技术领域
本发明涉及医药领域，特别涉及一种光可断裂的荧光标记可逆终端化合物 及其在DNA或RNA测序中的用途。
背景技术
为满足第三代测序的技术的需求，需采用循环可逆终结(cyclic reversible termination,CRT)的办法来实现单个碱基的延伸以提高测序速度。即当某一个 带有抑制基团的碱基加到DNA链上之后，可以阻止下一个碱基的延伸。在温和 条件下该抑制基团可以被除去从而使该DNA链得以继续延伸。每增加一个碱基， 可以通过对其所带荧光的检测实现对该DNA链的实时测序。这样一个带抑制基 团的碱基被称作终止子(terminator)。
目前可逆的终止子大体有两种结构：一是3’-OH基团被其他基团取代，从 而使3’-OH丧失进攻磷酸基团的能力而阻止下一个碱基的延伸；第二种结构虽 然没有取代3’-OH，但是在核苷位置增加了一个抑制分子，由于空间位阻等作 用使得3’-OH无法进攻磷酸基团。值得一提的是，3’-OH取代的碱基往往不 易被DNA聚合酶识别，从而影响测序长度。Helicos公司已经成功合成出3’-OH 未被取代的终止子，然而其最大问题在于荧光标记脱离以后会遗留一段较长的 分子在碱基上。随着遗留分子的累积，DNA聚合酶将无法识别该DNA片段， 因而降低测序长度。
因此，研发可适用于二代测序、单分子测序技术(三代测序技术)平台的 测序试剂仍有很大提升空间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种光可断裂的荧光标记可逆终端化合物及其在 DNA或RNA测序中的用途。
第一方面，本发明提供了一种光可断裂的荧光标记可逆终端化合物，其结 构式如式(I)所示：
其中，R1为H、单磷酸盐、二磷酸盐或三磷酸盐；R2为H或者OH； 碱基为胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤或其衍生物；所述的“–连 接单元-”为：
优选地，所述光可断裂基团包括但不限于2-硝基甲苯基、苄氧羰基、硝基 苯基、苯甲酰甲酯基酯、苄胺、苄醚、氨基甲酸2-(邻硝基苯基)乙酯或碳 酸2-(邻硝基苯基)乙酯。
优选地，所述荧光基团选自BODIPY、荧光素、罗丹明、香豆素、呫吨、 花青、芘、酞菁、alexa、squarene染料、产生能量转移染料、及其衍生物中的 一种或多种。
优选地，所述光可断裂的荧光标记可逆终端化合物为任一结构式如式(1)～ (10)所示化合物：
在式(1)-(10)中,R1为H、单磷酸盐、二磷酸盐或三磷酸盐；R2为H或者 OH；Dye为荧光基团(所述荧光基团优选为选自BODIPY、荧光素、罗丹明、 香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、alexa、squarene染料、产生能量转移染料、 及其衍生物中的一种或多种)。
本发明第一方面选择光可断裂基团作为抑制基团。在一定波长的照射下， 抑制基团与碱基断开；该离去过程不需要特殊的催化剂或还原剂等的辅助，不 会存在辅助试剂与DNA聚合酶、碱基的副反应，从而在温和的条件下实现可逆 终止；该离去过程对测序过程本身没有任何干扰，有利于长片段单分子测序。 本发明提供的光可断裂的荧光标记核苷酸，在单个荧光分子超灵敏光学检测技 术和三代测序平台具有重要应用价值。
第二方面，本发明公开了一种光可断裂的荧光标记可逆终端化合物的合成 方法，包括如下步骤：
1)提供如式(a)所示的化合物a：
2)将化合物a和反应，获得所述光可断裂的荧光标记 可逆终端化合物，其结构式如式(I)所示：
其中，R1为H、单磷酸盐、二磷酸盐或三磷酸盐；R2为H或者OH； 碱基为胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤或其衍生物；所述的“–连 接单元-”为：
本发明第二方面采用马来亚酰胺与巯基的特异性反应对核苷酸进行荧光标 记。该反应反应条件温和、反应效率高，降低了实验难度，提高了整个反应的 产率。此外，市场上已有销售数种与荧光分子相连接的马来亚酰胺，价格低廉， 节约成本。
优选地，所述光可断裂基团包括但不限于2-硝基甲苯基、苄氧羰基、硝基 苯基、苯甲酰甲酯基酯、苄胺、苄醚、氨基甲酸2-(邻硝基苯基)乙酯或碳 酸2-(邻硝基苯基)乙酯。
优选地，所述荧光基团选自BODIPY、荧光素、罗丹明、香豆素、呫吨、 花青、芘、酞菁、alexa、squarene染料、产生能量转移染料、及其衍生物中的 一种或多种。
优选地，所述化合物a为下述化合物(11)-(15)中的任一种：
进一步优选地，上述化合物(16)-(20)中的任一种由相应的核苷酸 经羟基保护，氨基保护后，与反应获得的化 合物，再经脱保护获得。
第三方面，本发明公开了一种光可断裂的荧光标记可逆终端化合物的合成 方法，包括如下步骤：
1)提供如式(b)所示的化合物b：
2)将化合物a和反应，获得所述光可断裂的荧光标记可逆终 端化合物，其结构式如式(I)所示：
其中，R1为H、单磷酸盐、二磷酸盐或三磷酸盐；R2为H或者OH； 碱基为胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤或其衍生物；所述的“–连 接单元-”为：
优选地，所述光可断裂基团包括但不限于2-硝基甲苯基、苄氧羰基、硝基 苯基、苯甲酰甲酯基酯、苄胺、苄醚、氨基甲酸2-(邻硝基苯基)乙酯或碳 酸2-(邻硝基苯基)乙酯。
优选地，所述荧光基团选自BODIPY、荧光素、罗丹明、香豆素、呫吨、 花青、芘、酞菁、alexa、squarene染料、产生能量转移染料、及其衍生物中的 一种或多种。
优选地，所述化合物b为下述化合物(16)-(20)中的任一种：
进一步优选地，上述化合物(16)-(20)中的任一种由如下步骤制备：
1)核苷酸经羟基保护，氨基保护，获得第一产物；
2)有机溶剂(优选为DMF)及NaH存在的条件下，第一产物与 反应获得第二产物；
3)第二产物在有机溶剂(优选为DMSO)以及CuI、L-脯氨酸、NaOH 存在的条件下，与NaN3反应，获得第三产物；
4)第三产物再经脱保护获得化合物(16)-(20)中的任一种。
在基因测序领域来说，实现对于单个活体细胞的实时测序是本发明要解 决的技术问题之一；本发明第四方面采用生物正交反应(bioorthogonal chemistry) 将荧光分子加到光可断裂的可逆终端化合物上；该过程对细胞基本没有危害， 也不会带入对细胞有害的物质或副反应产物；同时，本发明所采用的办法避免 了使用对细胞有害的金属催化剂或其他有害化合物，对细胞内的生化过程没有 影响，且反应十分高效，有利于更简单、更高效率地实现单个活体细胞的实时 测序。此外，市面存在有多种环辛炔标记的荧光分子，价格低廉，能够大大节 约成本。
如本发明所述的，“生物正交化学反应”指可发生在活体内，对活体本身生 物化学过程没有任何干扰的化学反应。生物正交反应正日益成为在活体内对生 物大分子以及活性小分子进行特异标记的一种有效方法；对细胞内的生物分子 实时可视化的标记方法对于理解生命的分子基础有着重要的意义。
第四方面，本发明提供了一种靶核酸的测序方法，包括如下步骤：
(i)将引物5’端连接到固体表面上；
(ii)将靶核酸与所述连接到固体表面上的引物进行杂交，形成杂交的引物/ 靶核酸复合物；
(iii)获得聚合酶和一种或多种第一方面所述的化合物，前提是带不同碱基 的化合物具有不同的荧光团；
(iv)将所述杂交的引物/靶核酸复合物与聚合酶以及一种或多种步骤(iii) 的化合物反应，以通过聚合酶反应形成生长中的引物链；
(v)通过荧光团对生长中的引物链成像以鉴定步骤(iv)引入的化合物；
(vi)将具有所述生长中引物链的固体表面暴露于光源以除去下式的光可断 裂的终止部分：
得到带有天然成分的延伸的引物；和
(vii)重复步骤(iv)至(vi)一次或多次以鉴定所述靶核酸中的多个碱基，其 中前一个循环中步骤(vi)的延伸引物在下一个循环的步骤(iv)中代替杂交的引 物/靶核酸复合物进行反应。
第五方面，本发明提供了一种靶核酸的测序方法，包括如下步骤：
(i)将靶核酸5’端连接到固体表面上；
(ii)将引物与所述连接到固体表面上的引物进行杂交，形成杂交的引物/靶 核酸复合物；
(iii)获得聚合酶和一种或多种第一方面所述的化合物，前提是带不同碱基 的化合物具有不同的荧光团；
(iv)将所述杂交的引物/靶核酸复合物与聚合酶以及一种或多种步骤(iii) 的化合物反应，以通过聚合酶反应形成生长中的引物链；
(v)通过荧光团对生长中的引物链成像以鉴定步骤(iv)引入的化合物；
(vi)将具有所述生长中引物链的固体表面暴露于光源以除去下式的光可断 裂的终止部分：
得到带有天然成分的延伸的引物；和
(vii)重复步骤(iv)至(vi)一次或多次以鉴定所述靶核酸中的多个碱基，其 中前一个循环中步骤(vi)的延伸引物在下一个循环的步骤(iv)中代替杂交的引 物/靶核酸复合物进行反应。
优选地，在第四方面或第五方面中，所述的聚合酶选自逆转录酶、末端转 移酶和DNA聚合。
优选地，在第四方面或第五方面中，还包括步骤(vi)前清洗生长中的引物 链。
优选地，在第四方面或第五方面中，还包括步骤(iv)后清洗延伸的引物。
优选地，在第四方面或第五方面中，还包括在步骤(iv)前对步骤(iv)中未 反应的任何引物或生长中的引物链加帽。
优选地，在第四方面或第五方面中，还包括同步地对多个靶核酸测序。
第六方面，一种如第一方面所述的光可断裂的荧光标记可逆终端化合物在 DNA或RNA测序中的用途。
第七方面，本发明提供了一种DNA或RNA测序试剂盒，包括一种或多 种如第一方面所述的光可断裂的荧光标记可逆终端化合物。
第八方面，一种如第一方面所述的光可断裂的荧光标记可逆终端化合物作 为终止核苷酸类似物的用途。
本发明的有益效果：
本发明选择光可断裂基团作为抑制基团。在一定波长的照射下，抑制基团 与碱基断开；该离去过程不需要特殊的催化剂或还原剂等的辅助，不会存在辅 助试剂与DNA聚合酶、碱基的副反应，从而在温和的条件下实现可逆终止；该 离去过程对测序过程本身没有任何干扰。本发明提供的光可断裂的荧光标记可 逆终端可高效率的服务于第三代基因测序技术。
附图说明
图1是本发明实施例提供的光可断裂的荧光标记可逆终端化合物的结构 式。
具体实施方式
现通过以下实施例来进一步描述本发明，实施例仅用于例证的目的，不限 制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变 和修饰也包含在本发明范围之内。
结合图1，本发明实施例提供了一种光可断裂的荧光标记可逆终端化合物 的合成方法。
实施例1
一种光可断裂的荧光标记可逆终端化合物的合成方法，包括如下路线1-5 的任一种：
合成路线1：
其中，步骤(i)的反应条件为：化合物A.1在叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)、 咪唑(imidazole)以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的条件下，室温，过夜， 然后反应液在二碳酸二叔丁基甲酯((Boc)2O)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)以 及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的条件下，室温，过夜，得化合物A.2；
步骤(ii)的反应条件为：化合物A.2在Mg(ClO4)2、以及四氢呋喃THF,存 在的条件下反应得化合物A.3；
步骤(iii)的反应条件为：化合物A.3在NaH、N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 以及4-硫-2-硝基苄溴(4-sulfo-2-nitrobenzyl bromide)存在的条件下反应得化合 物A.4；
步骤(iv)的反应条件为：化合物A.4在SiO2存在的条件下反应得化合物 A.5；
步骤(v)的反应条件为：化合物A.5在n-氟化四丁铵(n-Bu4NF)、THF存 在的条件下反应得化合物A.6；
步骤(vi)的反应条件为：化合物A.6在三氯氧磷(POCl3)、1，8-双二甲 氨基萘(proton sponge)、磷酸三甲酯((MeO)3PO)存在的条件下低温反应，然后 在(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、以及DMF存在的条件下反应；再加入HNEt3HCO3反应，得化合物A.7；
步骤(vii)的反应条件为：化合物A.7和反应，获得所述光可断裂的荧 光标记可逆终端化合物A.8；其中，为Dye-Cy5maleimide(合成路线2-5 同此处):
合成路线2：
其中，步骤(i)的反应条件为：化合物G.1在叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)、 咪唑(imidazole)以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的条件下，室温，过夜， 然后反应液在二碳酸二叔丁基甲酯((Boc)2O)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)以 及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的条件下，室温，过夜，得化合物G.2；
步骤(ii)的反应条件为：化合物G.2在Mg(ClO4)2、以及四氢呋喃THF,存 在的条件下反应得化合物G.3；
步骤(iii)的反应条件为：化合物G.3在NaH、N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 以及4-S-2-硝基苯甲溴(4-sulfo-2-nitrobenzyl bromide)存在的条件下反应得化 合物G.4；
步骤(iv)的反应条件为：化合物G.4在SiO2存在的条件下反应得化合物 G.5；
步骤(v)的反应条件为：化合物G.5在n-氟化四丁铵(n-Bu4NF)、THF存 在的条件下反应得化合物G.6；
步骤(vi)的反应条件为：化合物G.6在三氯氧磷(POCl3)、1，8-双二甲 氨基萘(proton sponge)、磷酸三甲酯((MeO)3PO)存在的条件下低温反应，然后 在(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、以及DMF存在的条件下反应；再加入HNEt3HCO3反应，得化合物G.7；
步骤(vii)的反应条件为：化合物G.7和反应，获得所述光可断裂 的荧光标记可逆终端化合物G.8。
合成路线3：
其中，步骤(i)的反应条件为：化合物C.1在叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)、 咪唑(imidazole)以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的条件下，室温，过夜， 然后反应液在二碳酸二叔丁基甲酯((Boc)2O)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)以 及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的条件下，室温，过夜，得化合物C.2；
步骤(ii)的反应条件为：化合物C.2在Mg(ClO4)2、以及四氢呋喃THF,存 在的条件下反应得化合物C.3；
步骤(iii)的反应条件为：化合物C.3在NaH、N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 以及4-S-2-硝基苯甲溴(4-sulfo-2-nitrobenzyl bromide)存在的条件下反应得化 合物C.4；
步骤(iv)的反应条件为：化合物C.4在SiO2存在的条件下反应得化合物 C.5；
步骤(v)的反应条件为：化合物C.5在n-氟化四丁铵(n-Bu4NF)、THF存 在的条件下反应得化合物C.6；
步骤(vi)的反应条件为：化合物C.6在三氯氧磷(POCl3)、1，8-双二甲 氨基萘(proton sponge)、磷酸三甲酯((MeO)3PO)存在的条件下低温反应，然后 在(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、以及DMF存在的条件下反应；再加入HNEt3HCO3反应，得化合物C.7；
步骤(vii)的反应条件为：化合物C.7和反应，获得所述光可断裂 的荧光标记可逆终端化合物C.8。
合成路线4：
其中，步骤(i)的反应条件为：化合物T.1在叔丁基二甲基氯硅烷 (TBSCl)、咪唑(imidazole)以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的条件下， 室温，过夜，然后反应液在二碳酸二叔丁基甲酯((Boc)2O)、4-二甲氨基吡 啶(DMAP)以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的条件下，室温，过夜，得 化合物T.2；
步骤(ii)的反应条件为：化合物T.2在Mg(ClO4)2、以及四氢呋喃THF,存 在的条件下反应得化合物T.3；
步骤(iii)的反应条件为：化合物T.3在NaH、N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 以及4-S-2-硝基苯甲溴(4-sulfo-2-nitrobenzyl bromide)存在的条件下反应得化 合物T.4；
步骤(iv)的反应条件为：化合物T.4在SiO2存在的条件下反应得化合物 T.5；
步骤(v)的反应条件为：化合物T.5在n-氟化四丁铵(n-Bu4NF)、THF存 在的条件下反应得化合物T.6；
步骤(vi)的反应条件为：化合物T.6在三氯氧磷(POCl3)、1，8-双二甲 氨基萘(proton sponge)、磷酸三甲酯((MeO)3PO)存在的条件下低温反应，然后 在(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、以及DMF存在的条件下反应；再加入HNEt3HCO3反应，得化合物T.7；
步骤(vii)的反应条件为：化合物T.7和反应，获得所述光可断 裂的荧光标记可逆终端化合物T.8。
在本发明实施例1合成路线1-4中的最后的产物(A.14、G.14、C.14、T.11、 U.11)的结构式中，-s-Dye具体为：
在本发明实施例1和实施例2中的其它合成路线中，第6产物的结构式中， Dye为荧光基团。
合成路线5：
其中，步骤(i)的反应条件为：化合物U.1在叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)、 咪唑(imidazole)以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的条件下，室温，过夜， 然后反应液在二碳酸二叔丁基甲酯((Boc)2O)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)以 及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的条件下，室温，过夜，得化合物U.2；
步骤(ii)的反应条件为：化合物U.2在Mg(ClO4)2、以及四氢呋喃THF,存 在的条件下反应得化合物U.3；
步骤(iii)的反应条件为：化合物U.3在NaH、N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 以及4-S-2-硝基苯甲溴(4-sulfo-2-nitrobenzyl bromide)存在的条件下反应得化 合物U.4；
步骤(iv)的反应条件为：化合物U.4在SiO2存在的条件下反应得化合物 U.5；
步骤(v)的反应条件为：化合物U.5在n-氟化四丁铵(n-Bu4NF)、THF存 在的条件下反应得化合物U.6；
步骤(vi)的反应条件为：化合物U.6在三氯氧磷(POCl3)、1，8-双二甲 氨基萘(proton sponge)、磷酸三甲酯((MeO)3PO)存在的条件下低温反应，然后 在(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、以及DMF存在的条件下反应；再加入HNEt3HCO3反应，得化合物U.7；
步骤(vii)的反应条件为：化合物U.7和反应，获得所述光可断裂 的荧光标记可逆终端化合物U.8。
实施例2
一种光可断裂的荧光标记可逆终端化合物的合成方法，包括如下路线1-5 的任一种：
合成路线1：
其中，步骤(i)的反应条件为：化合物A.3在4-碘-2-硝基溴化苄 (4-iodo-2-nitrobenzyl bromide)、NaH以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的 条件下反应得化合物A.9；
步骤(ii)的反应条件为：化合物A.9在NaN3、CuI、L-脯氨酸、NaOH以 及DMSO存在的条件下反应得化合物A.10；
步骤(iii)的反应条件为：化合物A.10在SiO2存在的条件下反应得化合物 A.11；
步骤(iv)的反应条件为：化合物A.11在n-氟化四丁铵(n-Bu4NF)、THF 存在的条件下反应得化合物A.12；
步骤(v)的反应条件为：化合物A.12在三氯氧磷(POCl3)、1，8-双二甲 氨基萘(proton sponge)、磷酸三甲酯((MeO)3PO)存在的条件下低温反应，然 后在(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、以及DMF存在的条件下反应；再加入 HNEt3HCO3反应，得化合物A.13；
步骤(vi)的反应条件为：将荧光分子标记的环辛炔与化合物A.13进行生 物正交反应(bioorthogonal chemistry)，获得所述光可断裂的荧光标记可逆终端化 合物A.14。
合成路线2：
其中，步骤(i)的反应条件为：化合物C.3在4-碘-2-硝基溴化苄 (4-iodo-2-nitrobenzyl bromide)、NaH以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的 条件下反应得化合物C.9；
步骤(ii)的反应条件为：化合物C.9在NaN3、CuI、L-脯氨酸、NaOH以 及DMSO存在的条件下反应得化合物C.10；
步骤(iii)的反应条件为：化合物C.10在SiO2存在的条件下反应得化合物 C.11；
步骤(iv)的反应条件为：化合物C.11在n-氟化四丁铵(n-Bu4NF)、THF 存在的条件下反应得化合物C.12；
步骤(v)的反应条件为：化合物C.12在三氯氧磷(POCl3)、1，8-双二甲 氨基萘(proton sponge)、磷酸三甲酯((MeO)3PO)存在的条件下低温反应，然 后在(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、以及DMF存在的条件下反应；再加入 HNEt3HCO3反应，得化合物C.13；
步骤(vi)的反应条件为：将荧光分子标记的环辛炔与化合物C.13 进行生物正交反应(bioorthogonal chemistry)，获得所述光可断裂的荧光标记可逆 终端化合物C.14，其中，为Cyclooctyne labeled Cy5(合成路线2-5同 此处)：
合成路线3：
其中，步骤(i)的反应条件为：化合物G.3在4-碘-2-硝基溴化苄 (4-iodo-2-nitrobenzyl bromide)、NaH以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的 条件下反应得化合物G.9；
步骤(ii)的反应条件为：化合物G.9在NaN3、CuI、L-脯氨酸、NaOH以 及DMSO存在的条件下反应得化合物G.10；
步骤(iii)的反应条件为：化合物G.10在SiO2存在的条件下反应得化合物 G.11；
步骤(iv)的反应条件为：化合物G.11在n-氟化四丁铵(n-Bu4NF)、THF 存在的条件下反应得化合物G.12；
步骤(v)的反应条件为：化合物G.12在三氯氧磷(POCl3)、1，8-双二甲 氨基萘(proton sponge)、磷酸三甲酯((MeO)3PO)存在的条件下低温反应，然 后在(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、以及DMF存在的条件下反应；再加入 HNEt3HCO3反应，得化合物G.13；
步骤(vi)的反应条件为：将荧光分子标记的环辛炔与化合物G.13进行生 物正交反应(bioorthogonal chemistry)，获得所述光可断裂的荧光标记可逆终端化 合物G.14。
合成路线4：
其中，步骤(i)的反应条件为：化合物T.3在4-碘-2-硝基溴化苄 (4-iodo-2-nitrobenzyl bromide)、NaH以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的 条件下反应得化合物T.9；
步骤(ii)的反应条件为：化合物T.9在NaN3、CuI、L-脯氨酸、NaOH以 及DMSO存在的条件下反应得化合物T.10；
步骤(iii)的反应条件为：化合物T.10在SiO2存在的条件下反应得化合物 T.11；
步骤(iv)的反应条件为：化合物T.11在n-氟化四丁铵(n-Bu4NF)、THF 存在的条件下反应得化合物T.12；
步骤(v)的反应条件为：化合物T.12在三氯氧磷(POCl3)、1，8-双二甲 氨基萘(proton sponge)、磷酸三甲酯((MeO)3PO)存在的条件下低温反应，然 后在(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、以及DMF存在的条件下反应；再加入 HNEt3HCO3反应，得化合物T.13；
步骤(vi)的反应条件为：将荧光分子标记的环辛炔与化合物T.13进行生 物正交反应(bioorthogonal chemistry)，获得所述光可断裂的荧光标记可逆终端化 合物T.14。
合成路线5：
其中，步骤(i)的反应条件为：化合物U.3在4-碘-2-硝基溴化苄 (4-iodo-2-nitrobenzyl bromide)、NaH以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)存在的 条件下反应得化合物U.9；
步骤(ii)的反应条件为：化合物U.9在NaN3、CuI、L-脯氨酸、NaOH以 及DMSO存在的条件下反应得化合物U.10；
步骤(iii)的反应条件为：化合物U.10在SiO2存在的条件下反应得化合物 U.11；
步骤(iv)的反应条件为：化合物U.11在n-氟化四丁铵(n-Bu4NF)、THF 存在的条件下反应得化合物U.12；
步骤(v)的反应条件为：化合物U.12在三氯氧磷(POCl3)、1，8-双二甲 氨基萘(proton sponge)、磷酸三甲酯((MeO)3PO)存在的条件下低温反应，然 后在(n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、以及DMF存在的条件下反应；再加入 HNEt3HCO3反应，得化合物U.13；
步骤(vi)的反应条件为：将荧光分子标记的环辛炔与化合物U.13进行生 物正交反应(bioorthogonal chemistry)，获得所述光可断裂的荧光标记可逆终端化 合物U.14。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。