一种基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201710096613.3	申请日：	20170222
公开号：	CN106947790A	公开日：	20170714
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C12P13/00	主分类号：	C12P13/00
申请人：	上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司
发明人：	何丹农,徐艳,王萍,金彩虹
地址：	200241 上海市闵行区江川东路28号
优先权：	CN201710096613A
专利代理机构：	上海东方易知识产权事务所	代理人：	唐莉莎
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内容摘要

本发明涉及一种基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，根据聚合底物对单、双链DNA吸附能力的不同，设计在纳米结构特定位点上伸出单、双链DNA；在纳米材料上连上生物酶和催化聚合反应，在已连有生物酶的纳米材料中，加入生物酶催化聚合反应所需的试剂，根据不同的需要，控制反应条件，即可在原有纳米结构上，定点催化高分子聚合物在单、双链DNA上的生成。该方法通过控制反应条件，在金纳米颗粒、DNA折纸等纳米结构修饰上生物酶，利用生物酶在单、双链DNA修饰的材料表面催化生成聚合物。该方法可快速在特定位置上催化有序聚合反应发生。可被应用于在贵金属颗粒等多种材料上形成复合高分子聚合物，从而对材料的光、电活性进行调控。

权利要求书

1.一种基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）根据聚合底物对单、双链DNA吸附能力的不同，设计在纳米结构特定位点上伸出单、双链DNA；（2）在纳米材料上连上生物酶：将贵金属纳米颗粒与官能团修饰的DNA以一定比例混合均匀，逐步加盐老化，随后25℃孵育12hr后，除去多余的DNA，得到连有DNA的贵金属纳米颗粒；生物酶或官能团化的生物酶与相应官能团修饰的DNA混合均匀，25℃孵育一定时间后，超滤除去多余的DNA，即可得到连接有DNA的生物酶；随后生物酶通过DNA连接在贵金属纳米颗粒上，或者生物酶与贵金属纳米颗粒通过DNA连接在同一纳米材料上；（3）催化聚合反应：在已连有生物酶的纳米材料中，加入生物酶催化聚合反应所需的试剂，根据不同的需要，控制反应条件，即可在原有纳米结构上，定点催化高分子聚合物在单、双链DNA上的生成。 2.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，生物酶与聚合位点同时连接在同一纳米结构上。 3.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，所采用的贵金属纳米颗粒为球形、棒性、三角形、立方体、金、银贵金属纳米颗粒，所采用的贵金属纳米颗粒的尺寸在5-300nm。 4.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，所采用的DNA折纸结构为三角形、方形、条带形、立方体、二维或三维DNA纳米结构。 5.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，所述的酶为辣根过氧化物酶（HRP）、亲和素修饰辣根过氧化物酶（avidin-HRP）、链霉亲和素修饰的辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP）。 6.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，所述的生物酶与DNA连接方法可以为巯基DNA与交联剂（3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，SPDP）孵育的生物酶相连，炔基修饰的DNA和叠氮化的生物酶利用铜催化的click反应相连，生物素修饰的DNA与亲和素功能化的生物酶相连，氨基或羧基修饰的DNA和生物酶利用缩合反应等各种化学连接方式连接。 7.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，贵金属纳米颗粒与巯基DNA的孵育比例在1:1000-1:5000。 8.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，所述的催化聚合反应可为酶催化芳胺类、酚类、联胺类聚合反应。 9.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，生物酶催化的底物浓度在0.01-2mM。 10.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，所述的催化聚合反应时间在1-40min。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法。本发明属于纳米高分子材料领域。

背景技术

具有π电子主链的高分子聚合物具有优良的导电性能，在居民的日常生活中具有广泛的应用。传统化学合成方法往往是在极性pH条件下性进行，产量低，副反应多。同时温度控制、压强控制严格，设备投入高，不利于扩大生产。而生物酶是一种具有催化功能、活性可调控的生物催化剂。在催化化学反应时，生物酶具有活性高、专一性强、活性可调控、反应条件温和的优点。因此应用生物酶合成高分子聚合物是一种简单且对环境友好的合成方法，不仅可显著降低生产时的毒性，并且也降低了生产成本，是高分子材料合成的趋势。然而酶促聚合反应通常伴随着副反应的发生，无序的聚合物结构不仅没有电活性，而且会妨害有序聚合物的生成。并且针对纳米级的材料，很难实现定点控制酶促聚合反应发生。因而需要研发一种可定位、快速简便的酶促催化聚合反应的方法。

发明内容

本发明针对现有问题的不足，提出一种基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法。

在本发明的技术方案中，以辣根过氧化物酶为催化剂、以金纳米颗粒和DNA折纸为纳米材料，在单双链DNA上定点进行苯胺聚合反应及3.3-二氨基联苯胺（DAB）聚合反应。

本发明的方法具体为：

一种基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据聚合底物对单、双链DNA吸附能力的不同，设计在纳米结构特定位点上伸出单、双链DNA；

（2）在纳米材料上连上生物酶：

将贵金属纳米颗粒与官能团修饰的DNA以一定比例混合均匀，逐步加盐老化，随后25℃孵育12 hr后，除去多余的DNA，得到连有DNA的贵金属纳米颗粒；生物酶或官能团化的生物酶与相应官能团修饰的DNA混合均匀，25℃孵育一定时间后，超滤除去多余的DNA，即可得到连接有DNA的生物酶；随后生物酶通过DNA连接在贵金属纳米颗粒上，或者生物酶与贵金属纳米颗粒通过DNA连接在同一纳米材料上；

（3）催化聚合反应：

在已连有生物酶的纳米材料中，加入生物酶催化聚合反应所需的试剂，根据不同的需要，控制反应条件，即可在原有纳米结构上，定点催化高分子聚合物在单、双链DNA上的生成。

生物酶与聚合位点同时连接在同一纳米结构上。

所采用的贵金属纳米颗粒为球形、棒性、三角形、立方体、金、银贵金属纳米颗粒，所采用的贵金属纳米颗粒的尺寸在5-300 nm。

所采用的DNA折纸结构为三角形、方形、条带形、立方体、二维或三维DNA纳米结构。

所述的酶为辣根过氧化物酶（HRP）、亲和素修饰辣根过氧化物酶（avidin-HRP）、链霉亲和素修饰的辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP）。

所述的生物酶与DNA连接方法可以为巯基DNA与交联剂（3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，SPDP）孵育的生物酶相连，炔基修饰的DNA和叠氮化的生物酶利用铜催化的click反应相连，生物素修饰的DNA与亲和素功能化的生物酶相连，氨基或羧基修饰的DNA和生物酶利用缩合反应等各种化学连接方式连接。

贵金属纳米颗粒与巯基DNA的孵育比例在1:1000-1:5000。

所述的催化聚合反应可为酶催化芳胺类、酚类、联胺类聚合反应。

生物酶催化的底物浓度在0.01-2 mM。

所述的催化聚合反应时间在1-40 min。

在纳米材料连接生物酶，并以单、双链DNA作为模板，利用不同材料对单双链DNA吸附能力的不同，定点调控高分子聚合物的生成。该方法具有反应迅速、毒性低、生物安全性高的优点。

该方法通过控制反应条件，在金纳米颗粒、DNA折纸等纳米结构修饰上生物酶，利用生物酶在单、双链DNA修饰的材料表面催化生成聚合物。该方法可快速在特定位置上催化有序聚合反应发生。可被应用于在贵金属颗粒等多种材料上形成复合高分子聚合物，从而对材料的光、电活性进行调控。

本发明的优点在于：在材料上修饰生物酶，利用酶催化聚合反应，反应迅速、毒性低、生物安全性高。本发明利用不同材料对单、双链DNA吸附能力的差异，可实现定点聚合。

附图说明

图1为实施案例1聚合反应后的扫描电子显微镜表征图。

图2为实施案例2聚合反应后的原子力显微镜表征图。

图3为实施案例3聚合反应后的原子力显微镜表征图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。

实施例1

将400 μL 50 nm球型金纳米颗粒（Au NPs, 1 nM）与单链巯基修饰的DNA 1以1:3000比例混匀，缓慢加入氯化钠（Na Cl）及磷酸缓冲液（PB）使其终浓度分别达到0.1 M和 10 mM。混合液25℃孵育8 hr后，采用10 mM磷酸盐缓冲液（PBS）离心三次洗去多余的DNA 1。所得沉淀物重新用PBS重悬，按照1:3000比例加入生物素修饰的单链DNA 2，25℃孵育使DNA 1与DNA 2杂交。反应8 hr后，离心三次采用PBS洗去多余的DNA 2，所得沉淀物采用PBS重悬后，加入2 μL 1 mM avidin-HRP孵育30 min后，离心三次洗去多余的avidin-HRP，并用400 μL PBS重悬沉淀物。取50 μL稀释200倍的重悬液滴加在洗净的导电玻片上吸附5 min，PBS冲去游离的颗粒，氮气轻轻吹去溶液后，加入反应液（1 mM苯胺，aniline与1 mM过氧化氢，H2O2）反应5 min后，采用PBS洗去反应液。

图1 为所得结构扫描电子显微镜表征图，从图中可看到HRP催化苯胺在直径50 nm的颗粒表面生长了一层聚苯胺外壳，颗粒尺寸增涨到67.5 nm。

实施例2

设计DNA折纸结构（折纸订书钉链原有序列为DNA序列14-221），DNA折纸B-56位置伸出一条单链-DNA与巯基修饰的互补链DNA 3进行杂交，在A-28、B-28、C-28（分别为DNA 4、5、6）位置分别伸出单链DNA。将2 nM长链M13 DNA与20 nM订书钉链DNA（包含替换链）在1×TAE-Mg2+缓冲液（40 mM 三（羟甲基）氨基甲烷，2 mM醋酸，2 mM 乙二胺四乙酸二钠，12.5 mM醋酸镁，pH 8.0）中混合均匀，95℃孵育5 min后，缓慢退火至25℃，采用100 kd超滤管离心三次，滤去多余单链，回收管内的三角折纸结构，并用紫外定量其浓度。HRP与SPDP以1:20比例孵育2 hr（PBS，pH=8.5），超滤三次洗去多余的SPDP。随后HRP与巯基修饰的DNA 3以1:10比例孵育12 hr（PBS，pH=7.4），超滤洗去多余的DNA 3，并用紫外定量HRP浓度。将5 nM所得三角形DNA折纸结构与50 nM HRP-DNA 3复合物混合均匀，PCR仪从37缓慢退火1hr，利用DNA杂交作用将HRP固定在DNA折纸结构上，随后凝胶电泳除去残余的HRP-DNA 3复合物。所得结构滴加在云母表面吸附3 min后，1×TAE-Mg2+缓冲液轻轻洗去多余的结构。在云母表面滴加含有1 mM 3.3-二氨基联苯胺（DAB）和 1 mM H2O2 的1×TAE-Mg2+反应液，反应8 min洗去多余的反应液。

图2为所得三角形DNA折纸结构在聚合反应结束后的原子力显微镜表征图。从图中可以看出，三角形DNA折纸伸出单链的位置生成聚合物，在显微镜下呈现白色亮点。

实施例3

将棒型金纳米颗粒（Au NRs）与巯基修饰的DNA 7以1:3000比例混匀，缓慢加入氯化钠（Na Cl）及磷酸缓冲液（PB）使其终浓度分别达到0.1 M和 10 mM。混合液25℃孵育8 hr后，采用10 mM PBS 离心三次洗去多余的DNA。设计DNA折纸结构（折纸订书钉链原有序列为DNA序列14-221），DNA折纸B-56位置伸出一条单链DNA与生物素修饰的互补链DNA 5进行杂交，同时在B-45、B-37、B-08、B-16、B-23（分别为DNA 8、9、10、11、12）伸出手臂链，捕获修饰了DNA 4的Au NRs。将2 nM长链M13 DNA与20 nM订书钉链DNA在1×TAE-Mg2+缓冲液中混合均匀，95 ℃孵育5min后，退火至25℃，采用100 kd超滤管滤去多余单链。将5 nM所得DNA折纸结构与50 nM avidin-HRP孵育30 min，将HRP固定在DNA纳米结构上，并与ss-DNA 13修饰的Au NRs孵育8 hr后，凝胶电泳除去残余的avidin-HRP及Au NRs。所得结构滴在云母表面吸附3 min后，1×TAE-Mg2+缓冲液轻轻洗去多余的结构。在云母表面滴加含有1 mM 3.3-二氨基联苯胺（DAB）和 1 mM H2O2 的1×TAE-Mg2+反应液，反应5 min后洗去多余的反应液。

图3为所得三角形DNA折纸结构在聚合反应后的原子力显微镜表征图。从图中可以看出，HRP催化DAB聚合在修饰了ss-DNA 4的Au NRs表面，在原子力显微镜成像下呈现白色亮斑。

<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司

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agcatgtatt tcatcgtagc aatcaaacga ttttttgttt

<210>63

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

acatagcgct gtaaatcgtc gctattcatt tcaattacct

<210>64

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gttaaataca atcgcaagac aaagccttga aa

<210>65

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cccatcctcg ccaacatgta atttaataag gc

<210>66

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tcccaatcca aataagatta ccgcgcccaa taaataatat

<210>67

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tcccttagaa taacgcgaga aaacttttac cgacc

<210>68

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gtgtgataag gcagaggcat tttcagtcct ga

<210>69

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

acaagaaagc aagcaaatca gataacagcc atattattta

<210>70

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gtttgaaatt caaatatatt ttag

<210>71

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

aatagataga gccagtaata agagatttaa tg

<210>72

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gccagttaca aaataataga aggcttatcc ggttatcaac

<210>73

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ttctgaccta aaatataaag taccgactgc agaac

<210>74

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gcgcctgtta ttctaagaac gcgattccag agcctaattt

<210>75

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tcagctaaaa aaggtaaagt aatt

<210>76

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

acgctaacga gcgtctggcg ttttagcgaa cccaacatgt

<210>77

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

acgacaataa atcccgactt gcgggagatc ctgaatctta cca

<210>78

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tgctattttg cacccagcta caattttgtt ttgaagcctt aaa

<210>79

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tcatatgtgt aatcgtaaaa ctagtcattt tc

<210>80

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gtgagaaaat gtgtaggtaa agatacaact tt

<210>81

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ggcatcaaat ttggggcgcg agctagttaa ag

<210>82

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ttcgagctaa gacttcaaat atcgggaacg ag

<210>83

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

acagtcaaag agaatcgatg aacgaccccg gttgataatc

<210>84

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

atagtagtat gcaatgcctg agtaggccgg ag

<210>85

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

aaccagacgt ttagctatat tttcttctac ta

<210>86

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gaataccaca ttcaacttaa gaggaagccc gatcaaagcg

<210>87

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

agaaaagccc caaaaagagt ctggagcaaa caatcaccat

<210>88

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

caatatgacc ctcatatatt ttaaagcatt aa

<210>89

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

catccaataa atggtcaata acctcggaag ca

<210>90

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

aactccaaga ttgcatcaaa aagataatgc agatacataa

<210>91

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cgttctagtc aggtcattgc ctgacaggaa gattgtataa

<210>92

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

caggcaagat aaaaattttt agaatattca ac

<210>93

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gattagagat tagatacatt tcgcaaatca ta

<210>94

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cgccaaaagg aattacagtc agaagcaaag cgcaggtcag

<210>95

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gcaaatattt aaattgagat ctacaaaggc tactgataaa

<210>96

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ttaatgcctt atttcaacgc aagggcaaag aa

<210>97

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ttagcaaata gatttagttt] gaccagtacc tt

<210>98

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

taattgcttt accctgacta ttatgaggca tagtaagagc

<210>99

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ataaagcctt tgcgggagaa gcctggagag ggtag

<210>100

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

taagaggtca attctgcgaa cgagattaag ca

<210>101

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

aacactatca taacccatca aaaatcaggt ctccttttga

<210>102

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

atgaccctgt aatacttcag agca

<210>103

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

taaagctata taacagttga ttcccatttt tg

<210>104

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cggatggcac gagaatgacc ataatcgttt accagacgac

<210>105

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

taattgcttg gaagtttcat tccaaatcgg ttgta

<210>106

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gataaaaacc aaaatattaa acagttcaga aattagagct

<210>107

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

actaaagtac ggtgtcgaat ataa

<210>108

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tgctgtagat ccccctcaaa tgctgcgaga ggcttttgca

<210>109

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

aaagaagttt tgccagcata aatattcatt gactcaacat gtt

<210>110

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

aatactgcgg aatcgtaggg ggtaatagta aaatgtttag act

<210>111

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

agggatagct cagagccacc accccatgtc aa

<210>112

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

caacagttta tgggattttg ctaatcaaaa gg

<210>113

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gccgctttgc tgaggcttgc aggggaaaag gt

<210>114

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gcgcagactc catgttactt agcccgtttt aa

<210>115

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

acaggtagaa agattcatca gttgagattt ag

<210>116

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cctcagaacc gccacccaag cccaatagga acgtaaatga

<210>117

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

attttctgtc agcggagtga gaataccgat at

<210>118

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

attcggtctg cgggatcgtc acccgaaatc cg

<210>119

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cgacctgcgg tcaatcataa gggaacggaa caacattatt

<210>120

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

agacgttacc atgtaccgta acacccctca gaaccgccac

<210>121

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cacgcataag aaaggaacaa ctaagtcttt cc

<210>122

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

attgtgtctc agcagcgaaa gacaccatcg cc

<210>123

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ttaataaaac gaactaaccg aactgaccaa ctcctgataa

<210>124

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

aggtttagta ccgccatgag tttcgtcacc aggatctaaa

<210>125

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gttttgtcag gaattgcgaa taatccgaca at

<210>126

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gacaacaagc atcggaacga gggtgagatt tg

<210>127

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tatcatcgtt gaaagaggac agatggaaga aaaatctacg

<210>128

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

agcgtaacta caaactacaa cgcctatcac cgtactcagg

<210>129

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tagttgcgaa ttttttcacg ttgatcatag tt

<210>130

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gtacaacgag caacggctac agaggatacc ga

<210>131

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

accagtcagg acgttggaac ggtgtacaga ccgaaacaaa

<210>132

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

acagacagcc caaatctcca aaaaaaaatt tctta

<210>133

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

aacagcttgc tttgaggact aaagcgatta ta

<210>134

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ccaagcgcag gcgcataggc tggcagaact ggctcattat

<210>135

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cgaggtgagg ctccaaaagg agcc

<210>136

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

acccccagac tttttcatga ggaacttgct tt

<210>137

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

accttatgcg attttatgac cttcatcaag agcatctttg

<210>138

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cggtttatca ggtttccatt aaacgggaat acact

<210>139

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

aaaacactta atcttgacaa gaacttaatc attgtgaatt

<210>140

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ggcaaaagta aaatacgtaa tgcc

<210>141

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tggtttaatt tcaactcgga tattcattac ccacgaaaga

<210>142

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

accaacctaa aaaatcaacg taacaaataa attgggcttg aga

<210>143

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cctgacgaga aacaccagaa cgagtaggct gctcattcag tga

<210>144

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tcgggagata tacagtaaca gtacaaataa tt

<210>145

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cctgattaaa ggagcggaat tatctcggcc tc

<210>146

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gcaaatcacc tcaatcaata tctgcaggtc ga

<210>147

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cgaccagtac attggcagat tcacctgatt gc

<210>148

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tggcaatttt taacgtcaga tgaaaacaat aacggattcg

<210>149

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

aaggaattac aaagaaacca ccagtcagat ga

<210>150

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ggacattcac ctcaaatatc aaacacagtt ga

<210>151

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ttgacgagca cgtatactga aatggattat ttaataaaag

<210>152

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cctgattgct ttgaattgcg tagattttca ggcatcaata

<210>153

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

taatcctgat tatcattttg cggagaggaa gg

<210>154

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ttatctaaag catcaccttg ctgatggcca ac

<210>155

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

agagatagtt tgacgctcaa tcgtacgtgc tttcctcgtt

<210>156

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gattatacac agaaataaag aaataccaag ttacaaaatc

<210>157

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

taggagcata aaagtttgag taacattgtt tg

<210>158

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tgacctgaca aatgaaaaat ctaaaatatc tt

<210>159

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

agaatcagag cgggagatgg aaatacctac ataacccttc

<210>160

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gcgcagaggc gaattaatta tttgcacgta aattctgaat

<210>161

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

aatggaagcg aacgttatta atttctaaca ac

<210>162

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

taatagatcg ctgagagcca gcagaagcgt aa

<210>163

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gaatacgtaa caggaaaaac gctcctaaac aggaggccga

<210>164

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tcaatagata ttaaatcctt tgccggttag aacct

<210>165

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

caatatttgc ctgcaacagt gccatagagc cg

<210>166

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ttaaagggat tttagatacc gccagccatt gcggcacaga

<210>167

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

acaattcgac aactcgtaat acat

<210>168

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ttgaggatgg tcagtattaa caccttgaat gg

<210>169

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ctattagtat atccagaaca atatcaggaa cggtacgcca

<210>170

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cgcgaactaa aacagaggtg aggcttagaa gtatt

<210>171

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gaatcctgag aagtgtatcg gccttgctgg tactttaatgTAATG

<210>172

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

accaccagca gaagatgata gccc

<210>173

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

taaaacatta gaagaactca aactttttat aatcagtgag

<210>174

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gccaccgagt aaaagaacat cacttgcctg agcgccatta aaa

<210>175

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tctttgatta gtaatagtct gtccatcacg caaattaacc gtt

<210>176

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cgcgtcrgat aggaacgcca tcaactttta ca

<210>177

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

aggaagatgg ggacgacgac agtaatcata tt

<210>178

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ctctagagca agcttgcatg cctggtcagt tg

<210>179

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ccttcaccgt gagacgggca acagcagtca ca

<210>180

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cgagaaagga agggaagcgt actatggttg ct

<210>181

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gctcattttt taaccagcct tcctgtagcc aggcatctgc

<210>182

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cagtttgacg cactccagcc agctaaacga cg

<210>183

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gccattgcga tccccgggta ccgagttttt ct

<210>184

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tttcaccagc ctggccctga gagaaagccg gcgaacgtgg

<210>185

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gtaaccgtct ttcatcaaca ttaaaatttt tgttaaatca

<210>186

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

acgttgtatt ccggcaccgc ttctggcgca tc

<210>187

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ccagggtggc tcgaattcgt aatccagtca cg

<210>188

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tagagcttga cggggagttg cagcaagcgg tcattgggcg

<210>189

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gttaaaattc gcattaatgt gagcgagtaa cacacgttgg

<210>190

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

tgtagatggg tgccggaaac caggaacgcc ag

<210>191

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ggttttccat ggtcatagct gtttgagagg cg

<210>192

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gtttgcgtca cgctggtttg ccccaaggga gcccccgatt

<210>193

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ggataggtac ccgtcggatt ctcctaaacg ttaatatttt

<210>194

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

agttgggtca aagcgccatt cgccccgtaa tg

<210>195

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cgcgcgggcc tgtgtgaaat tgttggcgat ta

<210>196

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

ctaaatcgga accctaagca ggcgaaaatc cttcggccaa

<210>197

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

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资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710096613.3 (22)申请日 2017.02.22 (71)申请人上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司地址 200241 上海市闵行区江川东路28号 (72)发明人何丹农徐艳王萍金彩虹 (74)专利代理机构上海东方易知识产权事务所 31121 代理人唐莉莎 (51)Int.Cl. C12P 13/00(2006.01) (54)发明名称一种基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法 (57)摘要本发明涉及一种基于DNA调控生物酶。

2、在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，根据聚合底物对单、双链DNA吸附能力的不同，设计在纳米结构特定位点上伸出单、双链DNA；在纳米材料上连上生物酶和催化聚合反应，在已连有生物酶的纳米材料中，加入生物酶催化聚合反应所需的试剂，根据不同的需要，控制反应条件，即可在原有纳米结构上，定点催化高分子聚合物在单、双链DNA 上的生成。该方法通过控制反应条件，在金纳米颗粒、 DNA折纸等纳米结构修饰上生物酶，利用生物酶在单、双链DNA修饰的材料表面催化生成聚合物。该方法可快速在特定位置上催化有序聚合反应发生。可被应用于在贵金属颗粒等多种材料上形成复合。

3、高分子聚合物，从而对材料的光、电活性进行调控。权利要求书1页说明书3页序列表33页附图2页 CN 106947790 A 2017.07.14 CN 106947790 A 1.一种基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）根据聚合底物对单、双链DNA吸附能力的不同，设计在纳米结构特定位点上伸出单、双链DNA；（2）在纳米材料上连上生物酶：将贵金属纳米颗粒与官能团修饰的DNA以一定比例混合均匀，逐步加盐老化，随后25 孵育12 hr后，除去多余的DNA，得到连有DNA的贵金属纳米颗粒；生物酶或官能团化的。

4、生物酶与相应官能团修饰的DNA混合均匀， 25孵育一定时间后，超滤除去多余的DNA，即可得到连接有DNA的生物酶；随后生物酶通过DNA连接在贵金属纳米颗粒上，或者生物酶与贵金属纳米颗粒通过DNA连接在同一纳米材料上；（3）催化聚合反应：在已连有生物酶的纳米材料中，加入生物酶催化聚合反应所需的试剂，根据不同的需要，控制反应条件，即可在原有纳米结构上，定点催化高分子聚合物在单、双链DNA上的生成。 2.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，生物酶与聚合位点同时连接在同一纳米结构上。 3.根据权利要求1所述基于。

5、DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，所采用的贵金属纳米颗粒为球形、棒性、三角形、立方体、金、银贵金属纳米颗粒，所采用的贵金属纳米颗粒的尺寸在5-300 nm。 4.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，所采用的DNA折纸结构为三角形、方形、条带形、立方体、二维或三维DNA纳米结构。 5.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，所述的酶为辣根过氧化物酶（HRP）、亲和素修饰辣根过氧化物酶（avidin-HRP）、链霉亲和素修。

6、饰的辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP）。 6.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，所述的生物酶与DNA连接方法可以为巯基DNA与交联剂（3-(2-吡啶二巯基)丙酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯， SPDP）孵育的生物酶相连，炔基修饰的DNA和叠氮化的生物酶利用铜催化的click反应相连，生物素修饰的DNA与亲和素功能化的生物酶相连，氨基或羧基修饰的DNA和生物酶利用缩合反应等各种化学连接方式连接。 7.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，贵金属纳米颗粒与巯基。

7、DNA的孵育比例在1:1000-1:5000。 8.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，所述的催化聚合反应可为酶催化芳胺类、酚类、联胺类聚合反应。 9.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，生物酶催化的底物浓度在0.01-2 mM。 10.根据权利要求1所述基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，所述的催化聚合反应时间在1-40 min。权利要求书 1/1 页 2 CN 106947790 A 2 一种基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反。

8、应的方法技术领域 0001 本发明涉及一种基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法。本发明属于纳米高分子材料领域。背景技术 0002 具有电子主链的高分子聚合物具有优良的导电性能，在居民的日常生活中具有广泛的应用。传统化学合成方法往往是在极性pH条件下性进行，产量低，副反应多。同时温度控制、压强控制严格，设备投入高，不利于扩大生产。而生物酶是一种具有催化功能、活性可调控的生物催化剂。在催化化学反应时，生物酶具有活性高、专一性强、活性可调控、反应条件温和的优点。因此应用生物酶合成高分子聚合物是一种简单且对环境友好的合成方法，不。

9、仅可显著降低生产时的毒性，并且也降低了生产成本，是高分子材料合成的趋势。然而酶促聚合反应通常伴随着副反应的发生，无序的聚合物结构不仅没有电活性，而且会妨害有序聚合物的生成。并且针对纳米级的材料，很难实现定点控制酶促聚合反应发生。因而需要研发一种可定位、快速简便的酶促催化聚合反应的方法。发明内容 0003 本发明针对现有问题的不足，提出一种基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法。 0004 在本发明的技术方案中，以辣根过氧化物酶为催化剂、以金纳米颗粒和DNA折纸为纳米材料，在单双链DNA上定点进行苯胺聚合反应及3.3-二氨基联苯胺（DAB）。

10、聚合反应。 0005 本发明的方法具体为：一种基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）根据聚合底物对单、双链DNA吸附能力的不同，设计在纳米结构特定位点上伸出单、双链DNA；（2）在纳米材料上连上生物酶：将贵金属纳米颗粒与官能团修饰的DNA以一定比例混合均匀，逐步加盐老化，随后25 孵育12 hr后，除去多余的DNA，得到连有DNA的贵金属纳米颗粒；生物酶或官能团化的生物酶与相应官能团修饰的DNA混合均匀， 25孵育一定时间后，超滤除去多余的DNA，即可得到连接有DNA的生物酶；随后生物酶通过DNA连。

11、接在贵金属纳米颗粒上，或者生物酶与贵金属纳米颗粒通过DNA连接在同一纳米材料上；（3）催化聚合反应：在已连有生物酶的纳米材料中，加入生物酶催化聚合反应所需的试剂，根据不同的需要，控制反应条件，即可在原有纳米结构上，定点催化高分子聚合物在单、双链DNA上的生成。说明书 1/3 页 3 CN 106947790 A 3 0006 生物酶与聚合位点同时连接在同一纳米结构上。 0007 所采用的贵金属纳米颗粒为球形、棒性、三角形、立方体、金、银贵金属纳米颗粒，所采用的贵金属纳米颗粒的尺寸在5-300 nm。 0008 所采用的DNA折纸结构为三角形、方形、条。

12、带形、立方体、二维或三维DNA纳米结构。 0009 所述的酶为辣根过氧化物酶（HRP）、亲和素修饰辣根过氧化物酶（avidin-HRP）、链霉亲和素修饰的辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP）。 0010 所述的生物酶与DNA连接方法可以为巯基DNA与交联剂（3-(2-吡啶二巯基)丙酸N- 羟基琥珀酰亚胺酯， SPDP）孵育的生物酶相连，炔基修饰的DNA和叠氮化的生物酶利用铜催化的click反应相连，生物素修饰的DNA与亲和素功能化的生物酶相连，氨基或羧基修饰的 DNA和生物酶利用缩合反应等各种化学连接方式连接。 0011 贵金属纳米颗粒与巯基DN。

13、A的孵育比例在1:1000-1:5000。 0012 所述的催化聚合反应可为酶催化芳胺类、酚类、联胺类聚合反应。 0013 生物酶催化的底物浓度在0.01-2 mM。 0014 所述的催化聚合反应时间在1-40 min。 0015 在纳米材料连接生物酶，并以单、双链DNA作为模板，利用不同材料对单双链DNA吸附能力的不同，定点调控高分子聚合物的生成。该方法具有反应迅速、毒性低、生物安全性高的优点。 0016 该方法通过控制反应条件，在金纳米颗粒、 DNA折纸等纳米结构修饰上生物酶，利用生物酶在单、双链DNA修饰的材料表面催化生成聚合物。该方法可快速在特定位置上催。

14、化有序聚合反应发生。可被应用于在贵金属颗粒等多种材料上形成复合高分子聚合物，从而对材料的光、电活性进行调控。 0017 本发明的优点在于：在材料上修饰生物酶，利用酶催化聚合反应，反应迅速、毒性低、生物安全性高。本发明利用不同材料对单、双链DNA吸附能力的差异，可实现定点聚合。附图说明 0018 图1为实施案例1聚合反应后的扫描电子显微镜表征图。 0019 图2为实施案例2聚合反应后的原子力显微镜表征图。 0020 图3为实施案例3聚合反应后的原子力显微镜表征图。具体实施方式 0021 以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明。

15、的进一步说明，而不限制本发明的范围。 0022 实施例1 将400 L 50 nm球型金纳米颗粒（Au NPs, 1 nM）与单链巯基修饰的DNA 1以1:3000比例混匀，缓慢加入氯化钠（Na Cl）及磷酸缓冲液（PB）使其终浓度分别达到0.1 M和 10 mM。混合液25孵育8 hr后，采用10 mM磷酸盐缓冲液（PBS）离心三次洗去多余的DNA 1。所得沉淀物重新用PBS重悬，按照1:3000比例加入生物素修饰的单链DNA 2， 25孵育使DNA 1与 DNA 2杂交。反应8 hr后，离心三次采用PBS洗去多余的DNA 2，所得沉淀物采用PBS重悬后。

16、，加入2 L 1 mM avidin-HRP孵育30 min后，离心三次洗去多余的avidin-HRP，并用400 L 说明书 2/3 页 4 CN 106947790 A 4 PBS重悬沉淀物。取50 L稀释200倍的重悬液滴加在洗净的导电玻片上吸附5 min， PBS冲去游离的颗粒，氮气轻轻吹去溶液后，加入反应液（1 mM苯胺， aniline与1 mM过氧化氢， H2O2）反应5 min后，采用PBS洗去反应液。 0023 图1 为所得结构扫描电子显微镜表征图，从图中可看到HRP催化苯胺在直径50 nm 的颗粒表面生长了一层聚苯胺外壳，颗粒尺寸增涨到67.5 nm。

17、。 0024 实施例2 设计DNA折纸结构（折纸订书钉链原有序列为DNA序列14-221）， DNA折纸B-56位置伸出一条单链-DNA与巯基修饰的互补链DNA 3进行杂交，在A-28、 B-28、 C-28 （分别为DNA 4、 5、 6）位置分别伸出单链DNA。将2 nM长链M13 DNA与20 nM订书钉链DNA （包含替换链）在1TAE- Mg2+缓冲液（40 mM 三（羟甲基）氨基甲烷， 2 mM醋酸， 2 mM 乙二胺四乙酸二钠， 12.5 mM醋酸镁， pH 8.0）中混合均匀， 95孵育5 min后，缓慢退火至25，采用100 kd超滤管离心三次，。

18、滤去多余单链，回收管内的三角折纸结构，并用紫外定量其浓度。 HRP与SPDP以1:20比例孵育2 hr （PBS， pH=8.5），超滤三次洗去多余的SPDP。随后HRP与巯基修饰的DNA 3以1:10比例孵育12 hr （PBS， pH=7.4），超滤洗去多余的DNA 3，并用紫外定量HRP浓度。将5 nM所得三角形DNA折纸结构与50 nM HRP-DNA 3复合物混合均匀， PCR仪从37缓慢退火1hr，利用DNA杂交作用将HRP固定在DNA折纸结构上，随后凝胶电泳除去残余的HRP-DNA 3复合物。所得结构滴加在云母表面吸附3 min后， 1TAE-M。

19、g2+缓冲液轻轻洗去多余的结构。在云母表面滴加含有 1 mM 3.3-二氨基联苯胺（DAB）和 1 mM H2O2 的1TAE-Mg2+反应液，反应8 min洗去多余的反应液。 0025 图2为所得三角形DNA折纸结构在聚合反应结束后的原子力显微镜表征图。从图中可以看出，三角形DNA折纸伸出单链的位置生成聚合物，在显微镜下呈现白色亮点。 0026 实施例3 将棒型金纳米颗粒（Au NRs）与巯基修饰的DNA 7以1:3000比例混匀，缓慢加入氯化钠（Na Cl）及磷酸缓冲液（PB）使其终浓度分别达到0.1 M和 10 mM。混合液25孵育8 hr后，采用10。

20、 mM PBS 离心三次洗去多余的DNA。设计DNA折纸结构（折纸订书钉链原有序列为DNA 序列14-221）， DNA折纸B-56位置伸出一条单链DNA与生物素修饰的互补链DNA 5进行杂交，同时在B-45、 B-37、 B-08、 B-16、 B-23 （分别为DNA 8、 9、 10、 11、 12）伸出手臂链，捕获修饰了 DNA 4的Au NRs。将2 nM长链M13 DNA与20 nM订书钉链DNA在1TAE-Mg2+缓冲液中混合均匀， 95 孵育5min后，退火至25，采用100 kd超滤管滤去多余单链。将5 nM所得DNA折纸结构与50 nM avidin。

21、-HRP孵育30 min，将HRP固定在DNA纳米结构上，并与ss-DNA 13修饰的 Au NRs孵育8 hr后，凝胶电泳除去残余的avidin-HRP及Au NRs。所得结构滴在云母表面吸附3 min后， 1TAE-Mg2+缓冲液轻轻洗去多余的结构。在云母表面滴加含有1 mM 3.3-二氨基联苯胺（DAB）和 1 mM H2O2 的1TAE-Mg2+反应液，反应5 min后洗去多余的反应液。 0027 图3为所得三角形DNA折纸结构在聚合反应后的原子力显微镜表征图。从图中可以看出， HRP催化DAB聚合在修饰了ss-DNA 4的Au NRs表面，在原子力显微镜成像。

22、下呈现白色亮斑。说明书 3/3 页 5 CN 106947790 A 5 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司一种基于DNA调控生物酶在纳米材料上定点催化聚合反应的方法 221 1 25 DNA 人工序列 misc feature (1) 巯基修饰 ttttttataac agctgctgca gctcg 2 25 DNA 人工序列 misc feature (1) 生物素修饰 tttttcgagc tgcagcagct gttat 3 28 DNA 人工序列 misc feature (28) 巯基修饰 attattatta ttattattat tatttttt 4 68 DN。

23、A 人工序列 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaattttat aagagcaaga aacatggcat gattaagact ccgacttg 5 68 序列表 1/33 页 6 CN 106947790 A 6 DNA 人工序列 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaattttga taaaaaccaa aatattaaac agttcagaaa ttagagct 6 68 DNA 人工序列 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaattttga atcctgagaa gtgtatcggc cttgctggta ctttaatg 7 28 DNA 人。

24、工序列 misc feature (28) 巯基修饰 tttttttttt tttttttttt tttttttt 8 68 DNA 人工序列 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatttttt aataaaacga actaaccgaa ctgaccaact cctgataa 9 60 DNA 人工序列 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaattttac aggtagaaag attcatcagt tgagatttag 10 65 DNA 人工序列 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaattttga ataccacatt caacttaaga gga。

25、agcccga tcaaa 11 68 DNA 人工序列序列表 2/33 页 7 CN 106947790 A 7 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaattttcg ccaaaaggaa ttacagtcag aagcaaagcg caggtcag 12 68 DNA 人工序列 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaattttaa cactatcata acccatcaaa aatcaggtct ccttttga 13 28 DNA 人工序列 misc feature (28) 生物素修饰 attattatta ttattattat tatttttt 14 32 。

26、DNA 人工序列 cggggtttcc tcaagagaag gattttgaat ta 15 32 DNA 人工序列 agcgtcatgt ctctgaattt accgactacc tt 16 32 DNA 人工序列 ttcataatcc ccttattagc gtttttctta cc 17 32 DNA 人工序列 atggtttatg tcacaatcaa tagatattaa ac 序列表 3/33 页 8 CN 106947790 A 8 18 40 DNA 人工序列 tttgatgatt aagaggctga gacttgctca gtaccaggcg 19 32 DNA 人工序。

27、列 ccgcaaccca gaatggaaag cgcaacatgg ct 20 32 DNA 人工序列 aaagacaaca ttttcggtca tagccaaaat ca 21 40 DNA 人工序列 gacgggagaa ttaactcgga ataagtttat ttccagcgcc 22 40 DNA 人工序列 agtaagtgcc gtcgagctga aacatgaaag tatacaggag 23 32 DNA 人工序列 tgtactggaa atcctcatta aagcagagcc ac 24 32 DNA 人工序列 caccggaaag cgcgttttca tcgga。

28、agggc ga 序列表 4/33 页 9 CN 106947790 A 9 25 40 DNA 人工序列 cattcaacaa acgcaaagac accagaacac cctgaacaaa 26 40 DNA 人工序列 tttaacggtt cggaacctat tattagggtt gatataagta 27 32 DNA 人工序列 cacagagcat attcacaaac aaattaataa gt 28 32 DNA 人工序列 ggagggaatt tagcgtcaga ctgtccgcct cc 29 40 DNA 人工序列 gtcagagggt aattgatggc aaca。

29、tataaa agcgattgagTTGAG 30 40 DNA 人工序列 tagcccggaa taggtgaatg ccccctgcct atggtcagtg 31 32 DNA 人工序列 ccttgagtca gacgattggc cttgcgccac cc 序列表 5/33 页 10 CN 106947790 A 10 32 32 DNA 人工序列 tcagaaccca gaatcaagtt tgccggtaaa ta 33 40 DNA 人工序列 ttgacggaaa tacatacata aagggcgcta atatcagaga 34 35 DNA 人工序列 cagagccagg。

30、 aggttgaggc aggtaacagt gcccg 35 32 DNA 人工序列 attaaaggcc gtaatcagta gcgagccacc ct 36 40 DNA 人工序列 gataacccac aagaatatta gcaaacgtag aaaattattc 37 24 DNA 人工序列 gccgccagca ttgacaccac cctc 38 32 DNA 人工序列 agagccgcac catcgatagc agcatgaatt at 序列表 6/33 页 11 CN 106947790 A 11 39 40 DNA 人工序列 caccgtcacc ttattacgca。

31、 gtattgagtt aagcccaata 40 32 DNA 人工序列 agccatttaa acgtcaccaa tgaacaccag aacca 41 40 DNA 人工序列 ataagagcaa gaaacatggc atgattaaga ctccgacttg 42 24 DNA 人工序列 ccattagcaa ggccggggga atta 43 40 DNA 人工序列 gagccagcga atacccaaaa gaacatgaaa tagcaatagc 44 43 DNA 人工序列 tatcttaccg aagcccaaac gcaataataa cgaaaatcac cag 。

32、45 43 DNA 人工序列 cagaaggaaa ccgaggtttt taagaaaagt aagcagatag ccg 序列表 7/33 页 12 CN 106947790 A 12 46 32 DNA 人工序列 ccttttttca tttaacaatt tcataggatt ag 47 32 DNA 人工序列 tttaacctat cataggtctg agagttccag ta 48 32 DNA 人工序列 agtataaaat atgcgttata caaagccatc tt 49 32 DNA 人工序列 caagtacctc attccaagaa cgggaaattc at 5。

33、0 32 DNA 人工序列 agagaataac ataaaaacag ggaagcgcat ta 51 40 DNA 人工序列 aaaacaaaat taattaaatg gaaacagtac attagtgaat 52 32 DNA 人工序列 ttatcaaacc ggcttaggtt gggtaagcct gt 序列表 8/33 页 13 CN 106947790 A 13 53 32 DNA 人工序列 ttagtatcgc caacgctcaa cagtcggctg tc 54 40 DNA 人工序列 tttccttagc actcatcgag aacaatagca gcctttaca。

34、g 55 40 DNA 人工序列 agagtcaaaa atcaatatat gtgatgaaac aaacatcaag 56 32 DNA 人工序列 actagaaata tataactata tgtacgctga ga 57 32 DNA 人工序列 tcaataatag ggcttaattg agaatcataa tt 58 40 DNA 人工序列 aacgtcaaaa atgaaaagca agccgttttt atgaaaccaa 59 40 DNA 人工序列 gagcaaaaga agatgagtga ataaccttgc ttatagctta 序列表 9/33 页 14 CN 10。

35、6947790 A 14 60 32 DNA 人工序列 atttaagaaa tgctgatgca aatcagaata aa 61 32 DNA 人工序列 caccggaatc gccatattta acaaaattta cg 62 40 DNA 人工序列 agcatgtatt tcatcgtagc aatcaaacga ttttttgttt 63 40 DNA 人工序列 acatagcgct gtaaatcgtc gctattcatt tcaattacct 64 32 DNA 人工序列 gttaaataca atcgcaagac aaagccttga aa 65 32 DNA 人工序列 c。

36、ccatcctcg ccaacatgta atttaataag gc 66 40 DNA 人工序列 tcccaatcca aataagatta ccgcgcccaa taaataatat 序列表 10/33 页 15 CN 106947790 A 15 67 35 DNA 人工序列 tcccttagaa taacgcgaga aaacttttac cgacc 68 32 DNA 人工序列 gtgtgataag gcagaggcat tttcagtcct ga 69 40 DNA 人工序列 acaagaaagc aagcaaatca gataacagcc atattattta 70 24 DNA。

37、人工序列 gtttgaaatt caaatatatt ttag 71 32 DNA 人工序列 aatagataga gccagtaata agagatttaa tg 72 40 DNA 人工序列 gccagttaca aaataataga aggcttatcc ggttatcaac 73 35 DNA 人工序列 ttctgaccta aaatataaag taccgactgc agaac 序列表 11/33 页 16 CN 106947790 A 16 74 40 DNA 人工序列 gcgcctgtta ttctaagaac gcgattccag agcctaattt 75 24 DNA 人。

38、工序列 tcagctaaaa aaggtaaagt aatt 76 40 DNA 人工序列 acgctaacga gcgtctggcg ttttagcgaa cccaacatgt 77 43 DNA 人工序列 acgacaataa atcccgactt gcgggagatc ctgaatctta cca 78 43 DNA 人工序列 tgctattttg cacccagcta caattttgtt ttgaagcctt aaa 79 32 DNA 人工序列 tcatatgtgt aatcgtaaaa ctagtcattt tc 80 32 DNA 人工序列 gtgagaaaat gtgtagg。

39、taa agatacaact tt 序列表 12/33 页 17 CN 106947790 A 17 81 32 DNA 人工序列 ggcatcaaat ttggggcgcg agctagttaa ag 82 32 DNA 人工序列 ttcgagctaa gacttcaaat atcgggaacg ag 83 40 DNA 人工序列 acagtcaaag agaatcgatg aacgaccccg gttgataatc 84 32 DNA 人工序列 atagtagtat gcaatgcctg agtaggccgg ag 85 32 DNA 人工序列 aaccagacgt ttagctatat 。

40、tttcttctac ta 86 40 DNA 人工序列 gaataccaca ttcaacttaa gaggaagccc gatcaaagcg 87 40 DNA 人工序列 agaaaagccc caaaaagagt ctggagcaaa caatcaccat 序列表 13/33 页 18 CN 106947790 A 18 88 32 DNA 人工序列 caatatgacc ctcatatatt ttaaagcatt aa 89 32 DNA 人工序列 catccaataa atggtcaata acctcggaag ca 90 40 DNA 人工序列 aactccaaga ttgcatc。

41、aaa aagataatgc agatacataa 91 40 DNA 人工序列 cgttctagtc aggtcattgc ctgacaggaa gattgtataa 92 32 DNA 人工序列 caggcaagat aaaaattttt agaatattca ac 93 32 DNA 人工序列 gattagagat tagatacatt tcgcaaatca ta 94 40 DNA 人工序列 cgccaaaagg aattacagtc agaagcaaag cgcaggtcag 序列表 14/33 页 19 CN 106947790 A 19 95 40 DNA 人工序列 gcaaat。

42、attt aaattgagat ctacaaaggc tactgataaa 96 32 DNA 人工序列 ttaatgcctt atttcaacgc aagggcaaag aa 97 32 DNA 人工序列 ttagcaaata gatttagttt gaccagtacc tt 98 40 DNA 人工序列 taattgcttt accctgacta ttatgaggca tagtaagagc 99 35 DNA 人工序列 ataaagcctt tgcgggagaa gcctggagag ggtag 100 32 DNA 人工序列 taagaggtca attctgcgaa cgagattaa。

43、g ca 101 40 DNA 人工序列 aacactatca taacccatca aaaatcaggt ctccttttga 序列表 15/33 页 20 CN 106947790 A 20 102 24 DNA 人工序列 atgaccctgt aatacttcag agca 103 32 DNA 人工序列 taaagctata taacagttga ttcccatttt tg 104 40 DNA 人工序列 cggatggcac gagaatgacc ataatcgttt accagacgac 105 35 DNA 人工序列 taattgcttg gaagtttcat tccaaatcg。

44、g ttgta 106 40 DNA 人工序列 gataaaaacc aaaatattaa acagttcaga aattagagct 107 24 DNA 人工序列 actaaagtac ggtgtcgaat ataa 108 40 DNA 人工序列 tgctgtagat ccccctcaaa tgctgcgaga ggcttttgca 序列表 16/33 页 21 CN 106947790 A 21 109 43 DNA 人工序列 aaagaagttt tgccagcata aatattcatt gactcaacat gtt 110 43 DNA 人工序列 aatactgcgg aatcg。

45、taggg ggtaatagta aaatgtttag act 111 32 DNA 人工序列 agggatagct cagagccacc accccatgtc aa 112 32 DNA 人工序列 caacagttta tgggattttg ctaatcaaaa gg 113 32 DNA 人工序列 gccgctttgc tgaggcttgc aggggaaaag gt 114 32 DNA 人工序列 gcgcagactc catgttactt agcccgtttt aa 115 32 DNA 人工序列 acaggtagaa agattcatca gttgagattt ag 序列表 17/3。

46、3 页 22 CN 106947790 A 22 116 40 DNA 人工序列 cctcagaacc gccacccaag cccaatagga acgtaaatga 117 32 DNA 人工序列 attttctgtc agcggagtga gaataccgat at 118 32 DNA 人工序列 attcggtctg cgggatcgtc acccgaaatc cg 119 40 DNA 人工序列 cgacctgcgg tcaatcataa gggaacggaa caacattatt 120 40 DNA 人工序列 agacgttacc atgtaccgta acacccctca ga。

47、accgccac 121 32 DNA 人工序列 cacgcataag aaaggaacaa ctaagtcttt cc 122 32 DNA 人工序列 attgtgtctc agcagcgaaa gacaccatcg cc 序列表 18/33 页 23 CN 106947790 A 23 123 40 DNA 人工序列 ttaataaaac gaactaaccg aactgaccaa ctcctgataa 124 40 DNA 人工序列 aggtttagta ccgccatgag tttcgtcacc aggatctaaa 125 32 DNA 人工序列 gttttgtcag gaattgcgaa taatccgaca at 126 32 DNA 人工序列 gacaacaagc atcggaacga gggtgagatt tg 127 40 DNA 人工序列 tatcatcgtt gaaagaggac agatggaaga aaaatctacg 128 40 DNA 人工序列 agcgtaacta caaactacaa cgcctatcac cgtactcagg 129 32 DNA 人工序列 tagttgcgaa tt。

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