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1、(10)授权公告号 CN 101892230 B (45)授权公告日 2012.07.04 CN 101892230 B *CN101892230B* (21)申请号 201010219679.5 (22)申请日 2010.06.28 C12N 15/113(2010.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 9/10(2006.01) (73)专利权人 中国人民解放军军事医学科学院 生物工程研究所 地址 100071 北京市丰台区东大街20号8所 8 室 (72)发明人 赵志虎 王洋 赵珺 (74)。
2、专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 (54) 发明名称 用于表达环形肽的表达盒及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种用于表达环形肽的表达盒 及其应用。 本发明提供了(a)或(b)或(c)的DNA 分子 ： (a) 序列 2 自 5 末端第 6 至 510 位核苷酸 所示的 DNA 分子 ； (b) 序列表的序列 2 所示的 DNA 分子 ； (c)将氯霉素乙酰基转移酶基因插入(a)或 (b)所述DNA分子的酶切位点得到的DNA分子。 本 发明提供的表达盒中， 含有分裂型 DnaE 内含肽， 设有外源基因的插入位点， 可以大大提高外源基 因的表达量。
3、。 本发明提供的的表达盒， 可以用于蛋 白环形突变体、 环肽小分子文库构建与表达的高 效表达载体， 为分裂型内含肽 DnaE 的体内外自我 剪接机制的研究、 小分子环肽文库的构建与筛选 等奠定了基础。 (51)Int.Cl. 审查员 张丽玮 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 9 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 9 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 如下 (a) 或 (b) 的 DNA 分子 ： (a) 序列表的序列 2 自 5 末端第 6 至 510 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； (b) 。
4、序列表的序列 2 所示的 DNA 分子。 2. 一种 DNA 分子， 为将氯霉素乙酰基转移酶基因插入序列表的序列 2 所示的 DNA 分子 的NdeI酶切位点和BamHI酶切位点得到的DNA分子 ； 所述氯霉素乙酰基转移酶基因核苷酸 序列如序列表的序列 3 所示。 3. 含有权利要求 1 或 2 所述 DNA 分子的重组载体。 4.如权利要求3所述的重组载体， 其特征在于 ： 所述重组载体是将权利要求1所述DNA 分子插入 pET-28a 质粒的多克隆位点得到的重组质粒。 5.如权利要求4所述的重组载体， 其特征在于 ： 所述重组载体是将权利要求1所述DNA 分子插入 pET-28a 质粒的 。
5、NcoI 和 SalI 酶切位点间得到的重组质粒。 6. 含有权利要求 2 所述 DNA 分子的重组菌。 7. 如权利要求 6 所述的重组菌， 其特征在于 ： 所述重组菌是将权利要求 3 所述含有权 利要求 2 所述 DNA 分子的重组载体导入大肠杆菌得到的重组菌。 8. 如权利要求 7 所述的重组菌， 其特征在于 ： 所述大肠杆菌为大肠杆菌 BL21(DE3)。 9. 权利要求 1 中 (a) 或 (b) 所述 DNA 分子在表达外源蛋白中的应用。 10. 如权利要求 9 所述的应用， 其特征在于 ： 所述外源蛋白为氯霉素乙酰基转移酶 ； 所 述氯霉素乙酰基转移酶氨基酸序列如序列表的序列 4。
6、 所示。 11. 如权利要求 10 所述的应用， 其特征在于 ： 所述应用通过用 IPTG 诱导工程菌表达实 现 ； 所述工程菌是将 pET-28a/Int-C-CAT-N 转化大肠杆菌 BL21(DE3) 得到的重组菌 ； 所述 pET-28a/Int-C-CAT-N 是将权利要求 2 所述 DNA 分子插入 pET-28a 质粒的 NcoI 和 SalI 酶 切位点间得到的重组质粒。 权 利 要 求 书 CN 101892230 B 2 1/6 页 3 用于表达环形肽的表达盒及其应用 技术领域 0001 本发明涉及用于表达环形肽的表达盒及其应用。 背景技术 0002 蛋白内含肽 (Inte。
7、in) 是一种 “自私” 的或 “寄生性” 的蛋白或其编码基因， 其框 内插入宿主蛋白， 和宿主蛋白一起翻译成由 N- 端外现肽 (Extein)、 内含肽、 C- 端的外现肽 组成的前体蛋白， 随后前体蛋白在内含肽的作用下发生自我剪接， 内含肽从前体蛋白中释 放出来， 并将剩下的外显肽连接成成熟的功能蛋白。自从 1987 年首次发现内含肽以来， 到 2009 年 11 月为止已经在真核、 原核、 古细菌甚至病毒等几乎所有生物中发现了 490 多种、 100-800 个氨基酸大小不等的内含肽 ( 刘萱， 赵志虎， 刘传喧 . 内含肽介导的生物学效应 及其应用 J. 中国生物工程杂志， 2003。
8、， 23(2) ： 17-24. ； list.php)。 0003 普通内含肽由具有自我剪接活性的 N- 端剪接域、 C- 端剪接域以及中间的归巢内 切酶 (Homing endonuclease) 区域三部分构成， 归巢核酸内切酶结构域对于内含肽介导的 蛋白剪接并不是必须的， 可以剔除从而得到微小内含肽。有时包含内含肽的前体蛋白由两 个不同基因组成， 这种内含肽又叫做分裂型(Split)内含肽。 来源于蓝细菌Synechocystis sp.PCC6803的DNA聚合酶III的亚单位DnaE就是一个分裂型内含肽， 就分别由dnaE-n、 dnaE-c 两个基因组成， 其中 dnaE-n 编。
9、码一个 N- 端的外显肽以及一个 122 个氨基酸的内 含肽， 而 dnaE-c 则编码一个 37 个氨基酸的内含肽以及一个 C- 端外显肽 (Wu H， Hu Z， Liu X Q.Protein trans-splicing by a split intein encoded in asplit DnaE gene of Synechocystis sp.PCC6803J.Proc Natl Acad Sci U S A， 1998， 95(16) ： 9226-9231.)。 0004 与线性多肽相比， 环肽由于分子构象受到一定的限制， 具有半衰期较长、 结构相对 复杂、 生理活性多样和。
10、特异性高等特点， 能够作为先导化合物用于新药开发。目前， 一些生 理活性环肽， 如胰岛素、 催产素、 抗体、 真菌毒素， 已被成功合成并广泛应用于药理学、 医药 领域。目前， 从分裂型内含肽介导的环肽文库中， 已经成功筛选得到了可以抑制 DNA 腺嘌 呤甲基转移酶、 ClpXP 蛋白酶、 HIV 出芽以及 -synuclein 蛋白聚集从而降低其毒性等的 多种小分子环肽 (Kritzer J A， Hamamichi S， McCaffery J M， etal.Rapid selection of cyclic peptides that reduce -synuclein toxicity。
11、 inyeast and animal modelsJ. Nat Chem Biol， 2009， 9(5) ： 655-663. ； Naumann T A， Tavassoli A， Benkovic S J.Genetic selection of cyclic peptide Dammethyltransferase inhibitorsJ.Chembiochem， 2008， 9(2) ： 194-197. ； TavassoliA， Lu Q， Gam J， et al.Inhibition of HIV budding by a genetically selected cycl。
12、icpeptide targeting the Gag-TSG101 interactionJ.ACS Chem Biol， 2008， 3(12) ： 757-764. ； Cheng L， Naumann T A， Horswill A R， et al.Discovery ofantibacterial cyclic peptides that inhibit the ClpXP proteaseJ.Protein Sci， 2007， 16(8) ： 1535-1542.)， 提示分裂型内含肽介导的环形小分子文库， 可能是活性小分子 或者先导化合物的一种重要来源。 说 明 书 CN 1。
13、01892230 B 3 2/6 页 4 发明内容 0005 本发明的目的是提供用于表达环形肽的表达盒及其应用。 0006 本发明提供的表达盒是如下 (a) 或 (b) 或 (c) 的 DNA 分子 ： 0007 (a) 序列表的序列 2 自 5 末端第 6 至 510 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； 0008 (b) 序列表的序列 2 所示的 DNA 分子 ； 0009 (c) 将氯霉素乙酰基转移酶基因插入 (a) 或 (b) 所述 DNA 分子的酶切位点得到的 DNA 分子 ； 所述限制性内切位点为 NdeI 酶切位点、 KpnI 酶切位点和 BamHI 酶切位点中的两 个 ； 所述氯霉。
14、素乙酰基转移酶如序列表的序列 4 所示。 0010 所述 (c) 中的 DNA 分子具体可为将氯霉素乙酰基转移酶基因插入序列表的序列 2 所示的 DNA 分子的 NdeI 酶切位点和 BamHI 酶切位点得到的 DNA 分子 ； 所述氯霉素乙酰基转 移酶基因如序列表的序列 3 所示。 0011 本发明还保护含有任一所述 DNA 分子的重组载体或重组菌。 0012 所述重组载体可为将任一所述DNA分子插入pET-28a质粒的多克隆位点得到的重 组质粒， 具体可为将任一所述 DNA 分子插入 pET-28a 质粒的 NcoI 和 SalI 间得到的重组质 粒。 0013 所述重组菌可为将所述重组载。
15、体导入大肠杆菌得到的重组菌。 所述大肠杆菌具体 可为大肠杆菌 BL21(DE3)。 0014 本发明还保护 (a) 或 (b) 所述 DNA 分子在表达外源蛋白中的应用。 0015 所述外源蛋白具体可为氯霉素乙酰基转移酶 ； 所述氯霉素乙酰基转移酶具体可如 序列表的序列 4 所示。 0016 所述应用可通过用 IPTG( 异丙基 -D- 硫代半乳糖苷 ) 诱导工程菌表达实现 ； 所述工程菌是将 pET-28a/Int-C-CAT-N 转化大肠杆菌 BL21(DE3) 得到的重组菌 ； 所述 pET-28a/Int-C-CAT-N 是将 (c) 所述 DNA 分子插入 pET-28a 质粒的 N。
16、coI 和 SalI 间得到的 重组质粒。 0017 本发明提供的表达盒中， 含有分裂型 DnaE 内含肽， 设有外源基因的插入位点， 可 以大大提高外源基因的表达量。将本发明的表达盒插入表达载体可以得到重组质粒， 该重 组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌可以作为高通量筛选模型， 进行特定生物活性小分子环 肽的筛选等工作。 本发明提供的的表达盒， 可以用于蛋白环形突变体、 环肽小分子文库构建 与表达的高效表达载体， 为分裂型内含肽 DnaE 的体内外自我剪接机制的研究、 小分子环肽 文库的构建与筛选等奠定了基础。 附图说明 0018 图 1 为基因设计、 合成、 组装与克隆、 鉴定详细流程。 00。
17、19 图 2 为初步序列和优化后序列的高级结构预测。 0020 图 3 为原始序列、 初步序列、 优化后序列的比较。 0021 图 4 为原始序列、 初始序列、 优化后序列的氨基酸密码子使用频率比较。 0022 图 5 为 PCR 产物和酶切产物的电泳图 ； 1 ： PCR 产物 ； 2 ： 酶切产物。 0023 图 6 为表达盒的测序结果。 说 明 书 CN 101892230 B 4 3/6 页 5 0024 图 7 为表达盒的应用 ( 介导环形分子的形成 ) ； 1 ： BL21(DE3) ； 2 ： BL21(DE3) (pET-28a/IntCN)(IPTG-) ； 3 ： BL21。
18、(DE3)(pET-28a/IntCN)(IPTG+) ； 4 ： BL21(DE3) (pET-28a/IntC-CAT-N)(IPTG-) ； 5 ： BL21(DE3)(pET-28a/IntC-CAT-N)(IPTG+)。 具体实施方式 0025 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 0026 实施例 1、 用于制备环肽的表达盒的制备 0027 制备流程见图 1。 0028 一、 初步序列的设计 0029 1、 从 NCBI 中。
19、 使 用 GeneID ： P74750 检 索 获 得 来 源 于 蓝 细 菌 Synechocystis sp.PCC6803 的 分 裂 型 内 含 肽 DnaE-c、 DnaE-n 结 构 域 的 氨 基 酸 序 列。 蓝 细 菌 Synechocystissp.PCC6803 的分裂型内含肽 DnaE 如序列表的序列 1 所示。DnaE-n 如序列 表的序列 1 自氨基末端第 776 至 897 位氨基酸残基所示， DnaE-c 如序列表的序列 1 自氨基 末端第 898 至 934 位氨基酸残基所示。 0030 2、 将 DnaE-c(37 个氨基酸 )、 DnaE-n(122 个。
20、氨基酸 ) 前后颠倒、 融合， 得到初步的 共 159 个氨基酸的模板氨基酸序列及其对应的核苷酸序列 ( 原始序列 )。 0031 3、 由于选择的模板序列来源于蓝细菌， 其氨基酸密码子的使用频率与大肠杆菌 中的存在较大区别， 为了避免密码子偏性影响基因在大肠杆菌中的高效表达， 根据 DnaE 的模板氨基酸序列， 选择大肠杆菌作为表达宿主， 利用 Gene Design 3.0 的反向翻译模块 Reverse Translation module 进行反向翻译， 得到初步序列。 0032 二、 初步序列的优化 0033 1、 重复序列分析 0034 重复序列的存在， 对于后续基因的合成、 寡核。
21、苷酸的组装等过程将带来不利影响。 利用随机重复序列分析软件 Tandem Repeats Finder， 对初步序列进行重复序列的分析， 发 现初步序列中不存在严重的重复序列。 0035 2、 同义密码子调整和复杂高级结构分析 0036 除了基因的密码子、 起始位点的局部二级结构外， 包括整个编码区在内的全部基 因复杂高级结构， 可能是影响基因表达的另一个重要因素。为了剔除初步序列中的复杂高 级结构， 利用 UNAFold 软件的 DNA、 RNA Folding 模块， 对初步序列的高级结构进行分析， 发现在初步序列中， 存在大大小小的 14 个复杂的高级结构， 可能会影响最终基因的高效表 。
22、达。 0037 为了克服上述影响， 选择大肠杆菌中的同义密码子， 利用 Gene Design 3.0 的密 码子替换 (Codon Juggling) 模块对初步序列进行优化。在优化之前， 初步序列的 100bp、 300bp 附近， 分别存在一个复杂的高级结构， 而本次优化以后， 这两处的高级结构被分解成 两个较小的结构， 复杂性大大降低 ( 见图 2)。经过优化， 一些复杂高级结构甚至被完全剔 除， 最终使全序列的高级结构从 14 个降低到 7 个。 0038 重复进行步骤 1 和步骤 2， 最后得到 477bp 的优化后序列。 说 明 书 CN 101892230 B 5 4/6 页 。
23、6 0039 原始序列、 初步序列以及优化后序列的比较见图 3。在不改变氨基酸序列的前提 下， 优化后序列与原始序列约有 1/4(118 处 ) 存在差异。氨基酸密码子使用频率的分析发 现 ： 原始序列中大肠杆菌偏性使用密码明显偏低， 而优化后序列中大肠杆菌偏性密码使用 频率得到明显提高。 优化后序列虽然在第25个氨基酸、 96个氨基酸附近偏性密码子使用频 率低于初步序列， 但仍然明显高于原始序列的使用频率 ( 见图 4)， 这两处的改变， 大大降低 了局部的复杂高级结构， 应该不会影响基因在大肠杆菌中的高效表达。 0040 三、 表达盒 DNA 的获得 0041 1、 多克隆位点、 限制性酶。
24、切位点以及保护性碱基的添加 0042 利用 GeneDesign 3.0 的限制性酶切位点添加 (Restriction site addition)、 短 序列添加 (short sequence addition) 模块并结合 Tandem Repeats Finder 进行重复序 列的分析， 在 DnaE-c、 DnaE-n 两个结构域之间添加一段含有 NdeI、 KpnI、 BamHI 酶切位点 ( 下划线部分 ) 以及三种不同框架的终止密码 ( 阴影部分 ) 的短的核苷酸 linker 序列即 CATATGTAACTGAGTAG GTACC GGATCC， linker 序列的添加可。
25、以方便外源基因或者随机短肽文 库在 NdeI、 BamHI 位点克隆， 与分裂型内含肽实现框内融合。同时在 5 -、 3 - 端添加限制 性酶切位点 NcoI、 SalI、 PstI、 终止密码 TAATGA 以及保护性碱基， 得到 534bp 的完整序列 ( 含有 DnaE 以及合适酶切位点、 中间 linker 序列 )。 0043 2、 表达盒 DNA 的获得 0044 利用 Tandem Repeats Finder 对上述完整序列进行重复序列分析、 优化直到不存 在严重的重复序列以后， 得到优化后的最终含有分裂型DnaE基因、 合适Linker序列以及酶 切位点的序列， 即本发明的表。
26、达盒 ( 见序列表的序列 2)。序列 2 所示的表达盒由 531 个核 苷酸组成， 自 5 末端第 6-116 位核苷酸为 DnaE-c 的编码基因， 第 117-144 位核苷酸为多克 隆位点 Linker， 第 145-510 位核苷酸为 DnaE-n 的编码基因。 0045 四、 表达盒 DNA 的制备 0046 以表达盒的核苷酸序列为出发点， 利用 GeneDesign 3.0 的建筑预制件设计 (Building Block Design) 模块， 将全长 531bp 的表达盒划分成 44-61nt 长度不等、 相互互 补的 14 个寡核苷酸片段， 进行寡核苷酸片段的合成。14 个寡。
27、核苷酸片段见表 1。 0047 表 1 用于组装分裂型 DnaE 内含肽的不同寡核苷酸序列 0048 名称 序列 (5 -3 ) 长度 (nt) Seq1 ATACCATGGTTAAAGTTATCGGTCGTCGTTCTCTGGGTGTTCAGCGTATCTTCGACATCGG 61 Seq2 CCGTTAGCCAGCAGGAAGTTGTGGTCCTGCGGCAGACCGATGTCGAAGATACGCTGAACA 60 Seq3 ACAACTTCCTGCTGGCTAACGGTGCTATCGCTCACAATTGTCATATGTAACTGAGTAGGTACCG 64 Seq4 TCAGGATTTC。
28、GGTACCGAAAGACAGGCAGTTGGATCCGGTACCTACTCAGTTACATATGACA 62 Seq5 TGTCTTTCGGTACCGAAATCCTGACCGTTGAATACGGTCCGCTGCCGATCGGTAAAATC 59 说 明 书 CN 101892230 B 6 5/6 页 7 Seq6 GGGTCAACAGAGTAAACAGAGCAGTTGATTTCTTCAGAAACGATTTTACCGATCGGCAGCGG 62 Seq7 CTGCTCTGTTTACTCTGTTGACCCGGAAGGTCGTGTTTACACCCAGGCTATCGCTCAG 58 Seq8 CA。
29、GTTCGTATTCCAGAACTTCCTGTTCACCACGGTCGTGCCACTGAGCGATAGCCTGGGTGT 62 Seq9 CAGGAAGTTCTGGAATACGAACTGGAAGACGGTTCTGTTATCCGTGCTACCTCTGACCAC 60 Seq10 CGATAGCCAGCAGCTGGTAGTCGGTGGTCAGGAAACGGTGGTCAGAGGTAGCACGGATA 59 Seq11 ACTACCAGCTGCTGGCTATCGAAGAAATCTTCGCTCGTCAGCTGGACCTGCTGACCC 57 Seq12 GTGGTTGTCCAGAGCTTCTTCGGTC。
30、TGTTTGATGTTTTCCAGGGTCAGCAGGTCCAGCTG 60 Seq13 CGAAGAAGCTCTGGACAACCACCGTCTGCCGTTCCCGCTGCTGGACGCTGGTACCATC 58 Seq14 AAACTGCAGGTCGACTCATTATTTGATGGTACCAGCGTCCAGCA 44 0049 合成表 1 所示的 14 条寡核苷酸片段， 等摩尔混合后作为模板， 以最外围的 Seq1 和 Seq14 为引物， 通过重叠 PCR， 将 14 条片段进行一次性组装， PCR 产物进行电泳。电泳图见 图 5， 电泳显示， PCR 产物约 531bp。 0050 分离。
31、、 纯化PCR产物， 用限制性内切酶NcoI和SalI进行双酶切、 回收酶切产物 ； 用 限制性内切酶 NcoI 和 SalI 双酶切 pET-28a 质粒 (Novagen， 产品目录号 69864-3)， 回收载 体骨架 ； 将酶切产物与载体骨架连接 ； 将连接产物进行测序， 测序结果见图6。 结果表明， 得 到了重组质粒 pET-28a/IntCN( 在 pET-28a 质粒的 NcoI 和 SalI 酶切位点之间插入了序列 表的序列 2 所示的 PCR 产物 )。重组质粒 pET-28a/IntCN 用 NcoI 和 SalI 进行双酶切， 酶切 产物的电泳图见图 5。 0051 实施。
32、例 2、 表达盒的应用 0052 一、 重组菌甲的制备 0053 以pET-14b(Novagen， 产品目录号69674)为模板， 用CAT基因特异引物进行PCR扩 增， 得到 PCR 扩增产物 ( 氯霉素乙酰基转移酶基因 ； CAT 基因 )。 0054 CAT 基因特异引物 ： 5 -ggcatatggagaaaaaaatcactggatat-3 ； 0055 5 -aaggatcccgccccgccctgccactc-5 。 0056 分离、 纯化 PCR 产物， 用限制性内切酶 NdeI 和 BmaHI 进行双酶切、 回收酶切产 物 ； 用限制性内切酶 NdeI 和 BmaHI 双酶。
33、切重组质粒 pET-28a/IntCN， 回收载体骨架 ； 将酶 切产物与载体骨架连接 ； 将连接产物进行测序。测序结果表明， 得到了重组质粒 pET-28a/ Int-C-CAT-N( 在 pET-28a/IntCN 的 NdeI 和 BmaHI 酶切位点之间插入了序列表的序列 3 所示的 CAT 基因 ； DnaE-c 编码基因、 DnaE-n 编码基因与中间插入的 CAT 基因表达可形成 IntC-CAT-N 融合蛋白 )。 说 明 书 CN 101892230 B 7 6/6 页 8 0057 用重组质粒 pET-28a/Int-C-CAT-N 转化大肠杆菌 BL21(DE3)(Nov。
34、agen， 产品目录 号 69387-3)， 得到重组菌甲。 0058 二、 重组菌乙的获得 0059 用重组质粒 pET-28a/IntCN 转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 得到重组菌乙 ( 对照 )。 0060 三、 氯霉素乙酰基转移酶表达量的检测 0061 分别将初始浓度相同(均为OD0.1)的大肠杆菌BL21(DE3)、 重组菌甲和重组菌 乙培养 3 小时， 然后加入 IPTG( 使其终浓度为 1mM) 诱导表达， 重组菌甲和重组菌乙均设置 不用IPTG诱导的对照， 继续培养3小时， 然后离心， 收集菌液进行SDS-15聚丙烯酰胺凝胶 电泳。 0062 电泳图见图 7。由图 7 可。
35、见 ： 大肠杆菌 BL21(DE3)、 IPTG 诱导的重组菌乙， 未经诱 导的重组菌乙中， 都检测不到预期分子量的 IntC-CAT-N 融合蛋白 (43.8KD) 和预期分子量 的CAT蛋白(25.7KD) ； IPTG诱导的重组菌甲， 未经诱导的重组菌甲中， 都检测到预期分子量 的 IntC-CAT-N 融合蛋白， IPTG 诱导可以使融合蛋白的表达量增加 ； 只有 IPTG 诱导的重组 菌甲中可以检测到预期分子量的 CAT 蛋白 ( 由融合蛋白中释放 ) 和 Int-NC( 融合蛋白释放 CAT 蛋白后经自身剪接得到的翻译后加工产物 )。 0063 以上结果与分裂型内含肽可以介导环形分。
36、子的形成等相关文献相关报道 一致 (Muralidharan V， Muir T M.Protein ligation ： an enabling technology for thebiophysical analysis of proteinsJ.Nat Meth， 2006， 3(6) ： 429-438. ； VolkmannG， Murphy P W， Rowland E E， et al.Intein-mediated cyclization of bacterialacyl carrier protein stabilizes its folded conformation bu。
37、t does not abolishfunctionJ.J Biol Chem， 2010， 285(12) ： 8605-8614.)， 表明本发明合成的表达 盒的确可以进行自身翻译后的剪接加工， 导致环形分子 CAT 突变体的形成。 说 明 书 CN 101892230 B 8 1/9 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 101892230 B 9 2/9 页 10 0003 序 列 表 CN 101892230 B 10 3/9 页 11 0004 序 列 表 CN 101892230 B 11 4/9 页 12 0005 序 列 表 CN 101892230 B 12 5/9。
38、 页 13 0006 序 列 表 CN 101892230 B 13 6/9 页 14 0007 序 列 表 CN 101892230 B 14 7/9 页 15 0008 序 列 表 CN 101892230 B 15 8/9 页 16 0009 序 列 表 CN 101892230 B 16 9/9 页 17 序 列 表 CN 101892230 B 17 1/5 页 18 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101892230 B 18 2/5 页 19 图 3 说 明 书 附 图 CN 101892230 B 19 3/5 页 20 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 101892230 B 20 4/5 页 21 图 6 说 明 书 附 图 CN 101892230 B 21 5/5 页 22 图 7 说 明 书 附 图 CN 101892230 B 22 。