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1、10申请公布号CN102021157A43申请公布日20110420CN102021157ACN102021157A21申请号200910093925422申请日20090923CGMCCNO036919990127C12N9/26200601C12N15/56200601C12N15/63200601C12N5/10200601C12N1/00200601C12N1/21200601C12N15/11200601C12P19/14200601C12R1/07200601C12R1/1920060171申请人中国科学院微生物研究所地址100101北京市朝阳区北辰西路一号院3号中国科学院微生物研。
2、究所A81472发明人马延和李刚薛燕芬74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅任凤华54发明名称一种果胶酶及其编码基因57摘要本发明公开了一种果胶酶及其编码基因。本发明提供的蛋白质，是如下A或B的蛋白质A由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；B将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有果胶酶活性的由序列1衍生的蛋白质。所述蛋白的编码基因、以及含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、所述表达盒、转基因细胞系或重组菌均可应用于降解多聚半乳糖醛酸。本发明的P。
3、ELA蛋白可以应用于苎麻脱胶等工业过程。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图1页CN102021171A1/1页21一种蛋白质，是如下A或B的蛋白质A由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；B将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有果胶酶活性的由序列1衍生的蛋白质。2编码权利要求1所述蛋白的基因。3根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1或2或3或4的DNA分子1编码序列是序列表中序列2自5端第109至1089位核苷酸所示的DNA分子；2编码序列是序列表中序列2所示的DN。
4、A分子；3在严格条件下与1或2限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4与1或2或3限定的DNA序列具有90以上同源性，且编码具有果胶酶活性的蛋白的DNA分子。4含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5如权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为如下I或II的重组质粒I将权利要求2或3所述基因插入PUC18质粒的多克隆位点得到的重组质粒；II将权利要求2或3所述基因插入PET28A质粒的多克隆位点得到的重组质粒。6如权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌是将权利要求5的II所述的重组质粒转化大肠杆菌BL21DE3得到的。7一种制备果胶酶的方法。
5、，是培养权利要求4或6所述的重组菌，得到果胶酶。8扩增权利要求2或3所述基因的全长及其任意片段的引物对。9权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4、5或6所述重组表达载体、所述表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一种在降解多聚半乳糖醛酸中的应用。10如权利要求9所述的应用，其特征在于应用权利要求1所述蛋白降解多聚半乳糖醛酸时，温度为4070，PH为912。权利要求书CN102021157ACN102021171A1/8页3一种果胶酶及其编码基因技术领域0001本发明涉及一种果胶酶及其编码基因。背景技术0002果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以1，4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有。
6、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链。果胶存在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，表现出固有的形态。0003多种微生物都能够产生果胶酶，如细菌、酵母、真菌、放线菌。0004果胶酶大致分为果胶水解酶PECTINHYDROLASES、果胶裂解酶PENTINLYASES，PL、果胶酯酶PECTINESTERASES，PE和原果胶酶等。其中果胶水解酶又可分为聚半乳糖醛酸酶POLYGALACTURONASES，PG、聚半乳糖醛酸甲酯水解酶POLYMETHYLGALAC。
7、TURONASES，PMG、聚鼠李半乳糖醛酸酶RHAMNOGALACTURONASES，RHG、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木糖基半乳糖醛酸酶。0005微生物产生的果胶酶在工业上有着广泛的应用。酸性果胶酶广泛应用于果汁和酒类的提取中。碱性果胶酶应用于处理蔬菜食品加工过程中产生的废水、纺织加工、植物纤维如苎麻、印度麻、亚麻、黄麻的解聚和去皮、造纸和纸浆工业、油料的提取、咖啡和茶业的发酵过程。尤其在纺织工业上，应用碱性果胶酶可以特异性的作用于非纤维素类物质，不会影响纤维的长度，同时能够减少原材料的损失和化学品的消耗，是一种能够代替化学处理的环境友好的方法。因此，获得能够在高碱性条件下表现高活性的碱性。
8、果胶酶就成为研究开发与应用碱性果胶酶的关键。发明内容0006本发明的目的是提供一种果胶酶及其编码基因。0007本发明提供的果胶酶PELA，属于多糖裂解酶家族1，来自芽孢杆菌BACILLUSSP，是如下A或B的蛋白质0008A由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；0009B将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有果胶酶活性的由序列1衍生的蛋白质。0010序列1所示的PELA蛋白由362个氨基酸残基组成。0011为了使A中的PELA便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。0012表1标签的序列。
9、0013说明书CN102021157ACN102021171A2/8页4标签残基序列POLYARG56通常为5个RRRRRPOLYHIS210通常为6个HHHHHHFLAG8DYKDDDDKSTREPTAGII8WSHPQFEKCMYC10EQKLISEEDL0014上述B中的PELA可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述B中的PELA的编码基因可通过将序列表中序列2自5端第1至1089位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5端和/或3端连上表1所示的标签的编码序列得到。0015编码上述PELA蛋白的基因。
10、PELA也属于本发明的保护范围。0016所述基因是如下1或2或3或4的DNA分子00171编码序列是序列表中序列2自5端第109至1089位核苷酸所示的DNA分子；00182编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；00193在严格条件下与1或2限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；00204与1或2或3限定的DNA序列具有90以上同源性，且编码具有果胶酶活性的蛋白的DNA分子。0021序列2所示PELA基因由1089个核苷酸组成。0022上述严格条件可为在6SSC，05SDS的溶液中，在65下杂交，然后用2SSC，01SDS和1SSC，01SDS各洗膜一次。0023含有以上任一所述。
11、基因的重组载体也属于本发明的保护范围。0024所述重组载体具体可为将所述基因插入PUC18质粒的多克隆位点得到的重组质粒。0025所述重组载体具体可为重组表达载体。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是。
12、天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。0026所述重组表达载体具体可为将所述基因插入PET28A质粒的多克隆位点得到的重组质粒。具体来说，所述重组表达载体为将PET28A质粒NHEI和HINDIII酶切位点之间的说明书CN102021157ACN102021171A3/8页5小片段取代为所述基因得到的重组质粒。0027含有以上任一所述基因PELA的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。0028所述重组菌可为将所述重组表达载体转化大肠杆菌BL21DE3得到的重组菌。0029本发明同时保护一种制备果胶酶的方法，是培养所述重组菌，得到果胶酶。所述制备果胶酶。
13、的方法具体可为将所述重组菌37培养3H，OD60007时，加入IPTG至终浓度08M，转至30继续培养4H。0030扩增所述基因PELA全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。0031所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、所述表达盒、转基因细胞系或重组菌均可应用于降解多聚半乳糖醛酸。0032应用所述蛋白降解多聚半乳糖醛酸时，温度为4070，PH为912。应用所述蛋白降解多聚半乳糖醛酸时，40时、PH115具有最高酶活性。应用所述蛋白降解多聚半乳糖醛酸时，PH10时、50具有最高酶活性。0033本发明的PELA蛋白具有果胶酶活性，属于碱性果胶酶。PELA蛋白与其它已报导的果胶酶的氨基酸序列。
14、相比，相似性小于47，属于多糖裂解酶家族1中的一员。本发明的PELA蛋白可以应用于苎麻脱胶等工业过程。附图说明0034图1为果胶酶活性随温度的变化。0035图2为果胶酶活性随PH的变化。具体实施方式0036以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。0037多聚半乳糖醛酸CATN081325，SIGMA。0038芽孢杆菌BACILLUSSPN165于1999年1月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，保。
15、藏编号为CGMCCNO0369。芽孢杆菌N165在以甘露聚糖为碳源的培养条件下可产生芽孢，生长的PH范围为8115，在58的NACL中生长良好。0039实施例1、碱性果胶酶的发现0040一、芽孢杆菌N165总DNA的提取0041采用芽孢杆菌BACILLUSSPN165，取其新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50MMTRIS缓冲液中PH80，加入少量溶菌酶和8毫升025MMEDTAPH80，混匀后37放置20MIN；之后加入2毫升10SDS，55放置5MIN，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次；取最后一次的上清溶液，加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70和无水乙醇洗；沉淀溶于05毫升TE缓冲液PH80。
16、，10MMTRIS，1MMEDTA，加入10MG/MLRNASE3L，37保温1小时，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次；上清溶液加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70和无水乙醇洗，真空干燥，用去离子水溶解。DNA溶液的说明书CN102021157ACN102021171A4/8页6紫外分光光度计测定结果A260/A280198，A260/A230218。0042二、碱性果胶酶的发现00431、取总DNA溶液10L约50GDNA，用限制性内切酶SAU3AI部分酶切，经琼脂糖凝胶电泳，回收28KBDNA片段。00442、连接反应16小时0045连接体系20L2L5GSAU3AI酶解DNA片段；00。
17、461L1G经BAMHI酶解并去磷酸化的质粒PUC18DNA；00472L10X连接缓冲液；00481LT4DNA连接酶；004914L水。00503、用连接反应产物感受态大肠杆菌DH5，然后涂于含50UG/MLAMP氨苄青霉素、05果胶的固体培养基上，37培养1618小时，菌落周围有透明圈的即为阳性克隆。00514、阳性克隆在AMPLB培养基中37培养1618小时，经活性测试具有碱性果胶酶活性。0052对阳性克隆中的重组质粒进行了测序。测序结果显示，重组质粒中，在PUC18DNA骨架中插入了一个DNA片段，该DNA片段含有一个长1089BP的开放阅读框架ORF，ORF核苷酸序列如序列表的序列。
18、2所示，其中自5端第1至108位核苷酸为信号肽。0053序列2所示核苷酸编码一个由362个氨基酸组成的蛋白质PELA蛋白。PELA蛋白属多糖裂解酶家族1，与BACILLUSLICHENIFORMIS中的同源蛋白具有最高相似性47。将PELA蛋白的编码基因命名为PELA基因。0054实施例2、碱性果胶酶的表达0055一、PELA基因的制备0056根据PELA基因的核苷酸序列如序列表的序列2所示，设计引物对如下0057正向引物5TATCGCTAGCTCTAACGGTCCACAAGGCTATG3；0058反向引物5CAGCAAGCTTCTTAGTTGATAACACCTACTCC3；0059正向引物的。
19、下划线部分为NHEI的酶切位点，反向引物的下划线部分为HINDIII酶切位点。0060以芽孢杆菌BACILLUSSPN165的总DNA为模板，用设计的引物对进行PCR扩增。0061PCR反应体系006210X缓冲液5L0063DNTP4L0064TAQDNA聚合酶05L0065正向引物1L0066反向引物1L0067模板05L。0068PCR反应条件94预变性4MIN，然后94变性30秒55退火30秒72说明书CN102021157ACN102021171A5/8页7延伸30秒30个循环，最后72延伸10MIN。0069PCR产物用1琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒超薄离心。
20、柱型，天根公司生产纯化。将纯化的PCR产物进行测序，结果表明获得了序列表的序列2自5端第109至1089位核苷酸所示的DNA片段。0070二、重组表达载体的构建00711、将测序正确的PCR产物用NHEI和HINDIII双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。00722、将质粒PET28ACATN0698643，NOVOGEN用NHEI和HINDIII双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。00733、将步骤1的酶切产物和步骤2的酶切产物进行连接，得到重组质粒。0074将重组质粒进行测序。结果表明，在PET28A的NHEI和HINDIII酶切位点之间插入了序列表的序列2自5端第109至1089位核苷酸所示的P。
21、ELA基因，将该重组质粒命名为PET28APELA。0075三、工程菌的制备0076用PET28APELA电击转化大肠杆菌BL21DE3CATN0CB105，TIANGEN后涂布于含有50G/ML卡那霉素的LB平板，37过夜培养，得到含有PET28APELA的重组菌，即为工程菌。0077用PET28A代替PET28APELA，转化大肠杆菌BL21DE3，步骤同上，得到含有PET28A的重组菌，作为对照菌。0078四、果胶酶的制备和纯化0079将步骤三制备的工程菌培养于含有50G/ML卡那霉素的LB培养基中，37培养3H；0D60007时，加入IPTG至终浓度08M，转至30继续培养4H。008。
22、05000RPM、10MIN离心收集菌体，悬浮于溶液A20MMTRISCL，PH79，05MNACL，10MM咪唑；PH79中，于冰浴中超声破碎60W，10MIN；超声2S，停止2S，之后15000RPM离心10MIN除去细胞碎片，上清过NIIDAHISBINDSUPERFLOW纯化柱，用5ML溶液A冲洗，再用10ML溶液B20MMTRISCL，PH79，05MNACL，60MM咪唑漂洗，最后用5ML溶液C20MMTRISCL，PH79，05MNACL，500MM咪唑洗脱，收集洗脱液。然后将洗脱液用FPLC快速蛋白液相层析脱盐，获得纯化的PELA蛋白PELA蛋白。0081SDSPAGE电泳显示。
23、纯化的PELA蛋白的分子量约为38KDA，基本符合理论推断的36KDA。0082将步骤三制备的对照菌采用相同的步骤进行培养和纯化，得到的溶液作为对照酶液。0083五、果胶酶活性测定0084酶活单位定义为1MIN内催化产生1MOL还原糖所需的酶量。00851、最适温度0086活性测定体系为1ML，由09ML溶液A和01MLPELA蛋白或对照酶液组成；0087溶液A在PH100、50MM的GLYCINENAOHBUFFER中加入PGA多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为02每100毫升溶液中含有02克PGA。说明书CN102021157ACN102021171A6/8页80088将反应体系在特定温度温育2。
24、0MIN后，加入1ML二硝基水杨酸溶液DNS终止反应，然后沸水浴5MIN后测定540NM的吸光值。0089在50时，果胶酶液具有最高的酶活性。以最高酶活性体系的吸光值作为相对活性100，其它反应体系的吸光值与最高酶活性体系的吸光值的比值作为各自的相对活性。0090果胶酶活性随温度的变化见图1。结果表明PH100的环境中，4070时，PELA蛋白果胶酶液均具有较高的活性，50时，PELA蛋白果胶酶液具有最佳酶活性。而不管在哪个温度条件下，对照酶液均没有活性。00912、最适PH0092活性测定体系为1ML，由09ML溶液BB1、B2、B3、B4、B5、B6或B7和01MLPELA蛋白或对照酶液组。
25、成；0093溶液B1在PH70、50MM的TRISHCLBUFFER中加入PGA多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为02每100毫升溶液中含有02克PGA。0094溶液B2在PH80、50MM的TRISHCLBUFFER中加入PGA多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为02每100毫升溶液中含有02克PGA。0095溶液B3在PH90、50MM的TRISHCLBUFFER中加入PGA多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为02每100毫升溶液中含有02克PGA。0096溶液B4在PH100、50MM的GLYCINENAOHBUFFER中加入PGA多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为02每100毫升溶液中含有02克PGA。0097溶。
26、液B5在PH110、50MM的KCLNAOHBUFFER中加入PGA多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为02每100毫升溶液中含有02克PGA。0098溶液B6在PH115、50MM的KCLNAOHBUFFER中加入PGA多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为02每100毫升溶液中含有02克PGA。0099溶液B7在PH120、50MM的KCLNAOHBUFFER中加入PGA多聚半乳糖醛酸，使其终浓度为02每100毫升溶液中含有02克PGA。0100将反应体系在40温育20MIN后，加入1ML二硝基水杨酸溶液DNS终止反应，然后沸水浴5MIN后测定540NM的吸光值。0101在PH115时，果胶酶液具有最高的酶。
27、活性。以最高酶活性体系的吸光值作为相对活性100，其它反应体系的吸光值与最高酶活性体系的吸光值的比值作为各自的相对活性。0102果胶酶活性随PH的变化见图2。结果表明40时，PH9PH12时，PELA蛋白果胶酶液均具有活性，PH115时，PELA蛋白果胶酶液具有最佳酶活性。而不管在哪个PH条件下，对照酶液均没有活性。0103序列表0104中国科学院微生物研究所0105一种果胶酶及其编码基因0106CGGNARY925570107201081说明书CN102021157ACN102021171A7/8页901093620110PRT0111芽孢杆菌BACILLUSSP011210113VALSE。
28、RASNVALTHRLYSVALPHELYSLEULEULEUALALEUALALEU01141510150115VALLEUPROVALILESERLEUGLYSERPROALASERGLNALAALASER01162025300117ASNGLNPROTHRSERASNGLYPROGLNGLYTYRALASERMETASNGLY01183540450119GLYTHRTHRGLYGLYALAGLYGLYARGVALGLUTYRALASERTHRGLY01205055600121ALAGLNILEGLNGLNLEUILEASPASNARGSERARGSERASNASNPRO012265707。
29、5800123ASPGLUPROLEUTHRILETYRVALASNGLYTHRILETHRGLNGLYASN01248590950125SERPROGLNSERLEUILEASPVALLYSASNHISARGGLYLYSALAHIS01261001051100127GLUILELYSASNILESERILEILEGLYVALGLYTHRASNGLYGLUPHE01281151201250129ASPGLYILEGLYILEARGLEUSERASNALAHISASNILEILEILEGLN01301301351400131ASNVALSERILEHISHISVALARGGLUGLYGLUGLY。
30、THRALAILEGLU01321451501551600133VALTHRASPASPSERLYSASNVALTRPILEASPHISASNGLUPHETYR01341651701750135SERGLUPHEPROGLYASNGLYASPSERASPTYRTYRASPGLYLEUVAL01361801851900137ASPMETLYSARGASNALAGLUTYRILETHRVALSERTRPASNLYSPHE01381952002050139GLUASNHISTRPLYSTHRMETLEUVALGLYHISTHRASPASNALASER01402102152200141LEUALAPR。
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32、THRTHRGLYPHEILELYSGLYPROVALGLYTRPPHE01502902953000151TYRGLYSERPROSERTHRGLYTYRTRPASNLEUARGGLYASNVALPHE01523053103153200153VALASNTHRPROASNSERHISLEUASNSERTHRTHRASNPHETHRPRO01543253303350155PROTYRSERTYRGLNVALGLNSERALATHRGLNALALYSSERSERVAL01563403453500157GLUGLNHISSERGLYVALGLYVALILEASN0158355360015920160。
33、10890161DNA0162芽孢杆菌BACILLUSSP016320164GTGAGTAACGTGACTAAAGTCTTTAAATTGTTACTGGCATTAGCTCTCGTTTTACCAGTT600165ATCTCATTGGGTTCTCCTGCCTCACAAGCTGCTTCAAATCAGCCAACTTCTAACGGTCCA1200166CAAGGCTATGCGTCAATGAATGGAGGCACAACCGGTGGTGCAGGTGGCCGTGTCGAATAT1800167GCAAGCACCGGAGCGCAAATTCAGCAATTAATAGATAACCGCAGCCGAAGTAATAATCCT24。
34、00168GATGAACCATTAACGATTTATGTAAACGGAACGATTACACAAGGAAATTCCCCACAGTCC3000169CTTATTGATGTTAAAAATCACCGTGGAAAAGCTCATGAAATTAAAAACATCTCTATTATC3600170GGTGTAGGGACAAATGGAGAGTTTGATGGCATTGGGATAAGACTATCAAACGCCCATAAT4200171ATCATTATCCAAAATGTGTCAATTCATCATGTGCGAGAGGGAGAAGGCACGGCTATTGAA4800172GTGACAGATGACAGTAAAAACGTGTGG。
35、ATCGATCACAACGAGTTTTATAGTGAATTTCCA5400173GGTAATGGGGACTCGGATTATTACGATGGTCTCGTAGACATGAAAAGAAACGCTGAATAT6000174ATCACAGTTTCTTGGAATAAGTTTGAGAATCATTGGAAAACGATGCTCGTCGGTCATACT6600175GATAATGCATCATTAGCGCCAGATAAAATTACGTATCATCACAATTATTTTAATAATCTT7200176AATTCACGTGTCCCGCTTATTCGATACGCTGATGTCCACATGTTCAATAACTATTTTAA。
36、A7800177GACATTAATGATACAGCGATTAACAGTCGTGTAGGGGCTCGTGTCTTTGTAGAAAACAAC8400178TATTTTGACAACGTAGGATCAGGACAAGCTGACCCAACGACTGGTTTTATTAAAGGGCCT9000179GTTGGTTGGTTCTATGGAAGTCCGAGTACTGGGTATTGGAATTTACGTGGAAATGTATTT9600180GTCAATACACCGAATAGTCATTTAAACTCTACAACAAACTTTACACCACCATATAGTTAC10200181CAAGTCCAATCAGCTACTCAAGCAAAATCATCTGTTGAACAACATTCTGGAGTAGGTGTT10800182ATCAACTAA1089说明书CN102021157ACN102021171A1/1页11图1图2说明书附图CN102021157A。