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1、10申请公布号CN102040638A43申请公布日20110504CN102040638ACN102040638A21申请号200910075748722申请日20091020C07H17/08200601C07H1/0620060171申请人华北制药集团新药研究开发有限责任公司地址050015河北省石家庄市和平东路388号72发明人张雪霞李晓露林旸王健路新华任风芝张金娟王海燕张丽王秀捧贺建功张华54发明名称一种高纯度那他霉素的非溶剂制备方法57摘要本发明公开了一种利用那他霉素发酵液制备那他霉素的方法，包括使用助滤剂，经过提取、脱色、吸附、结晶等步骤，得到了那他霉素结晶。本发明的优点在于制备。
2、工艺绿色环保、获得的那他霉素纯度高。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页CN102040641A1/1页21一种那他霉素的制备方法，包括下述步骤1常温下，在那他霉素发酵液中加入助滤剂搅拌30分钟2小时至助滤剂分散均匀；2固液分离，得到那他霉素菌丝体；3530条件下，在那他霉素菌丝体中加入PH值为90120的碱水；4固液分离，得到那他霉素提取液；5将那他霉素提取液通过大孔脱色树脂脱色，得到脱色液；6将脱色液导入大孔吸附树脂进行富集后，用解析剂进行解析，得到那他霉素解析液；7常温下，调节解析液PH值至4570，析出那他霉素结晶；8固液分离那。
3、他霉素结晶液，得到那他霉素粉末。2根据权利要求1所述的方法，其中步骤1中的助滤剂为珍珠岩或硅藻土，其用量为210克/升。3根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤3中的碱水的加入量为菌丝重的26倍升/千克。4根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤5中的大孔脱色树脂为D303、D290或HZ801树脂。5根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤5中的大孔脱色树脂的用量为那他霉素提取液的00301倍毫升/升，树脂柱高径比为2151，流速为13BV/H。6根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤6中的大孔吸附树脂为D312、HZ816或HZ818树脂。7根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤6中的大孔吸附。
4、树脂用量为那他霉素提取液的00503倍毫升/升，树脂柱高径比为2151，吸附流速为13BV/H。8根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤6中的解析剂为乙醇碱水溶液，其中乙醇的重量百分比为6090，碱水为氢氧化钾、氢氧化钠或有机碱的水溶液，碱水的PH值为90120。9根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤7中调节所述解析液PH值所用的酸类为盐酸、磷酸或有机酸。10根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤8所述的经固液分离得到那他霉素粉末后，真空干燥至水分介于6090，得到那他霉素产品。权利要求书CN102040638ACN102040641A1/5页3一种高纯度那他霉素的非溶剂制备方法技术领域00。
5、01本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及到一种从发酵培养物中不用有机溶剂直接分离纯化制备高纯度那他霉素粉末的绿色环保的制备方法。背景技术0002那他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，是一种白色至乳白色几乎无臭无味的结晶粉末。分子式C33H47NO13，分子量为66573。化学结构式如下00030004那他霉素是纳塔尔链霉菌STREPTOMYCESNATALENIS、恰塔努加链霉菌STREPTOMYCESCHATTANOOGENSIS或褐黄孢链霉菌STREPTOMYCESGILVOSPOREUS等微生物的次级代谢产物，从发酵液中提取纯化后获得。那他霉素是一种高效、低毒的具有广谱的抗霉菌、酵。
6、母菌、某些原生动物和藻类剂，可以用于医疗、食品、饲料、粮储防霉，特别是在食品原料保鲜、食品防腐等方面具有良好的使用陈冠群，季波那他霉素的特性及应用中国乳品工业，2002，304，2628。由于那他霉素对酵母菌及霉菌等丝状真菌有极强的抑制或杀灭作用，美国FDA于1982年6月正式批准那他霉素可用作食品防腐剂衰亦承那他霉素J中国食品用化学，1997，133741，是目前国际上批准使用的仅有的两种生物食品防腐剂之一。中国食品添加剂标准化技术委员会于1996年正式批准那他霉素可作为食品防腐剂衰亦承那他霉素J中国食品用化学，1997，133741。0005该产品在欧洲已经有35年的使用历史FDAFEDE。
7、RALREGISTERRULESANDREGULATIONS21CFR172155，2001，6646，13846。现在在国际市场上还有多家公司在生产销售该产品作为人类用药，例如，5那他霉素无菌溶液是世界上用于治疗角膜真菌炎症的首选抗生素FDANATAMYCINAPPROVEDFIRSTUSDRUGFORFUNGALKERATITISFDADRUGBULLETIN，1978，86，3738，其商品名为NATACYN等。华北制药集团新药研究开发有限责任公司于2008年取得那他霉素医药级原料和眼用制剂的生产文号，成为国内首家高纯度医药级那他霉素原料药的生产企业。0006由于那他霉素含有四个相连的双。
8、键结构，决定了那他霉素几乎不溶于水，在水中的溶解度仅为52MG/MLBRIK，HNATAMYCINCH，INANALYTICALPROFILESOFDRUG说明书CN102040638ACN102040641A2/5页4SUBSTANCES，VOL10KFLOREYED，ACADEMICPRESS，INCNEWYORK，1981，513561。那他霉素微溶于甲醇，溶于冰醋酸。由于那他霉素的溶解特性，很多用于那他霉素分离的工艺为溶媒提取结晶和物理分离。0007英国专利GB846933报道了从发酵液中用混合性极性溶剂如甲醇、丁醇和丙酮，采用萃取法提取那他霉素。专利GB2106498报道了体积浓缩法。
9、和从滤液中用丁醇回收那他霉素，从而获得了一种抗真菌混合物原液，从中可分离那他霉素。世界专利WO92/10580报道了在低PH下用甲醇溶解那他霉素，然后除去固形物，提高PH以沉淀出那他霉素。美国专利US5942611报道了一种有效的提取高质量那他霉素的方法，该方法将错流过滤得到的发酵液浓缩，调节发酵液的PH在1011，添加有机溶剂如乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮等溶解发酵液中的那他霉素。错流过滤除去不溶物，调节过滤液的PH在5575范围内，过滤得到析出的晶体，产品纯度可以达到9499无结晶水计算，那他霉素回收率可达4070。这些提取过程一般要求多级纯化，操作费用比较昂贵，同时这些工艺均属于溶媒提取结晶。
10、工艺，使用的溶剂量，损耗大，造成那他霉素的生产成本较高。0008WO97/29207公布了一种不加有机溶剂而直接从发酵液中回收那他霉素的物理分离方法。该方法在那他霉素发酵单位不低于7G/L时，首先将发酵液中的菌丝体破碎成远远小于那他霉素晶体的微小颗粒，然后利用重力梯度离心，将密度和颗粒大小相差很大的那他霉素品体和菌丝体碎片进行分离，从而获得那他霉素。由于该工艺对发酵液质量和分离设备要求严格，因此很难实现规模化生产。0009中国专利CN101062934A公开了一种那他霉素的非溶剂提取方法，他们用碱将发酵液的PH值调节至100140后，固液分离得到那他霉素水提液。将那他霉素水提液酸化调PH值至5。
11、090，析出8286左右那他霉素产品。该方法得到的那他霉素产品纯度较低含量在8286左右，不符合国家药用标准含量大于90，单杂小于05。目前尚没有关于药用级高纯度那他霉素制备工艺的报道，如何得到符合国家药用标准的高纯度那他霉素是技术人员着力解决的问题。发明内容0010本发明的目的在于克服上述不足之处，得到符合国家药用标准的高纯度那他霉素粉。本发明首次采用大孔树脂从发酵液中将目的产物分别进行脱色、除杂和富集，根据那他霉素的溶解特性筛选到合适的解析剂，有效地去除了发酵次级代谢产物中的杂蛋白、色素和其他大极性杂质，得到高质量的那他霉素解析液，从而使得到的那他霉素精粉含量大于95，质量超过国家药用标准。
12、类白色粉末，重量含量大于90，单杂小于05，甲酯峰小于20，适于工业化规模生产高纯度那他霉素的制备方法。0011下面对本发明进行具体描述0012在本发明方法中，通过加入助滤剂，提高发酵液滤速，通过固液分离去除杂质含量高的滤液，得到菌丝体。在菌丝体中加入碱水溶解那他霉素，收集那他霉素的碱水提取液并通过大孔脱色树脂脱色除杂后，得到淡黄色脱色液。然后将脱色液导入大孔吸附树脂进行富集，极性较大的杂质和小分子蛋白由于不被吸附而流出，饱和树脂用碱水乙醇溶液解析后，在解析液中加入酸水得到那他霉素沉淀，将沉淀洗涤干燥后得到高纯度那他霉素固体。说明书CN102040638ACN102040641A3/5页500。
13、13具体地，本发明涉及一种高纯度那他霉素的非溶剂绿色环保制备方法，包括下述步骤00141在常温条件下在那他霉素发酵液中加入助滤剂搅拌30分钟2小时至助滤剂分散均匀；00152固液分离得到那他霉素菌丝体；00163530条件下在那他霉素菌丝体中加入PH值为90120的碱水；00174固液分离得到那他霉素提取液；00185将那他霉素提取液通过大孔脱色树脂脱色得到脱色液；00196将脱色液导入大孔吸附树脂进行富集后，用解析剂进行解析，得到那他霉素解析液；00207常温下调节解析液PH值至4570，析出那他霉素结晶；00218固液分离那他霉素结晶液得到那他霉素粉末。0022其中，步骤1中的助滤剂为珍珠。
14、岩或硅藻土，优选为硅藻土。助滤剂用量为发酵液体积的210克/升，优选为57克/升。搅拌时间为30分钟2小时，优选为115小时。0023步骤2中的那他霉素发酵菌丝体为通过传统的固液分离过程如离心、板框压滤等方式得到那他霉素干燥的菌丝体。水溶性蛋白、发酵过程中产生的水溶性强的其他次级代谢产物等杂质位于发酵液中，随着固液分离过程被舍弃。0024步骤3中的向那他霉素菌丝体中加入碱水的量为菌丝重的26倍升/千克，优选为46倍。碱水为氢氧化钾、氢氧化钠或有机碱的水溶液，优选为氢氧化钠的水溶液。碱水的PH值为90120，优选为110120。碱水提取时的温度为530，优选为1020。0025步骤5中的大孔脱色。
15、树脂为D290、HZ801或D303树脂，优选为D290树脂。脱色树脂的用量为那他霉素提取液的00301倍毫升/升，优选为004006倍毫升/升。树脂柱高径比为2151，脱色流速为16BV/H，优选为1525BV/H。0026步骤6中的大孔吸附树脂为D312、HZ816或HZ818树脂，优选为D312树脂。吸附树脂的用量为那他霉素提取液的00503倍毫升/升，优选为00802倍毫升/升。树脂柱高径比为2151，吸附流速为13BV/H，优选为1525BV/H。0027步骤6中的解析剂为乙醇碱水溶液。其中乙醇的重量百分比为6090，优选为7080。碱水为氢氧化钾、氢氧化钠或有机碱的水溶液，优选为氢。
16、氧化钠的水溶液。碱水的PH值为90120，优选为110120。解析流速为053BV/H，优选为1015BV/H。0028步骤7中调节PH值所用的酸类为盐酸、磷酸或有机酸，优选为盐酸。调节脱色液PH值至4570，优选PH值为5565。0029步骤8中经传统的固液分离过程如离心、板框压滤等方式得到那他霉素粉末后，用去离子水洗涤滤饼13次。再用真空干燥的方式在3060条件下干燥，得到类白色或乳白色，产品水分介于6090，含量大于95的高纯度那他霉素产品。0030本发明所得产品可供药品或食品使用，那他霉素重量含量可达95以上，面积归一百分含量达到99以上，甲酯峰小于20，单杂小于05，符合药用标准，样。
17、品回收率大于80。说明书CN102040638ACN102040641A4/5页60031本发明有如下优点1固液分离过程中加入了助滤剂，提高了过滤速度，缩短了工艺周期。同时经过固液分离舍弃了含色素和蛋白质及其他极性大的杂质，提高了提取液的质量。2大孔脱色树脂的应用，去除了大部分色素和极性大的杂质，提高了脱色液的澄清度和质量。3目的产物的富集和纯化采用大孔吸附树脂，进一步摒弃了发酵次级代谢产物的杂质，提高了目的产物的质量。4所得产品颜色为类白色，纯度高。那他霉素重量含量可达98以上，面积归一百分含量达到99以上，甲酯峰小于20，单杂小于05，符合药用标准。5工艺简单，样品收率高，全程总收率达到8。
18、0以上。6工艺简洁，对那他霉素纯化行之有效，提高了产品纯度，有效降低了色素比值，为生产药用级原料提供了更加安全的技术保障。附图说明0032图1实施例1那他霉素滤液HPLC图谱0033图2实施例1那他霉素脱色液HPLC图谱0034图3实施例1那他霉素精粉HPLC图谱0035图4实施例2那他霉素精粉HPLC图谱0036图5实施例3那他霉素精粉HPLC图谱具体实施方式0037下述实施例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制。0038本发明所使用的那他霉素发酵液均为华药新药研发有限责任公司用微生物培养手段，得到的那他霉素发酵液。大孔脱色树脂为华东华震公司生产，盐酸、氢氧化钠等试剂均为市售。
19、。本发明使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515泵WATERS公司。0039实施例10040取那他霉素发酵液100L，发酵单位52G/L。在发酵液见附图1中加入500G珍珠岩，搅拌30分钟后真空抽滤，得到208KG菌丝体。在菌丝体中加入8L用NAOH调节PH值至115的碱水，温度维持在20搅拌1小时后真空抽滤，收集滤液见附图1。将滤液通过高50CM，直径为10CM，D290树脂装量为500ML的树脂柱进行脱色，流速为1000ML/H。收集脱色液见附图2，导入高50CM，直径为10CM的D312树脂柱吸附，D312树脂装量为500ML，饱和树脂用水洗涤净化，然后用PH值为110的质量百分比浓。
20、度为80的乙醇碱水溶液进行解析，解析流速为500ML/H。解析液用乙酸调节PH值至6065使那他霉素沉淀析出。离心分离结晶液得到那他霉素湿粉，用去离子水洗涤2次后，将那他霉素湿粉在45下真空干燥，直至水分小于9。最后得到423G类白色那他霉素精粉，收率为813。精粉HPLC含量为991，其中最大单杂05，甲酯峰20，总杂10，重量含量为968，符合中国药用标准见附图3。0041实施例20042取那他霉素发酵液100L，发酵单位67G/L。在发酵液中加入6KG硅藻土，搅拌40分钟后真空抽滤，得到226KG菌丝体。在菌丝体中加入65L用氨水调节PH值至110的碱水，温度维持在15搅拌1小时后板框压。
21、滤，收集滤液。将滤液通过高12M，直径为12CM，D303树脂装量为4000ML的树脂柱进行脱色，脱色流速为6L/H。脱色液导入高为12M，直说明书CN102040638ACN102040641A5/5页7径为12CM，树脂装量为4000ML的HZ816树脂柱吸附，饱和树脂用水洗涤净化，然后用PH值为115的质量百分比浓度为70的乙醇碱水溶液进行解析，解析流速为3L/H。收集脱色液，用HCL调节PH值至6065使那他霉素沉淀析出。抽滤结晶液得到那他霉素滤饼，用去离子水洗涤2次后，将那他霉素湿粉在45下真空干燥，直至水分小于9。最后得到5506G类白色那他霉素精粉，收率为822。精粉HPLC含量。
22、为992，其中最大单杂05，甲酯峰20，总杂10，重量含量为972，符合中国药用标准见附图4。0043实施例30044取那他霉素发酵液1000L，发酵单位73G/L。在发酵液中加入45KG硅藻土，搅拌50分钟后真空抽滤，得到172KG菌丝体。在菌丝体中加入700L用KOH调节PH值至115的碱水，温度维持在20搅拌1小时后板框压滤，收集滤液。将滤液通过高24M，直径为50CM，D290树脂装量为50L的树脂柱进行脱色，流速为80L/H。收集脱色液，导入高为24M，直径为50CM的树脂柱吸附，HZ818树脂装量为50L，饱和树脂用水洗涤净化，然后用PH值为110的质量百分比浓度为90的乙醇碱水溶液进行解析，解析流速为40L/H。用HCL调节PH值至6065使那他霉素沉淀析出。抽滤结晶液得到那他霉素滤饼，用去离子水洗涤2次后，将那他霉素湿粉在45下真空干燥，直至水分小于9。最后得到58545G类白色那他霉素精粉，收率为802。精粉HPLC含量为990，其中最大单杂05，甲酯峰20，总杂10，重量含量为969，符合中国药用标准见附图5。说明书CN102040638ACN102040641A1/2页8图1图2图3说明书附图CN102040638ACN102040641A2/2页9图4图5说明书附图CN102040638A。