( 购自美国 Invitrogen 公司 ) 提取总 RNA， 10 个小穗或幼苗为 一组， 液氮研磨后每管分约 0.1g， 加入 1ml 的 Trizol 试剂 ( 购自美国 Invitrogen 公司 )， 摇匀室温静置 10min ； 加入 200l 的三氯甲烷后立即剧烈摇晃 30s， 室温静置 5min ； 4， 12000r/m 离心 10min ； 取上清溶液转移置新的离心管中， 并加入等体积的异丙醇， 颠倒混匀 后室温静置 10min， 4， 12000r/m 离心 10min ； 弃上清， 沉淀用 70乙醇。
37、溶液洗一次， 4， 12000r/m 离心 5min 收集沉淀 ； 室温干燥后溶于 20l 的以 1 1000 体积比稀释的焦碳酸 二乙酯 (DEPC) 水中。提取的总 RNA 首先用 0.8的琼脂糖凝胶电泳初步检测其完整性， 然 后用紫外分光光度法测定 RNA 的得率 (OD260/OD280， Ratio， R)， R 值介于 1.8-2.2 之间时， 说明提取的 RNA 质量良好。利用 DNA 酶 I( 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ) 除去总 RNA 中的基因组 DNA。反应体系如下 ： 10 倍的 DNA 酶 I 缓冲液 5l， DNA 酶 I 2l， RNA 酶抑制 剂 。
38、(40U/ml)1l， 总 RNA 20l( 约 40g) 补水至 50l。37反应 30min 后， 加入 50l 的DEPC水， 再加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25241)， 充分混匀， 12000r/ m 离心 10min， 取上层移至新的离心管中， 加入等量的氯仿 / 异戊醇 ( 体积比为 24 1)， 充分混匀， 12000r/m 离心 10min， 取上层移至新的离心管中， 加入 1/10 体积的 3M 醋酸钠 (pH5.2) 和 2.5 倍体积的冷无水乙醇， -20放置 60min， 12000r/m 离心 10min 回收沉淀， 每管加入 1ml70的冷乙醇清洗沉淀，。
39、 12000r/m 离心 10min 收集沉淀， 室温干燥后用 20l 的 DEPC 水溶解并进行凝胶电泳确认是否除去基因组 DNA。确定获得高质量的 RNA 后， 利用 SuperScriptTMReverse Transcriptase试剂盒(购自美国Invitrogen公司)进行cDNA第一 链的合成， 简述如下 ： Oligo(dT)15-18(100mg/l)3l， dNTPs(10mM)1l， 总 RNA 6l( 约 5g)， 补无菌超纯水至 13l， 65水浴 5min， 立即置于冰上至少 1min ； 快速离心几秒后， 再加入以下反应混合液 ： SuperScriptTMRev。
40、erse Transcriptase 试剂盒内的 5 倍第一链合 成缓冲液 4l， 二硫苏糖醇 (0.1M)1l， 逆转录酶 (200U/l)1l 以及购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司的 RNA 酶抑制剂 (40U/l)1l， 轻轻混匀， 50温浴 45min 后 70加热 15min使酶失活。 以-actin(序列登录号 ： AB181991)作为内参照， 实时荧光定量PCR检测 CYP709C1 基因的相对表达量。扩增反应体系 ： 在 25l PCR 反应液中， 含有 12.5l Sybr Greeen I PCR 预混缓冲液 ( 购自日本 Toyobo 公司 )， 10l 模板 c。
41、DNA( 原液按 1 10 体积 比稀释)， 10pmol/lul序列表SEQ ID NO ： 2-3或4-5所示的引物对各0.5l， 补水至25l， 反应条件如下 ： 95 4min ； 94 15s， 62 20s， 72 20s， 40 个循环， 读板温度 72 30s。并 通过绘制融解曲线来分析 PCR 反应中的非特异性扩增， 反应程序如下 ： 95 20s， 55 10s， 以 0.5 /10s 的速率升温到 95。利用 IQ5( 购于美国伯乐公司 ) 软件和 2-Ct相对定量 分析方法分析 CYP709C1 基因在接种亚洲镰刀菌菌株 503572h 后以及 DON 处理 24h 后。
42、相对 于水对照的表达量。其发明效果如附图 2A 显示。亚洲镰刀菌菌株 5035 侵染花期抗赤霉病 穗腐品种苏麦 3 号小穗 72h 后， CYP709C1 基因表达量是水对照的 464 倍， 而在同样条件下， 该基因在花期感赤霉病穗腐品种安农 8455 小穗中的表达量是接水对照的 66 倍。花期抗赤 霉病穗腐品种苏麦3号相对于花期感赤霉病穗腐品种安农8455， CYP709C1基因的相对表达 说 明 书 CN 101812517 B 8 7/8 页 9 量的倍数变化为 7.1 倍。附图 2C 显示花期抗赤霉病穗腐品种苏麦 3 号经过 DON 处理 24h 后 CYP709C1 基因相对于水对照。
43、的诱导表达量达 2229 倍， 花期感赤霉病穗腐品种安农 8455 的表达量为 995 倍。很明显 CYP709C1 表达量在赤霉病穗腐抗病品种更高。 0047 实施例 2 苗期抗苗腐品种安农 8455 和苗期感苗腐品种苏麦 3 号的抗性鉴定 0048 将苏麦 3 号及安农 8455 小麦种子用 0.1升汞消毒 5min， 无菌水洗三次后浸泡 2h， 均匀置于铺有双层无菌滤纸的塑料盒中， 每盒放置 25-35 粒种子， 培养温度为 25， 相 对湿度为90-100， 每天进行12h光照培养， 光照强度为7000勒克斯， 培养3天后用灭菌 剪刀快速剪去芽尖， 将蘸有孢子液、 DON 毒素或无菌水。
44、的滤纸片接于去掉芽尖的胚芽鞘上， 孢子液及无菌水接种 72h 后揭掉纸片取整株， 用 DON 毒素及无菌水处理 24h 后同样揭掉纸 片取整株， 立即置于 -80冰箱保存。RNA 的提取， 逆转录及实时荧光定量 PCR 分析同实施 例1。 如附图2C显示， 苗期抗苗腐品种安农8455在接种72h后的相对表达量为水对照的58 倍， 然而在相同的接种时间点， 苗期感苗腐品种苏麦 3 号中该基因的相对表达量为水对照 的 0.7 倍， 苗期抗苗腐品种安农 8455 中， CYP709C1 基因的相对表达量变化是苗期感苗腐品 种苏麦 3 号的 83.9 倍 ( 表 1)， 苗期抗苗腐品种安农 8455 。
45、在 DON 处理 24h 后相对水处理的 转录聚集量为 158 倍， 苗期感苗腐品种苏麦 3 号的相对聚集量则为 68 倍。很明显 CYP709C1 表达量在苗腐抗病品种更高。发明效果如图 2B 显示。 0049 序列表 0050 华中农业大学 0051 一种小麦赤霉病穗腐和苗腐抗性的分子标记 0052 0053 2010-01-12 0054 5 0055 PatentIn version 3.1 0056 1 0057 171 0058 DNA 0059 赤霉病菌 (Fusarium head blight) 0060 0061 gene 0062 (1).(171) 0063 0064 。
46、1 0065 tggcatcaaa gtgaccgaag gcacgttcct aacgatcccc atcgcgacga tacatcgcga 60 0066 caaggaggtc tggggagaag atgccaacaa attcaagcct atgaggttcg agaatggagt 120 0067 gacaagggcc ggaaagcacc ccaatgcatt attgtctttc tccagtgggc c 171 0068 2 0069 21 0070 DNA 0071 赤霉病菌 (Fusarium head blight) 说 明 书 CN 101812517 B 9 8/8。
47、 页 10 0072 0073 primer_bind 0074 (1).(21) 0075 0076 2 0077 tggcatcaaa gtgaccgaag g 21 0078 3 0079 21 0080 DNA 0081 赤霉病菌 (Fusarium head blight) 0082 0083 primer_bind 0084 (1).(21) 0085 0086 3 0087 ggcccactgg agaaagacaa t 21 0088 4 0089 21 0090 DNA 0091 赤霉病菌 (Fusarium head blight) 0092 0093 primer_bin。
48、d 0094 (1).(21) 0095 0096 4 0097 gctgttccag ccatctcatg t 21 0098 5 0099 21 0100 DNA 0101 赤霉病菌 (Fusarium head blight) 0102 0103 primer_bind 0104 (1).(21) 0105 0106 5 0107 cgatcagcaa ttccaggaaa c 21 说 明 书 CN 101812517 B 10 1/2 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 101812517 B 11 2/2 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 101812517 B 12 。