用于控制血管生成的方法 技术领域 本 发 明 属 于 医 疗 诊 断 和 治 疗 领 域， 更 特 别 地， 属于诊断对象体内血管生成 (vasculogenesis) 的出现和 / 或进展的领域。本发明目的在于诊断血管生成的进展， 尤其 是诊断与医疗方法相关的血管生成的进展。 本发明进一步涉及用于诊断患者体内血管生成 的出现和 / 或进展的生物标记物、 用于诊断患者体内血管生成的出现和或进展的方法、 用 于进行此种方法的试剂盒和在此种方法中有用的微阵列和诊断试剂。 本发明进一步涉及抑 制或刺激需要此种抑制或刺激的对象体内血管生成的方法和适合用在此种治疗方法中的 药物组合物。
背景技术
缺血性心脏病类疾病的特点为供应到心脏的血液减少， 它是西方世界中导致发 病和死亡的主要原因。由于患者所需的加强医疗护理， 该疾病构成健康护理医疗费用 和健康护理基础设施的主要投资。该疾病的早期诊断是困难的。实际上， 没有适当的测试可用于诊断进行性缺血 (ongoing ischemia) 和代偿性新血管形成 (compensatory neovascularization)。
缺 血 性 心 脏 病 的 当 前 诊 断 基 于 功 率 计 ( 运 动 ) 测 试 (ergometric(exercise) testing) 或心肌灌注成像。 这些技术具有有限的灵敏度和排他性。 更可靠的方法是进行冠 脉血管造影术。然而， 此种经皮和侵入性手段伴有相当大的风险。
所以， 需要用于诊断和预后 ( 预测 ) 缺血性心脏病的可靠的生物标记物。 发明内容 本发明现在已发现在循环 EPC 中可特异性检测与成年血管生成过程 ( 新血管发 育 ) 相关的基因表达， 循环 EPC 中的特异性基因表达谱因而可用于诊断和预后血管生成。 本 发明人获得这项发现是在注意到小鼠 Flk1+ 细胞中大量基因在血管生成 ( 新血管发育 ) 期 间被上调之后。详细的跨物种验证表明这些基因在缺血期间在青春期小鼠模型中被上调， 在跨种验证中细察了小鼠和斑马鱼中发育的血管树中与血管生成相关的这些基因及其表 达产物。这将这些基因的表达与血管生成联系在一起。本发明人因此现在已发现通过检测 代偿性新血管生成过程， 特别是通过检测与活化的 EPC 相关的基因表达谱可诊断人体中的 血管形成。
在第一方面， 本发明现在提供检测对象中血管生成的出现和 / 或进展的方法， 所 述方法包括在所述对象循环流体的样本中检测活化的内皮祖细胞 (EPC) 的出现。
在此种方法的优选实施方式中， 所述血管生成的进展与旨在减少或增多血管生成 的医疗治疗方法相关。
在此种方法的可替换的优选实施方式中， 所述血管生成的出现和 / 或进展表示血 管发生 (angiogenetic) 过程的出现和 / 或进展。
在本发明方法中， 检测活化的 EPC 的步骤合适地包含在所述样本中检测 EPC 中基
因表达水平的增大， 该基因为以下组中的至少 1 个基因、 甚至更优选至少 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25、 30、 35 个或所有基因， 该组由下列基因组成， 即， ADORA1、 ADORA2A、 ADORA2B、 ADORA3、 AGTRL1(APLNR)、 AMPH、 APLN、 CCBE1、 CDC42、 CGNL1、 CREBBP、 CRIP1、 CRIP2、 CRIP3、 CYB5B、 DLL4、 DUSP5、 EEA1、 egr-1、 ELK1、 ELK3、 ELK4(SAP1)、 EP300、 ERG1(KCNH2)、 ETS1、 ETS2、 EXOC3L、 FGD1、 FGD2、 FGD3、 FGD4、 FGD5、 FLT1、 FST、 GATA6、 GRRP1、 HO-1(HMOX1)、 HO-2(HMOX2)、 IFNG、 IL1A、 IL1B、 LAMA4、 Lamb1-1、 LGMN、 MMP3、 Nos2、 PAI1、 PHD1、 PLVAP、 RAB5a、 RIN3、 ROCK2、 SOX18、 SOX7、 SRF、 STAB1、 STAB2、 STUB1、 TFEC、 THBS1、 THBS2、 THBS3、 THBS4、 THBS5、 THSD1、 TNFAIP8， 和 XLKD1(LYVE1)， 该基因又优选选自下组中至少 1 个基因、 还更优选至少 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25、 30 个或所有基因， 该组由下列基因组成， 即， ADORA2A、 AGTRL1(APLNR)、 APLN、 CCBE1、 CGNL1、 CRIP2、 CYB5B、 DLL4、 DUSP5、 ELK3、 ERG1(KCNH2)、 ETS1、 ETS2、 EXOC3L、 FGD5、 GRRP1、 HO-1(HMOX1)、 HO-2(HMOX2)、 LAMA4、 Lamb1-1、 LGMN、 PLVAP、 RIN3、 ROCK2、 SOX7、 SOX18、 STAB1、 STAB2、 STUB1、 TFEC、 THSD1、 TNFAIP8， 和 XLKD1(LYVE1)。基因表达水平的提 高可通过任何合适的方法检测并可针对核酸 ( 例如， mRNA) 或蛋白质的检测进行。活化的 EPC 可分泌上面提及的基因的蛋白质表达产物， 因而通过检测全血中蛋白质， 而不是它的 EPC 组分中的蛋白质， 可检测 EPC 内基因表达水平。 这个方法优于现有技术方法的重要优势 ( 循环 EPC 数目的计数或功率计 ( 运动 ) 测试 ) 在于本方法更灵敏且可在前期检测该疾病。
基于此， 本发明人已发现可在基因和这些基因产物中找到用于检测血管生成在患 者中的出现和 / 或进展的潜在标记物， 且本发明人发现可在血液、 血清或血细胞组分中检 测这些标记物， 其中， 这些基因是指在血管生成期间在活化的 EPC 中被上调的基因。
在另一方面， 本发明现在提供用于诊断或预后患者新血管疾病的生物标记物， 所 述生物标记物包含内皮祖细胞 (EPC) 的基因表达产物， 内皮祖细胞基因表达在血管生成期 间被调节。优选地， 所述生物标记物包含内皮祖细胞 (EPC) 的基因表达产物， 与血管发生期 间相比， 内皮祖细胞基因表达在血管生成期间被上调。
大体上， 本发明以检测对象血液中活化的 EPC 为基础。活化的 EPC， 作为循环 EPC 标准池 (normal pool) 的部分， 最好通过它们的特异基因库 (repertoire)( 基因表达谱 ) 鉴定。因为一些基因表达产物可被周围血液中的细胞分泌， 因此也可在全血细胞中检测被 分泌的生物标记物。
在又一个优选的实施方式中， 所述 EPC 或 PMN 出现在患者的外周血中。优选地， 所 + 述 EPC 是 Flk1 (Flk1 阳性 ) 细胞。最优选地， 活化的 EPC 显示基因表达谱， 其中当与它们在 未活化的 EPC 中的表达水平相比时， 优选选自下组中的至少 1 个基因、 甚至更优选至少 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25、 30、 35 个或所有基因被上调， 该组由下列基因组成， 即， ADORA1、 ADORA2A、 ADORA2B、 ADORA3、 AGTRL1(APLNR)、 AMPH、 APLN、 CCBE1、 CDC42、 CGNL1、 CREBBP、 CRIP1、 CRIP2、 CRIP3、 CYB5B、 DLL4、 DUSP5、 EEA1、 egr-1、 ELK1、 ELK3、 ELK4(SAP1)、 EP300、 ERG1(KCNH2)、 ETS1、 ETS2、 EXOC3L、 FGD1、 FGD2、 FGD3、 FGD4、 FGD5、 FLT1、 FST、 GATA6、 GRRP1、 HO-1(HMOX1)、 HO-2(HMOX2)、 IFNG、 IL1A、 IL1B、 LAMA4、 Lamb1-1、 LGMN、 MMP3、 Nos2、 PAI1、 PHD1、 PLVAP、 RAB5a、 RIN3、 ROCK2、 SOX18、 SOX7、 SRF、 STAB1、 STAB2、 STUB1、 TFEC、 THBS1、 THBS2、 THBS3、 THBS4、 THBS5、 THSD1、 TNFAIP8 和 XLKD1(LYVE1)， 还优选选自下组中至少 1 个基因、 又更优选 至少 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25、 30 个或所有基因被上调， 该组由下列基因组成， 即， ADORA2A、
AGTRL1(APLNR)、 APLN、 CCBE1、 CGNL1、 CRIP2、 CYB5B、 DLL4、 DUSP5、 ELK3、 ERG1(KCNH2)、 ETS1、 ETS2、 EXOC3L、 FGD5、 GRRP1、 HO-1(HMOX1)、 HO-2(HMOX2)、 LAMA4、 Lamb1-1、 LGMN、 PLVAP、 RIN3、 ROCK2、 SOX7、 SOX18、 STAB1、 STAB2、 STUB1、 TFEC、 THSD1、 TNFAIP8 和 XLKD1(LYVE1)。
本发明生物标记物优选为选自下组中的至少 1 个基因、 甚至更优选至少 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25、 30、 35 个或所有基因的表达产物 ( 多肽或多核糖核苷酸 )， 该组由下列 基 因 组 成， 即， ADORA1、 ADORA2A、 ADORA2B、 ADORA3、 AGTRL1(APLNR)、 AMPH、 APLN、 CCBE1、 CDC42、 CGNL1、 CREBBP、 CRIP1、 CRIP2、 CRIP3、 CYB5B、 DLL4、 DUSP5、 EEA1、 egr-1、 ELK1、 ELK3、 ELK4(SAP1)、 EP300、 ERG1(KCNH2)、 ETS1、 ETS2、 EXOC3L、 FGD1、 FGD2、 FGD3、 FGD4、 FGD5、 FLT1、 FST、 GATA6、 GRRP1、 HO-1(HMOX1)、 HO-2(HMOX2)、 IFNG、 IL1A、 IL1B、 LAMA4、 Lamb1-1、 LGMN、 MMP3、 Nos2、 PAI1、 PHD1、 PLVAP、 RAB5a、 RIN3、 ROCK2、 SOX18、 SOX7、 SRF、 STAB1、 STAB2、 STUB1、 TFEC、 THBS1、 THBS2、 THBS3、 THBS4、 THBS5、 THSD1、 TNFAIP8， 和 XLKD1(LYVE1)， 还优选为选自 下组中的至少 1 个基因、 又更优选至少 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25、 30 个或所有基因的表达产物 ( 多肽或多核糖核苷酸 )， 该组由下列基因组成， 即， ADORA2A、 AGTRL1(APLNR)、 APLN、 CCBE1、 CGNL1、 CRIP2、 CYB5B、 DLL4、 DUSP5、 ELK3、 ERG1(KCNH2)、 ETS1、 ETS2、 EXOC3L、 FGD5、 GRRP1、 HO-1(HMOX1)、 HO-2(HMOX2)、 LAMA4、 Lamb1-1、 LGMN、 PLVAP、 RIN3、 ROCK2、 SOX7、 SOX18、 STAB1、 STAB2、 STUB1、 TFEC、 THSD1、 TNFAIP8， 和 XLKD1(LYVE1)。 本发明生物标记物可具有上面提到的基因之一的表达产物的形式， 或可采取蛋白 质谱或 RNA 谱的形式。
在另一方面， 本发明提供了如上定义的生物标记物在检测对象中血管生成的出现 和 / 或进展中的用途。
在 另 一 方 面， 本发明提供了如上定义的生物标记物作为替代终点标记物 (surrogate end-point marker)， 在确定治疗方法功效方面的用途。
在另一方面， 本发明提供了用于检测对象中血管生成的出现和 / 或进展的方法， 该方法包括在所述对象血液中检测根据本发明的生物标记物。优选地， 所述方法在所述对 象的血液样本上进行。在所述方法的其它优选实施方式中， 检测生物标记物的步骤可通过 使用微阵列进行。在所述方法的可替换的优选实施方式中， 检测生物标记物的步骤通过使 用串联质谱法 (MS-MS)、 通过 MALDI-FT 质谱法、 MALDI-FT-ICR 质谱法、 MALDI 三重四极杆质 谱法、 QPCR 或其它杂交方法或免疫分析进行。实际上， 任何合适的检测方法均可用于鉴定 生物标记 RNA 或蛋白质。
在另一方面， 本发明提供了试剂盒， 该试剂盒用于进行根据本发明检测对象中血 管生成的出现和 / 或进展的方法。所述试剂盒包含至少一个如上文定义的生物标记物， 或 特异性结合到所述生物标记物的特异性结合伴侣 (partner)。根据本发明的试剂盒可选地 进一步包含下面的一个或多个 ：
- 至少一个参考样本或对照样本 ；
- 关于生物标记物的参考值的信息 ；
- 至少一个能够结合到所述特异性结合伴侣的测试化合物 ；
- 至少一个用于检测所述生物标记物和所述特异性结合伴侣之间的结合的可检测 的标记物。
在另一方面， 本发明提供了微阵列， 该微阵列用于进行根据本发明检测对象中血
管生成的出现和 / 或进展的方法。所述微阵列包含特异性结合伴侣， 该伴侣特异性结合到 至少两种如上文定义的生物标记物上， 其中该生物标记物结合在固体载体上。
在另一方面， 本发明提供了特异性结合到如上文定义的生物标记物上的诊断试 剂。 优选地， 该诊断试剂是与所述生物标记物在严格条件下特异性杂交的抗体或核酸分子。
在另一方面， 本发明提供了包含本发明诊断试剂的诊断组合物。
在另一方面， 本发明提供了本发明诊断组合物在检测对象中血管生成的出现和 / 或进展方面的用途。
在另一方面， 本发明提供了抑制或刺激需要此种抑制或刺激的对象血管生成的方 法， 该方法包括减少或增加所述对象血液中活化的内皮祖细胞 (EPC) 的数目。
在根据本发明的治疗对象的方法中， 减少活化的内皮祖细胞数目的所述步骤包 括减少所述对象血液中内皮祖细胞中基因的表达， 该基因为选自下组中的至少 1 个基因、 甚至更优选至少 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25、 30、 35 个或所有基因， 该组由下列基因组成， 即， ADORA1、 ADORA2A、 ADORA2B、 ADORA3、 AGTRL1(APLNR)、 AMPH、 APLN、 CCBE1、 CDC42、 CGNL1、 CREBBP、 CRIP1、 CRIP2、 CRIP3、 CYB5B、 DLL4、 DUSP5、 EEA1、 egr-1、 ELK1、 ELK3、 ELK4(SAP1)、 EP300、 ERG1(KCNH2)、 ETS1、 ETS2、 EXOC3L、 FGD1、 FGD2、 FGD3、 FGD4、 FGD5、 FLT1、 FST、 GATA6、 GRRP1、 HO-1(HMOX1)、 HO-2(HMOX2)、 IFNG、 IL1A、 IL1B、 LAMA4、 Lamb1-1、 LGMN、 MMP3、 Nos2、 PAI1、 PHD1、 PLVAP、 RAB5a、 RIN3、 ROCK2、 SOX18、 SOX7、 SRF、 STAB1、 STAB2、 STUB1、 TFEC、 THBS1、 THBS2、 THBS3、 THBS4、 THBS5、 THSD1、 TNFAIP8 和 XLKD1(LYVE1)， 该基因还优选为选自下组 中的至少 1 个基因、 又更优选为至少 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25、 30 个或所有基因， 该组由下列 基因组成， 即， ADORA2A、 AGTRL1(APLNR)、 APLN、 CCBE1、 CGNL1、 CRIP2、 CYB5B、 DLL4、 DUSP5、 ELK3、 ERG1(KCNH2)、 ETS1、 ETS2、 EXOC3L、 FGD5、 GRRP1、 HO-1(HMOX1)、 HO-2(HMOX2)、 LAMA4、 Lamb1-1、 LGMN、 PLVAP、 RIN3、 ROCK2、 SOX7、 SOX18、 STAB1、 STAB2、 STUB1、 TFEC、 THSD1、 TNFAIP8 和 XLKD1(LYVE1)。 相反， 增加活化的内皮祖细胞数目的所述步骤， 包括增加所述对象血液中 内皮祖细胞中基因的表达， 该基因为选自下组中至少 1 个基因、 甚至更优选为至少 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25、 30、 35 个或所有基因， 该组由下列基因组成， 即， ADORA1、 ADORA2A、 ADORA2B、 ADORA3、 AGTRL1(APLNR)、 AMPH、 APLN、 CCBE1、 CDC42、 CGNL1、 CREBBP、 CRIP1、 CRIP2、 CRIP3、 CYB5B、 DLL4、 DUSP5、 EEA1、 egr-1、 ELK1、 ELK3、 ELK4(SAP1)、 EP300、 ERG1(KCNH2)、 ETS1、 ETS2、 EXOC3L、 FGD1、 FGD2、 FGD3、 FGD4、 FGD5、 FLT1、 FST、 GATA6、 GRRP1、 HO-1(HMOX1)、 HO-2(HMOX2)、 IFNG、 IL1A、 IL1B、 LAMA4、 Lamb1-1、 LGMN、 MMP3、 Nos2、 PAI1、 PHD1、 PLVAP、 RAB5a、 RIN3、 ROCK2、 SOX18、 SOX7、 SRF、 STAB1、 STAB2、 STUB1、 TFEC、 THBS1、 THBS2、 THBS3、 THBS4、 THBS5、 THSD1、 TNFAIP8 和 XLKD1(LYVE1)， 该基因还优选为选自下组中的至少 1 个基因、 又更优选为至少 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25、 30 个或所有基因， 该组由下列基因组成， 即， ADORA2A、 AGTRL1(APLNR)、 APLN、 CCBE1、 CGNL1、 CRIP2、 CYB5B、 DLL4、 DUSP5、 ELK3、 ERG1(KCNH2)、 ETS1、 ETS2、 EXOC3L、 FGD5、 GRRP1、 HO-1(HMOX1)、 HO-2(HMOX2)、 LAMA4、 Lamb1-1、 LGMN、 PLVAP、 RIN3、 ROCK2、 SOX7、 SOX18、 STAB1、 STAB2、 STUB1、 TFEC、 THSD1、 TNFAIP8 和 XLKD1(LYVE1)。
在优选的实施方式中， 所述方法包括， 减少与对照对象相比在所述对象中过表达 的至少 1 种、 更优选至少 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25 或 30 种蛋白质的量， 或增加与对照对象相 比在所述对象中低表达 ( 减少表达， under-expressed) 的至少 1 种、 更优选至少 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25 或 30 种蛋白质的量。其中所述蛋白质是选自下组中的至少 1 个基因、 甚至更优选至少 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25、 30、 35 个或所有基因的表达产物， 该组由下列基因组成， 即， ADORA1、 ADORA2A、 ADORA2B、 ADORA3、 AGTRL1(APLNR)、 AMPH、 APLN、 CCBE1、 CDC42、 CGNL1、 CREBBP、 CRIP1、 CRIP2、 CRIP3、 CYB5B、 DLL4、 DUSP5、 EEA1、 egr-1、 ELK1、 ELK3、 ELK4(SAP1)、 EP300、 ERG1(KCNH2)、 ETS1、 ETS2、 EXOC3L、 FGD1、 FGD2、 FGD3、 FGD4、 FGD5、 FLT1、 FST、 GATA6、 GRRP1、 HO-1(HMOX1)、 HO-2(HMOX2)、 IFNG、 IL1A、 IL1B、 LAMA4、 Lamb1-1、 LGMN、 MMP3、 Nos2、 PAI1、 PHD1、 PLVAP、 RAB5a、 RIN3、 ROCK2、 SOX18、 SOX7、 SRF、 STAB1、 STAB2、 STUB1、 TFEC、 THBS1、 THBS2、 THBS3、 THBS4、 THBS5、 THSD1、 TNFAIP8 和 XLKD1(LYVE1)， 所述蛋白质还优选为下组中 的至少 1 个基因、 又更优选为至少 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25、 30 个或所有基因的表达产物， 该 组由下列基因组成， 即， ADORA2A、 AGTRL1(APLNR)、 APLN、 CCBE1、 CGNL1、 CRIP2、 CYB5B、 DLL4、 DUSP5、 ELK3、 ERG1(KCNH2)、 ETS1、 ETS2、 EXOC3L、 FGD5、 GRRP1、 HO-1(HMOX1)、 HO-2(HMOX2)、 LAMA4、 Lamb1-1、 LGMN、 PLVAP、 RIN3、 ROCK2、 SOX7、 SOX18、 STAB1、 STAB2、 STUB1、 TFEC、 THSD1、 TNFAIP8 和 XLKD1(LYVE1))。
在另一方面， 本发明提供了用于抑制或刺激对象血管生成的药物组合物， 该组合 物包含至少一种选自以下物质的抑制剂化合物 ：
- 针对本发明生物标记物， 优选针对在细胞膜上表达的生物标记物的抗体或其衍 生物， 且所述衍生物优选选自由 scFv 片段、 Fab 片段、 嵌合抗体、 双功能抗体、 胞内抗体、 和 其他源自抗体的分子组成的组 ； - 如本文定义的生物标记物 ；
- 干扰所述生物标记物生物活性的小分子 ；
- 干扰所述生物标记物的表达的反义分子， 尤其是反义 RNA 或反义寡脱氧核苷酸 ；
- 干扰所述生物标记物表达的 RNAi 分子
- 干扰所述生物标记物表达的核酶 ( 核糖核酸酶 )， 和
- 干扰所述生物标记物或基因中调节基因的功能的化合物，
以及合适的赋形剂、 载体 ( 运载体， carrier) 或稀释剂。
在另一方面， 本发明提供了治疗对象的方法， 该方法包括向所述对象给予可有效 抑制或刺激血管生成的量的本发明的药物组合物。
具体实施方式
术语
术语 “内皮祖细胞 (EPC)” 是指源自循环骨髓的细胞群体， 其似乎参与血管生成和 血管稳态 ( 血管内平衡， vascular homeostasis)。这个祖 ( 干 ) 细胞群体首次被 Asahara 等人在 1997 年 (Science Vol.275， 964-967) 描述为骨髓中的 CD34+CD133+ 细胞， 但是该祖 ( 干 ) 细胞可从血液的外周血单核细胞 (PBMC) 组分中分离出来。 从健康个体血液中较少数 目可以看出， 它们的数目在血管损伤之后倾向于增大。到目前为止， 实验已经确定 EPC 在体 外形成集落 (colony) 的能力， 这暗示它在血管生成和在维持已有血管壁方面的作用。最近 已有证据暗示 EPC 与肿瘤血管生成相关。
术语 “活化的内皮祖细胞 (EPC)” 是指具有不同于正常循环 EPC 的基因表达谱的 EPC。这个基因表达谱可例如借助表 1 中基因的表达上调识别。然而， 因为表 1 中基因表示 可在血液中检测到的生物标记物， 所以这些基因仅包括被上调并因而引起产物的阳性表达的基因。本领域的普通技术人员将会意识到， 在活化的 EPC 中也可观测到下调基因， 但此种 基因不适合用作生物标记物。然而， 此种下调基因可用作表示活化的 EPC 表达谱的部分基 因。不论 EPC 是否是活化的 EPC， 最好通过评估 EPC 表达谱和将该谱与如在此公开的包含 表 1 中基因的提高表达的特异谱进行比较， 或通过确定表 1 中一个或更多基因的表达水平 和确定该水平较对照 EPC( 即， 正常健康对象的血液中的循环 EPC) 是否提高， 来评估 EPC。
与 血 管 发 生 (angiogenesis) 相 比， “血 管 生 成” ( 在此也称为新血管形成 (neovascularisation) 或新血管发生 (neoangiogenesis)) 是指在没有预先存在的血管时 的血管形成， 而血管发生这一术语指来自现有血管的血管发育。血管生成最初被认为只在 胚胎发育期间发生， 但现在已得知该过程也可发生在成年有机体中。血管生成涉及内皮前 体细胞 ( 成血管细胞 ) 的迁移和分化， 以对局部提示 (localcues)( 例如， 生长因子和胞外 基质 ) 和新血管 ( 血管树 ) 的形成作出反应。这些血管树然后被修剪并遍布血管发生。已 知循环内皮祖细胞 ( 干细胞衍生物 ) 促进新血管形成， 但是程度不同。
本文使用的术语 “在血管生成期间” ， 是指基因表达转向血管生成， 而不是转向血 管发生的时期。 新血管形成通过血管生成和血管发生进行。 在胚胎发生期间， 血管生成时期 的特点是 Flk1- 阳性胚胎干细胞的优势达到峰值。 小鼠 Flk1 基因编码对于血管内皮生长因 子 A(VEGF-A) 的主要信号受体， 血管内皮生长因子受体 2(VEGFR-2)， 且对早期胚胎中血管 和造血系统的发育是必要的。 在小鼠中， 小鼠胚胎干 (ES) 细胞分化成 Flk1+ 细胞， 该 Flk1+ 细胞可产生两种类型的细胞， 即， 周细胞 ( 可通过 α- 平滑肌肌动蛋白的表达鉴定 ( 但并不 排他地 ) 的血管平滑肌细胞 ； SMA+) 和内皮细胞 ( 可通过血小板 - 内皮细胞粘附分子的表 达鉴定 ( 但并不排他地 ) ； PECAM1+)。这些周细胞和内皮细胞随后组装成原始血管。因而， 源自胚胎干细胞的 Flk1- 阳性细胞用作血管祖细胞 (vascularprogenitors)。
血管生成与血管发生可按如下方式区分。血管生成是从干细胞 ( 祖细胞 ) 重新合 成血管并涉及这些多向性细胞 (pleitrophic cells) 的募集和分化， 而血管发生是从现有 血管形成新血管 ( 内皮细胞去分化、 迁移 / 增生并再次分化成新管且重塑成重要的血液动 力学血管 (“修剪 (pruning)” )。
术语 “缺血性心血管事件” 或简称 “缺血事件” ， 如本文使用的， 是指向器官或组织 的血液供给中断。 缺血事件通常是血凝块引起的， 且在动脉粥样硬化狭窄患者中， 当栓子离 开动脉粥样硬化病变区时该缺血事件最经常发生。因这个阻塞造成的动脉或其他血管狭 窄、 或窄化或堵塞， 可导致许多有害状况， 其中许多对该对象产生严重后果。在此提及的缺 血性心血管事件包括但不局限于， 中风 / 短暂性缺血发作或脑血管病发作、 心肌梗塞、 心肌 缺血 ( 心绞痛 )、 任何心肌症并发心肌缺血症 ( 例如， 有症状的动脉狭窄、 HOCM)、 脑出血、 外 周 ( 不稳定型 ) 心绞痛、 间歇性跛行 ( 外周动脉粥样硬化疾病 ) 和其他在血管中发生的主 要异常现象。术语 “血管中发生的异常现象” 包括提及的冠脉和脑血管事件， 以及外周血管 疾病。术语 “缺血性心血管事件” 通常是术语 “新血管疾病” 广义上包括的医疗病况的急性 阶段。
术语 “缺血” ， 如本文使用的， 是指向器官、 身体部分或组织的血液供给的绝对或相 对短缺， 或流向器官、 身体部分或组织的血流不足。相对短缺是指血供给 ( 氧输送 ) 和血需 要 ( 经组织消耗的氧 ) 之间的差异。血供给的限制， 一般因血管中的因素引起， 最经常但 不排他地， 由血栓栓塞 ( 血凝 ) 或动脉粥样硬化 ( 阻塞动脉管腔的载脂斑块 (lipid-ladenplaque)) 致使的血管收缩或堵塞引起。 缺血导致组织损伤或功能异常。 心肌缺血导致心绞 痛， 且在此指缺血性心脏病。
术语 “新血管疾病 (CVD)” 一般指一些影响心脏和循环系统的疾病， 包括动脉瘤 ； 心绞痛 ； 心律不齐 ； 动脉粥样硬化 ； 心肌症 ； 脑血管破裂 ( 中风 ) ； 脑血管疾病 ； 先天性心脏 病； 充血性心力衰竭 ； 冠心病 (CHID)， 也称为冠状动脉病 (CAD)、 缺血性心脏病或动脉粥样 硬化性心脏病 ； 扩张性心肌病 ； 舒张功能不全 ； 心内膜炎 ； 心力衰竭 ； 高血压病 ( 高血压 ) ； 肥厚型心肌病 ； 二尖瓣脱垂 ； 心肌梗塞 ( 心脏病发作 ) ； 心肌炎 ； 外周性血管疾病 ； 风湿性心 脏病 ； 瓣膜疾病 ； 和静脉血栓栓塞。如这里使用的， 术语 “新血管疾病” 也包括提及的缺血 ； 因身体损伤 ( 动脉内膜切除术 (endartiectomie)、 气囊血管成形术 ) 造成的或由于慢性损 伤 ( 包括动脉粥样硬化 ) 引起的动脉损伤 ( 对内皮细胞谱系 (endotheliallineage) 的损 伤) ； 心肌损伤 ( 心肌坏死 ) ； 和肌坏死。 一般地， 可引发新血管发生反应的任何生理学或病 理生理学病况均被本文使用的术语 “心血管疾病” 所包括。
术语 “循环流体” 是指淋巴流体和血液， 优选血液。
术语 “多肽” 、 “肽” 和 “蛋白质” 在此可交换地用于指氨基酸残基的聚合物。该术 语可运用于氨基酸聚合物， 其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的类似 物或模拟物 (mimetic)， 该术语也可运用于天然存在的氨基酸聚合物。 多肽可被修饰， 例如， 通过加入碳水化合物残基修饰， 从而形成糖蛋白。术语 “多肽” 、 “肽” 和 “蛋白质” 包括糖蛋 白和包含任何其他修饰的蛋白质， 以及非糖蛋白和另外的未经修饰的蛋白质。 如本文使用的 “蛋白质谱”指样本中存在的蛋白质、 蛋白质片段， 或肽的集合 (collection)。 该蛋白质谱可包含集合中蛋白质的确认 ( 特性， identity)( 例如， 已知蛋白 质的种名或氨基酸序列特性， 或分子量或关于还没有进一步表征的蛋白质的其他描述性信 息 )， 而没有提及存在的数量。在其他实施方式中， 蛋白质谱包括样本中所描述的蛋白质的 数量信息。类似地， 如本文使用的 “基因表达谱” ， 指样本中存在的基因表达产物的集合 ( 包 括如蛋白质和 RNA 分子的产物 )。
如在此处使用的， 关于基因表达谱中基因表达产物的 “定量” ， 指样本中存在的特 定蛋白、 肽或 RNA 量的确定。定量可以是绝对量 ( 例如， μg/mL) 或相对量 ( 例如， 信号的 相对强度 )。通常， 此种操作通过专用的生物化学分析， 例如色谱、 质谱或杂交分析而进行。 如本文使用的， 关于循环流体中细胞的 “定量” 是指细胞绝对或相对数目的确定。此种操作 通常通过专用的细胞计数器进行， 例如流式细胞仪。
“标记物” 和 “生物标记物” 可交换地用于指基因表达产物， 将从两个不同对象如测 试对象或患有缺血事件 ( 或存在患此病风险 ) 的患者中采取的样本与从对照对象 ( 例如， 没有患缺血事件或 ( 患此病风险 ) 的对象 ； 正常或健康的对象 ) 采取的相当样本相比较， 该 表达产物在样本中差异性地存在。 可替换地， 该术语指相对于另一细胞群体， 在一个细胞群 体中差异性存在的基因表达产物。
短语 “差异性存在” 是指从测试对象采取的样本与从对照对象采取的样本相比较， 二者样本中标记物存在的数量或频率 ( 发生率 ) 是有差异的。例如， 标记物可以是， 与参照 对象样本相比， 在风险对象血液样本中存在的水平升高或降低的基因表达产物。 可替换地， 标记物可以是， 与对照对象样本相比， 在风险对象血液样本中检测到的频率更高或更低的 基因表达产物。
如果一个样本中的基因表达产物数量与另一个样本中的基因表达产物数量在统 计学上显著不同， 则该基因表达产物在两个样本之间 “差异性存在” 。 例如， 如果它存在于一 个样本中比在另一个样本中大至多约 120％、 至少约 130％、 至少约 150％、 至少约 180％、 至 少约 200％、 至少约 300％、 至少约 500％、 至少约 700％、 至少约 900％、 或至少约 1000％， 或 如果它在一个样本中可检测到而在另一个样本中不可检测到， 则该基因表达产物在两个样 本之间差异性存在。
如本文使用的， 术语 “抗体”是指单克隆抗体、 多特异性抗体、 合成抗体、 人抗 体、 人源化抗体、 嵌合抗体、 单链 Fvs(scFv)、 单链抗体、 Fab 片段、 F(ab’ ) 片段、 二硫键连 (disulfide-linked) 的 Fvs(sdFv) 和抗独特型 ( 抗 -Id) 抗体 ( 包括， 例如， 本发明抗体的 抗 -Id 抗体 )， 和上面任何一个抗体的表位结合片段。特别地， 本发明抗体包括免疫球蛋 白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分， 即， 含有抗原结合位点的分子， 该抗原结合位点 免疫特异性地结合到多肽抗原， 该多肽抗原被包括在基因组区中的基因编码或受表 1 中列 出的基因组区中的遗传转化影响。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型 ( 例如， IgG、 IgE、 IgM、 IgD、 IgA 和 IgY)、 任何类别 ( 例如， IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA1 和 IgA2) 或亚类 (subclass) 的免疫球蛋白分子。
“免疫分析” 是指使用抗体特异性结合抗原 ( 例如， 标记物 ) 的分析。免疫分析的 特点是使用特定抗体的特异性结合特性来分离、 靶向， 和 / 或量化抗原。多种免疫分析法 (immunoassay formats) 可用于选择与特定蛋白特异性免疫反应的抗体。例如， 固相 ELISA 免疫分析通常用于选择与特定蛋白特异性免疫反应的抗体 ( 参见， 例如， Harlow&Lane， Antibodies， A Laboratory Manual(1988)， 用于描述可用于确定特异性免疫反应性的免疫 分析法和条件 )。典型地， 特异性或选择性反应是本底信号 ( 背景信号 ) 或噪声的至少两 倍， 更典型地大于本底的 10 倍至 100 倍。
当提及抗体时， 短语 “特异性 ( 或选择性 ) 结合” ， 或当提及蛋白质或肽时， 短语 “与 ...... 特异性 ( 选择性 ) 免疫反应” ， 是指对蛋白质和其他生物物质 (biologics) 的异 源性群体中蛋白质的存在起决定性作用的结合反应。 因而， 在指派的免疫分析条件下， 制定 的抗体结合到特定蛋白至少是本底的两倍， 且没有大量的抗体显著结合到样本中存在的其 他蛋白质上。在此种条件下特异性结合到抗体上， 需要选择对特定蛋白有特异性的抗体。
术语关于蛋白质或基因而 “影响表达” 和 “调整表达” ， 如这里使用的， 应当理解为 调节、 控制、 阻断、 抑制、 刺激、 增强、 活化、 模仿、 避让 (bypass)、 纠正 (correct)、 移出、 和/ 或取代所述表达， 在更一般的术语中为介入 ( 或干预 ) 所述表达， 例如通过影响编码该蛋白 质的基因的表达而介入。
术语 “对象” 或 “患者” 在此可交换地使用， 包括但不局限于， 有机体 ； 哺乳动物和非 哺乳动物， 其中哺乳动物包括， 例如， 人、 非人灵长类动物、 小鼠、 猪、 牛、 山羊、 猫、 兔、 大鼠、 豚鼠、 仓鼠、 马、 猴、 绵羊或其他非人哺乳动物 ； 非哺乳类脊椎动物和非哺乳类无脊椎动物， 非哺乳类脊椎动物例如为禽 ( 例如， 鸡或鸭 )、 两栖动物和鱼。
优选实施方式的描述
生物标记物
1999 年， Asahara 最先描述了患者外周血中的内皮祖细胞 (EPC) 构成对缺血和动 脉损伤作出反应的募集的内皮前体细胞池。从那时起， 已显示这些细胞涉及在生理学和病理生理条件下的新血管发生 ( 新血管发育 )。而且， EPC 涉及， 在身体损伤 ( 动脉内膜切除 术 (endartiectomie)、 气囊血管成形术 )、 和慢性损伤 ( 包括动脉粥样硬化 ) 及缺血 / 肌坏 死 ( 引发新血管发生反应 ) 导致的内皮细胞谱系损伤之后的进行性动脉修复和 / 或再生。
在下面的描述中， 具体提到了血管生成在其中发挥作用的各种疾病， 且血管生成 的检测 ( 或延伸修饰 (modification of the extend)) 因而可用于检测 ( 或甚至治疗 ) 此 种疾病。然而， 本申请的目的在于检测对象中血管生成出现和 / 或进展的潜在可能性， 和使 用新获得的知识抑制或刺激需要此种抑制或刺激的对象血管生成的方法， 而不拘泥于特定 疾病， 尽管特定疾病， 尤其是炎症、 肿瘤血管发生、 新血管疾病和糖尿病的检测、 预防和治疗 没有明确地从本发明的范围中排除。然而， 本发明的另外特征在于其可用于探查对象促血 管发生 (pro-angiogenetic) 治疗是否实现它的预期反应。
对于本发明的生物标记物， 迄今还没有提供血管生成的诊断或预后的生物标记 物。用于心肌损伤的标记物 ( 心肌坏死标记物 ) 通常用在心脏学实践中， 但主要包括细胞 内心肌酶的鉴定， 该细胞内心肌酶是在包括肌钙蛋白和肌酸激酶 MB 亚组分的心肌组织损 伤之后的循环中被释放。然而， 至今还没有可以量化进行性缺血事件或缺血前事件的标记 物。稳定型心绞痛构成大多数心血管实践且在西方社会包含可观的患者人数 ( 发病和死亡 率大 )。可替换的诊断方法， 包括运动测试和灌注成像， 没有成本效益并缺乏适当的灵敏度 和特异性。 这种严重的健康威胁准许合适的生物标记物来鉴定处于风险中的患者并评价对 抗缺血治疗的合适反应。
为了寻找此种标记物， 本发明人已进行小鼠和斑马鱼的胚胎血管发育的全基因组 分析 ( 使用 RNA 微阵列分析 )， 并鉴定了以某种方式涉及动脉发育的 2000 个以上的基因。 这种大量基因最初是在使用 Flk1+ 胚胎干细胞与 Flk1-( 阴性 ) 群体 ( 不相关细胞 ) 之间 的差异表达， 确定 8-11 天大的小鼠胚胎中 Flk1+ 胚胎干细胞的 RNA 表达谱之后而发现的。 通过使用整体原位杂交 (WISH)， 1150 个基因被选作提供潜在的生物标记物。本发明人进一 步选择和验证这些候选基因在小鼠和斑马鱼的发育血管树中的表达， 和在缺血期间它们在 青春期小鼠模型中的上调。
基于直系同源物搜索， 本发明人在 2000+ 个细胞中， 鉴定出涉及人、 鼠和斑马鱼 血管生成的 26 个克隆。Flk1+ 细胞选择早期造血干细胞、 专用成血管细胞 (dedicated angioblasts) 以及完全分化的内皮细胞， 从而包括从血管母细胞 (hemangioblasts) 到内 皮细胞 (EC) 的完全分化过程。 已知 Flk1 和 Tal1 是早期发育期间专用成血管细胞上的两个 最早期标记物， 而 Flk1 表达在胚外造血干细胞中迅速下调， 因为它们定向于 ( 分化， commit to) 造血谱系。在斑马鱼中使用原位杂交研究， 本发明人最初能够示出通过比较 Flk1+ 和 Flk1- 细胞的差异显示分析所鉴定的 23 ％的基因在血管生成位点被排他地表达， 而另外 30％示出在血管生成位点和神经元及视网膜上皮样组织 (retinal epitheloid tissue) 表 达。这强调了本发明人的原始实验原理的有效性， 从而通过这个特定基因筛选鉴定血管生 成的基因调节子 (genetic regulator)。本发明人鉴定了在血管树中小鼠发育期间差异表 达的 2000+ 鼠基因， 并在斑马鱼发育期间进行血管生成的高通量整体原位杂交， 以及使用 从缺血鼠模型和人疾病中收集的各种组织， 进行定量 PCR 分析， 从而验证斑马鱼发育期间 发育血管床中的适当的时空表达。使用这种涉及小鼠、 斑马鱼和人血管生成的不同表现形 式的筛选， 本发明人能够鉴定贯穿物种和不同模型保存的普通的调节基因产物， 并能够鉴定胚胎和成年小鼠中血管生成的普通基因调节子。
血管生成在成年新血管形成中的作用已充分确立， 其是许多科学论文的主题。然 而， 该过程的基因调节至今仍不清楚。本发明人已研究并比较作为模型的小鼠和斑马鱼发 育期间的血管形成， 从而在没有造血和血管发生的情况下在体内分析血管生成过程。随后 本发明人使鉴定出的克隆表达与肢体缺血和人疾病的 ( 成年 ) 小鼠模型中的表达交叉相 关。通过这样做， 本发明人能够鉴定在胚胎和成年血管生成期间表达的克隆。在后肢缺血 的 ( 成年 ) 小鼠模型中并通过利用发育斑马鱼中的 ( 吗啉环 ) 敲低 (knock down) 分析， 对 这些克隆进行了进一步的体内研究。使用这些技术， 本发明人能够鉴定 26 个涉及成年和胚 胎血管生成的候选调节基因。
尽管成年和胚胎血管生成是否由共同路径 (common pathways) 调节仍然不清楚， 但本发明人能够鉴定共有的表达模式， 可能鉴定共有的基因调节子。
最后， 单个克隆的诱导表达通过在血液样本的循环 PML 亚群 ( 子集， subset) 中进 行的 QPCR 分析来验证， 该血样样本从稳定型缺血性冠状动脉疾病患者和急性冠脉综合征 患者获得。
基于通过这些研究得到的结果， 本发明人对血管生成和哺乳动物中成血管细胞分 化的分子机制有了必要的理解， 并鉴定了基因库或基因表达谱， 该基因库或基因表达谱的 特点是涉及 EPC 募集、 活化和到新血管形成区域中的迁移， 并可用作特异性 EPC 表型的活化 EPC 存在的指示物 (indicator)， 并因而可用作进行性血管生成和动脉修复的指示物， 该动 脉修复为例如在广泛环境 (broad setting) 中缺血和动脉受损之后的动脉修复， 特别是在 与动脉损伤、 心肌损伤或缺血相关的那些新血管疾病之后的动脉修复。 共发现 26 个基因组成活化的 EPC 表型， 并证明它们作为用于这些障碍的生物标记 物的价值。 技术人员应很快理解， 这些基因不但适合作为上面提及的病理的生物标记物， 而 且适合作为用于血管生成， 优选成年对象血管生成的生理过程的标记物， 且这些基因可用 作治疗靶， 用以治疗这些病理， 或用于刺激血管生成的生理过程。这些基因列在表 1 中。
表 1. 缺血性心脏病期间被上调的 33 个基因的列表。应当理解其它物种的同源物 包括在其中。
Maglott 等 人， Entrez Gene ： gene-centered information at NCBI.Nucleic Acids Research， 2006， Vol.00， Database issue D1-D6.
除了上面其表达在缺血期间被上调的基因之外， 技术人员将容易地理解， 与这 26 个基因或其表达产物相互作用的基因或其表达产物， 也表示为本发明的多个方面中的候 选生物标记物。此种相互作用可包括蛋白质 - 蛋白质相互作用、 蛋白质 -DNA 相互作用、 RNA-DNA 相互作用、 受体配体相互作用， 或在正常生理条件下受到的任何类型的相互作用。 可替换或除此之外地， 技术人员将容易理解， 对于这 26 个基因之一所属的基因家族， 作为 同一基因家族的成员的基因或其表达产物也包括在此作为本发明多个方面中的候选生物 标记物。此中原理为 ： 表达模式主要涉及使基因和 / 或同一基因家族的基因相互作用的级
16a101946008 A CN 101946016说明书12/36 页联。因此， 除了 CR1P2 之外的 CRIP 看家基因， 例如， 也属于本发明的方面。这些相互作用或 相关的基因在表 2 中给出。
表 2. 与在缺血性心脏病期间表达被上调的基因相互作用、 或为该类基因的家族 成员的基因。
细胞中这些基因的表达产物 (RNA 或蛋白质 ) 的量提供了对这些基因表达水平的 洞察。技术人员将清楚地了解， 研究细胞和组织中基因的表达水平的各种可用技术。
生物标记物可涉及表 1 所列基因之一的表达产物， 或可涉及表 1 所列的 2、 3、 4或 更多个基因的表达产物。当表 1 所列多基因的表达水平被确定时， 则可获得表达谱， 该表达 谱可提供与缺血性心脏病和进行性血管生成在统计学上非常可靠的相关性。
这种促血管生成谱 (pro-vasculogenic profile) 对在诊断、 预后 ( 例如， 用于作 为替代终点标记物 ) 和治疗水平的心血管医疗实践非常重要， 该谱提供了表示对缺血和动 脉损伤的血管修复反应的活化的血管生成标识。
促血管生成基因表达谱是由一组单个生物标记物组成， 该谱自身可用作生物标记 物。
生物标记物可用于鉴定对缺血事件的治疗 ( 处理， treatment) 缺少适当 / 充分反 应的患者。这非常有助于将患者分为高风险或低风险谱， 其中， 低风险谱的患者未来易于 发生另外的缺血事件或疏忽事件 (inadvertent event)， 或可产生对冠脉介入 ( 或干预 ) (PCI) 不适当的血管反应， 导致再狭窄或支架内血栓形成 (in-stentthrombosis) ； 或要么 有助于预测对经皮介入的次优反应 ( 例如因不适当 / 不充分的血管 / 内皮修复反应 ( ＝血 管生成 ) 造成的再狭窄形成的高风险 ))。这对通过加强的医疗监测、 更具侵蚀性的血管再 生策略或单个特制 (tailored) 的药物治疗 ( 包括但不局限于， 持续的双重抗血小板治疗， 从而阻止支架内血栓形成 )， 进一步确定医疗介入有帮助。
本发明的生物标记物可用作替代终点标记物。 替代终点标记物是旨在取代临床终 点的生物标记物或旨在用于描绘治疗功效 ( 例如抗缺血治疗 ) 的生物标记物。在许多环境 中， 主要临床终点需要大量的长期试验， 这些试验显然是昂贵的。包括死亡、 心肌梗塞或中 风的医疗试验中的真实或硬性终点 (real or hard endpoint) 的评价， 将需要研究大量研 究人群， 这在财政上和从道德 / 伦理观点来看， 均是不理想的。不是在医疗试验中评价硬终 点， 替代终点用作改进结果 ( 和心血管患者幸存 ) 包括例如整左心室功能的可替换的指示 物或预测物、 或可用作心力衰竭预测物的 BNP 分析。因而， 替代终点的使用也可潜在地阻止 其他不期望的终点， 例如死亡。替代终点标记物对测试药物功效高度重要。缺血性心脏病 缺乏评价和预测对单个患者的治疗和因此预后的适当反应的， 作为替代终点标记物的适当 生物标记物。 本发明促血管生成生物标记物可用作用于医疗治疗替代终点标记物的生物标 记物。
可以评价作为预后预测物的这些标记物， 而且也可以评价它们对抗缺血治疗或旨 在刺激血管生成反应的治疗的反应。 因此这些新鉴定的血管生成生物标记物的表达可有助 于评价促血管生成药物治疗的效果， 例如涉及用粒细胞集落刺激因子 (GCSF)、 抑制素、 促红 细胞生成素、 雌激素或运动治疗的治疗。
生物标记物可用作确定患者预后的方法， 因为它们可预测对缺血事件的适当反应 和缺血区域中代偿性血管发育的起始。可替换地， 促血管生成标记物的分析可评价对单个 患者中的起始医疗介入 ( 通过其他介入的药物治疗 ) 的适当反应。因此对治疗的反应可在 治疗和单个调整之后的早期阶段评价， 而不是以关于临床表现 (clinical grounds) 的经验 途径 ( 等等和观望 (wait and see) 途径 ) 评价。这可以导致心血管患者更单独特制的药 物治疗， 该治疗允许适应于医疗策略。
本发明生物标记物可通过任何可用的方法测量。 非常合适的方法是使用能够与本 发明生物标记物的基因表达产物 (RNAs) 在严格条件下特异性杂交的专用 ( 用户化 ) 芯片 阵列 (customizedchiparrays)(DNA 微阵列 )。该测量可提供生物标记物谱。这些芯片阵列 可用于测试患有新血管疾病的患者群体中生物标记物谱的存在， 该生物标记物谱表示如在 此描述的发生在哺乳动物 ( 人和鼠 ) 和两栖动物的胚胎发生和缺血期间的血管生成反应。
本发明生物标记物或生物标记物谱表示用于心血管患者的诊断、 评价和分级 (staging) 的有价值的工具。 目前这类工具并不可获。 其次， 这些血管生成生物标记物构成 对这些患者的新型治疗介入， 或可用于评价患者对启动治疗的反应， 从而作出更有效的医 疗决策。
本发明生物标记物对心血管实践的每日临床实践和普通医师的实践有着深远影 响， 因为替代终点生物标记物的解释 (interpretation) 更加明确。这将最终减少可观的费 用和改进 ( 和优化 ) 对于心血管患者的医疗护理。
预后和诊断方法
在预测对象发生缺血事件风险的本发明方法中， 可在对象中检测该生物标记物， 该检测可通过体内或非侵入性方法或通过回体 (exvivo) 方法进行， 其中回体方法涉及从 患者体内移出样本。 “检测” 指鉴定待检测物体的存在、 不存在或量。检测可包括以绝对方 式 ( 例如， μg/ml) 或相对方式 ( 例如， 信号的相对强度 ) 确定该存在， 或确定对象 ( 的样 本 ) 中不存在生物标记物。非常合适地， 可确定生物标记物相对于对象中稳定存在的另一 种蛋白质， 例如， 看家酶 (household enzyme) 的量， 以便检测对象中的生物标记物。
用于检测本发明生物标记物的非常合适的样本是血液样本。特别地， 本发明生物 标记物可在血液样本中或全血 ( 包括血清 ) 中的多形核白细胞、 内皮祖细胞中检测。
用于检测或测量对象体内蛋白质 ( 体内 ) 的非侵入性方法是技术人员所熟知的。 此种方法可包括 MRI、 超声波光谱、 拉曼光谱和 / 或红外线光谱， 并通常涉及检测蛋白质的 特异性标签的使用。
当针对相同目的分析血液样本时， 可采用类似方法。然而， 另外， 回体方法可应用 在通过侵入性方法获得的样本上， 并包括利用质谱和 / 或免疫分析试验检测和 / 或量化血 液样本中的蛋白质或 RNA。 另外， 有大量微阵列技术可用于在单个试验中同时检测或测量大 量生物标记物。此种微阵列试验包括 DNA 阵列如 cDNA 微阵列和寡核苷酸微阵列 ； 蛋白质微 阵列 ； 和抗体微阵列。可通过从对象的血管移出血液的样本提供血液样本。 可通过本领域中所熟知的方 法， 从血管获得血液。非常合适地， 通过使用例如真空采血管 (vacutainer) 或通过手指针 刺 (fingerstick) 采样， 提供血液样本。血管可以是静脉或动脉。在移出血液样本之后， 在 避免 RNA 或蛋白质分解的条件下保存该样本， 用于随后的蛋白质测量。如果需要， 血液的具 体组分， 例如血浆或血清， 和细胞组分可被分离并单独分析。细胞组分可进一步划分， 从而 提供多形核白细胞。该表达产物可在血液的任何合适的组分中检测。
在用于心血管事件， 特别是缺血性心血管事件预后诊断的本发明方法中， 可使用 本发明的生物标记。
基于如上所述的特异性基因表达谱和血液中基因产物与心血管事件预后非常紧 密地相关的实证， 本发明现在提供对象新血管疾病的诊断和预后的方法， 该方法包括在所 述患者的血液中检测相应的生物标记物。所述血液 ( 的样本 ) 中所述生物标记物的存在表 示测试对象处于缺血事件的风险中。
本发明方法优选在来自 ( 怀疑 ) 处于缺血事件风险中的对象的血液样本上进行， 然而也可运用体内方法。使用无患缺血性事件风险的对照对象样本作为参考。这些样本的 比较可揭示测试样本中异常的 (deviant) 生物标记物水平。在本发明可用之前， 对象是否 处于患缺血事件的风险中的问题通常要在长时间之后才会揭示。 通过使用本发明的预后诊 断方法， 结果通常可在血样收集之后的一天内获得。但即使该血液揭示存在此处提及的表 示缺血 ( 的风险 )( 例如， 如从数据库记录的预测 ) 的生物标记物， 但是， 需要许多年所述风 险才会以例如心血管事件形式体现。
本发明方法可包括根据与身患缺血相关的风险将血液样本分型 (typing)。本发 明方法中的血液样本分型进一步包含测量阳性对照样本 ( 来自风险患者 ) 和阴性对照样本 ( 来自非风险患者或历史对照或参考 ) 中至少一种本发明生物标记物的量的步骤， 或者为 两个样本都提供生物标记物谱的步骤。术语 “至少一种生物标记物的量” ， 如在本说明书中 使用的， 指的是相对量或绝对量 ( 例如， 浓度 )。阳性对照样本也称为参考样本且其中生物 标记物的量也称为参考值 ( 即， 超过或低于此值， 有风险存在的阳性鉴定 )。阴性对照样本 也在此称为对照样本。
应当理解， 测量至少一种生物标记物的量的步骤不必导致表示所述样本中生物标 记物的蛋白质 RNA 浓度的精确确定。相对于对照样本中存在 ( 或不存在 ) 的量， 获得该量 的表达已足够。任何 ( 半 ) 定量方法均是合适的， 只要所测量的量可与对照或参考值相比。
为了鉴定候选生物标记物， 分型包括确定与第二血液样本相比所述至少一种生物 标记物是否差异性存在于第一血液样本中的步骤， 或确定第一和第二血液样本之间差异表 达谱的步骤。这个步骤可方便地通过使用基因表达阵列进行， 或通过借助 2- 维聚丙烯酰胺 凝胶电泳 (2-D PAGE) 和 western 印迹或质谱分析存在于该两个血液样本中的 RNA 或蛋白质 进行。此种方法一般涉及蛋白质部分降解成肽和测序以及随后通过串联 -MS 鉴定这些肽。 此种方法在本领域已良好地确立。
当确定了差异表达谱， 并且确定了与风险和非风险状况相似的样本中存在的生物 标记物的量时， 该量一定与该状况相关。 它的统计分析涉及常规操作， 只要研究的医疗状况 的临床数据被适当标注到分析的样本中。
最终， 当医疗状况的发生确实与生物标记物的存在 ( 或缺乏 ) 之间存在关系时， 差异存在的蛋白质或 RNA 或差异蛋白质或 RNA 表达谱被鉴定为生物标记物。
本发明也提供了进行上述方法的试剂盒。 此种试剂盒是基于通过上述体内或体外 方法的生物标记物的检测。 本发明试剂盒包含生物标记物， 或其可检测的结合伴侣， 例如特 异性结合到生物标记物的抗体。
试剂盒可进一步包含验证检测方案的组分， 例如参考或对照样本 ( 活化的 EPC 和 正常循环 EPC)、 关于用于生物标记物的参考值 ( 正常健康值 ) 的信息、 能够结合到抗体并 可例如用在竞争性 ELISA 试验中的肽 ； 可检测的标记物， 其通常含有标签部分 (labelling moiety)， 用于检测所述生物标记物与所述抗体之间的结合。
标签部分可包括荧光、 化学发光、 磁性、 放射性或适合用于通过专用设备检测的其 他部分。
测量的浓度然后可以与数据库中可获得的参考值相比。 此种数据库可具有表达产 物列表的形式， 其中， 参考值或阈值标注到每个表达产物， 超过或低于该值， 患者中缺血事 件发生的风险性提高。为了确定每个表达产物的阈值， 可在风险患者 ( 已患冠脉、 脑血管或 外周缺血事件 ) 和非风险患者 ( 未患缺血事件 ) 样本之间进行综合性研究， 例如， 本文所描 述的， 且其中， 该阈值是在非风险患者当中的最高或最低值， 超过该值， 低于该值， 缺血事件 发生的统计概率 (static chance) 分别显著提高。
可替换地， 该数据库可采取一个或更多参考样本的集合形式， 该参考样本含有所 述至少一种量等于该生物标记物的参考值的生物标记物。在此种情况下， 测量样本中至少 一种生物标记物的量的步骤和比较测量的量和参考值的步骤， 可在单个试验中进行， 其中 在试验和对照样本中的所述生物标记物的量相对于彼此被确定， 例如通过使用任何可得的 差异表达分析技术。适合于分析样本之间蛋白质差异表达的任何方法可在此种情况下使 用。当需要大量蛋白质或 RNA 的差异表达时， 可适当地使用抗体或 DNA 微阵列。
对本领域人员而言， 例如载玻片上的抗体微阵列或 RNA 微芯片阵列的制备是已知 的。抗体、 探针 DNA 可分别在， 例如氨基反应的、 硅烷化载玻片或其他官能化表面上形成样 点 (spot)。一般地， 对于技术人员来说， 可获得在单个 2.5x7.5cm 载玻片上印有 (print) 多达 20000 个样点的方法， 单个样点相隔 300μm。为了允许在单个载玻片上进行多重结合 实验， 分别由定义的抗体组、 DNA 探针组成的一些栅格 (grid)， 可在一个载片上形成样点。 该抗体、 DNA 探针分别可通过任何可用的样点技术 (spotting technique) 点样， 例如通过 接触印刷。对于技术人员来说， 开发用于生产 DNA 微阵列的工具和技术是容易获得的， 例 如， 测位仪 (spotter)、 培养箱、 差异荧光标记技术和用于定量测量结合研究的成像设备。 基于蛋白质或肽序列的抗体阵列的制备程序， 是商业上可得到的， 例如， 来自 Eurogentec， Seraing， 比利时。
如上所述， 微阵列可用于差异基因表达研究 ( 蛋白质或 RNA 谱分析 )。为了在实 验条件下测量生物样本中表达产物的差异表达和比较该表达与对照样本或参考值， 数种方 法可用于标记该表达产物。非常合适地， 使用标准蛋白或 RNA 标记方案， 采用一个或更多荧 光探针 ( 例如， Cy3 和 Cy5) 标记来自生物样本的表达产物。生物样本 ( 测试和对照 ) 的表 达产物已被标记 ( 优选使用用于测试和对照的不同颜色的探针差异地标记 ) 后， 可使它们 与微阵列接触。表达产物到阵列上抗体、 cDNA 或寡核苷酸探针的结合可， 例如， 在带有小体 积 (±50μl) 的标记的生物材料的微阵列载片温育之后， 在盖片下进行。结合到微阵列的表达产物的检测可基于荧光的发生。 结合到微阵列的表达产物然后可使用荧光扫描机进行 检测， 且微阵列的单个样点然后可被分析， 从而确定测试和对照样本之间的差异表达。
在可替换的程序中， 该微阵列可用作捕获芯片 (capturing chip)， 用以在该芯片 上使用 ELISA 方法， 量化生物样本中多重表达产物。被鉴定为用于评估如在此描述的缺血 事件风险的生物标记物的各种蛋白质可通过该程序更加定量地测量。 为了测量生物样本中 蛋白质浓度， ELISA 技术非常合适。此种技术涉及荧光强度对蛋白质浓度的校准曲线的产 生， 或竞争性 ELISA 法的使用， 其中在测试中提供了未标记蛋白质或抗原的已知量。当使 用诸如用于制备如上述抗体微阵列的肽免疫方法时， 用于免疫的肽可用在微阵列上竞争性 ELISA 实验中。可替换地， 可开展多重夹心 ELISA， 用作第二抗体， 例如， 肽免疫引起的抗靶 蛋白的第二表位 ( 第二合成肽 ) 抗体。
在又一个方面， 本发明提供了如上定义生物标记物在预测对象中缺血性事件风险 方面的用途。此种用途涉及检测患者 ( 的样本 ) 中生物标记物和确定检测到的量是否超过 或低于参考值。
治疗方法
生物标记物有助于作出医疗决策， 因为它们可诊断患者、 鉴定某些风险群体和评 价对启动的治疗的 ( 缺乏 ) 适当反应。 在此鉴定的基因构成涉及调节新血管形成和血管修复的潜在的调节基因， 并因此 也一般地构成治疗新血管疾病， 和特别地构成治疗缺血 ( 外周和心肌 ) 和动脉粥样硬化 ( 动脉粥样化形成的进展和易损斑块的稳定 )， 以及阻止病态血管形成 ( 糖尿病新血管发 生、 肿瘤血管发生、 动脉粥样化斑块不稳定 ) 的新方法。特别地， 提出了这些基因在动脉粥 样硬化、 不稳定型斑块形成、 后肢缺血、 心肌缺血和梗塞的数个动物模型的开展 ( 和治疗 ) 以及在肿瘤血管发生中的潜在价值。
可通过在基因水平的介入 (RNA 干扰、 DNA 转录 / 翻译， 包括但不限于 siRNA、 重组 病毒载体、 转染的细胞系或其组合 )， 或者可通过利用蛋白质治疗治疗患者。在此也提出了 使用活化的 EPC 作为活性治疗物质。
可替换地， 该治疗可包括干扰基因或基因产物的工作机制 / 效果， 例如通过使用 与在此鉴定的基因产物相互作用的受体的生物或化学阻断剂 (blocker)， 或干扰本发明生 物标记物与它的受体或配体结合引起的信号级联 (signalling cascade)。
在又一方面， 本发明提供了治疗身患 ( 患病风险增加 ) 新血管疾病， 特别是缺血、 动脉粥样硬化和病态血管形成的对象的方法， 所述方法包括使用上文定义的生物标记物作 为治疗靶或作为治疗剂。 优选地， 所述生物标记物作为治疗剂的所述用途包括， 降低在身患 新血管疾病， 特别是缺血、 动脉粥样硬化和病态血管形成 ( 患病风险增加 ) 的对象上过表达 特别是缺血、 动脉粥样硬化和病态血 的至少一种表达产物的量， 或增大在身患新血管疾病， 管形成 ( 患病风险增加 ) 的对象上低表达的至少一种表达产物的量。更优选地， 刺激或增 强所述表达产物的表达， 或在受体水平上或进一步地在信号级联的下游干扰所述表达产物 的功能。
优选地， 所述生物标记物作为治疗剂的所述用途包括， 增大在身患新血管疾病， 特 别是缺血、 动脉粥样硬化和病态血管形成 ( 患病风险增加 ) 的对象上低表达的至少一种表 达产物的量， 并涉及例如向所述对象给予所述蛋白质。
可替换地， 所述生物标记物作为治疗剂的用途包括， 阻断信号级联放大的受 体 - 配体相互作用， 其中所述生物标记物是配体、 受体或信号级联的成员。
在此定义的生物标记物可以是细胞或分泌的蛋白或核酸。可替换地， 在此定义的 生物标记物可采取组合的生物标记物谱形式。 最终的生物标记物是在此定义的活化的 EPC， 该活化的 EPC 具有与表 1 中 26 个基因相关的特异性基因表达谱。因而， 该活化的 EPC 也可 称为生物标记物， 并也可用作治疗剂， 用以治疗新血管疾病。
本发明也涉及本发明生物标记物作为治疗靶的用途。 遗传药理学和药物基因组学 旨在确定与疾病相关的遗传定子。大部分疾病是多基因疾病， 且此处涉及的基因的鉴定应 当允许发现新靶和开发新药。
这种新型药物途径靶向许多生理疾病。 患新血管疾病， 特别是缺血、 动脉粥样硬化 和病态血管形成的风险可被视为多基因疾病。 本发明生物标记物已被鉴定为用于易患疾病 体质的基因标记物。 对于最终导致致命的缺血事件的新血管疾病， 特别是缺血、 动脉粥样硬 化和病态血管形成的发展所涉及的基因的鉴定知识因此非常有利于对此疾病的预防、 治疗 和诊断方法的开发。引起特定对象中风险表型的基因的诊断， 允许包括使用特定药物， 例 如， 针对这些基因编码的蛋白质的药物的治疗设计。
本发明的一方面使用了本发明生物标记物和 / 或编码这些生物标记物的基因， 用 于开发针对基因和 / 或其表达产物 (RNA 或蛋白质 ) 的抑制剂， 特别是在处于风险中的对象 中生物标记物过表达的情况下， 或开发针对信号级联的配体或受体的抑制剂， 其中生标记 物是信号级联的成员。
在患者中本发明生物标记物可表达， 从而对失败的灌注 (failingperfusion) ( 即， 缺血 ) 进行补偿。 可替换地， 本发明生物标记物在其他情况下可反映缺血的副现象， 且 它们的成功下调与成功治疗一致。总的来说， 该治疗应用将涉及基因产物的调整。
在该方面的一个实施方式中， 该抑制剂是针对编码该生物标记物的基因的表达产 物的抗体和 / 或抗体衍生物。治疗性抗体， 例如， 可用于对抗位于细胞膜上的基因表达产物 并可包含在药物组合物中。而且， 抗体可靶向细胞内的， 例如， 细胞质的基因产物， 例如 RNA 的、 多肽或酶， 以便调整这些产物的活性。 优选地， 此种抗体为胞内抗体的形式， 其产生于靶 细胞内部， 优选空斑形成细胞 (plaque-forming cell)， 包括 T- 细胞、 内皮细胞和平滑肌细 胞， 或发现于粥样硬化病变中的细胞， 例如白细胞、 巨噬细胞、 泡沫细胞、 树突细胞， 和肥大 细胞及 T 细胞。另外， 抗体可用于递送至少一种连接到该处的毒性化合物到靶细胞。
在本发明优选实施方式中， 该抑制剂是小分子， 该小分子能够调整活性或干扰编 码如此处定义的生物标记物的基因的蛋白质表达产物的功能。另外， 小分子也可用于递送 至少一种连接的毒性化合物到靶细胞。
关于不同水平的抑制， 通过破坏从编码生物标记物的各个基因转录的 mRNA， 核酸 可用于阻断蛋白质的生产。这可通过反义药物、 核酶或通过 RNA 干扰 (RNAi) 来实现。通过 在疾病过程的早期阶段发挥作用， 这些药物阻止引起疾病的蛋白质的生产。本发明涉及针 对编码生物标记物的基因的反义药物， 例如反义 RNA 和反义寡脱氧核苷酸、 核酶和 RNAi 分 子。
在风险表型中基因表达水平可以被降低或提高。自然地， 当表达水平上升时可使 用抑制剂。 然而， 本发明也提供了 “增强子” ， 该增强子可提高编码与患心血管事件的风险相关的生物标记物的基因的表达水平， 且在风险状态下其表达水平可被降低。 “增强子” 可以 是已知或发现可增加基因表达水平， 从而改进基因表达产物的功能或者改进或恢复基因表 达的任何化学或生物化合物。
对于克服基因表达水平的降低或恢复编码如在此描述的生物标记物的基因的表 达而言非常合适的治疗包括用基因治疗 (genereplacement) 代替， 该基因治疗是驱动所述 基因的表达的基因或其调节序列的基因治疗。本发明因此进一步涉及基因治疗， 其中编码 生物标记物的对象的功能失常基因或编码生物标记物的对象基因的功能失常的调节序列 被功能对应物 (counterpart) 所代替， 例如， 通过如慢病毒载体 (lentiviral vector) 的稳 定整合到对象宿主细胞的基因组中， 和所述转染的宿主细胞移植到所述对象中来进行， 该 慢病毒载体包含功能基因或调节序列， 宿主细胞是对象靶细胞系的祖细胞。
本发明也涉及基因治疗形式， 其中编码生物标记物的基因可用于 (i.a.) 设计这 些基因的显性阴性 ( 显性失活， dominant-negative) 的形式， 在这些基因从合适的载体定 向表达 (directed expression) 进入靶细胞之后， 这些基因可阻止它们的野生型对应物的 功能。
本发明的另一个目的在于提供药物组合物， 用以治疗患新血管疾病， 特别是缺血、 动脉粥样硬化和病态血管形成的风险增大的患者， 该药物组合物包含一种或多种抑制剂、 “增强子” 、 代替化合物、 载体或根据本发明的宿主细胞， 作为药物试剂或活性成分。该组合 物可进一步包含至少一种药用添加剂类， 例如载体、 乳化剂， 或防腐剂。
另外， 本发明的目的在于提供用于治疗患新血管疾病， 特别是缺血、 动脉粥样硬化 和病态血管形成的风险增大的对象的方法， 该方法包括向需要它的患者给予治疗有效量的 根据本发明的药物组合物。
小分子抑制剂
小分子抑制剂通常是化学物质， 这些化学物质可通过筛选已经存在的化合物库获 得， 或者可通过基于涉及肿瘤发育的基因编码的蛋白质结构设计化合物获得。 简言之， 蛋白 质的至少一个片段的结构可通过核磁共振或 X- 射线晶体学确定。基于这种结构， 进行化合 物的虚拟筛选。使用药物化学和 / 或组合化学合成选择的化合物， 此后体外和体内分析它 们对蛋白质的抑制活性。重复这个步骤直至选择出具有期望的抑制效果的化合物。在优化 该化合物之后， 使用合适的动物模型系统， 体内测试它的毒性谱和治疗功效。
不编码膜结合蛋白质的差异表达基因被选作开发小分子抑制剂的靶。为了鉴定 推定的结合位点或靶蛋白表面上小分子的袋， 可通过标准的结晶技术确定这些靶的三维 结构。可进行另外的突变分析， 从而确定鉴定出的结合位点的功能重要性。随后， 使用 Cerius2(Molecular S imulations 公司， 圣地亚哥， CA， USA) 和 Ludi/ACD(Accelrys 公司， 圣地亚哥， CA， USA) 软件， 虚拟筛选 (virtual screen) 小分子库。 被这些程序鉴定为潜在结 合剂的化合物可通过组合化学合成， 并通过标准的体外和体内试验对它们与该靶的结合亲 和力 (binding affinity) 和它们抑制靶蛋白功能的能力进行筛选。 除了新型小分子的合理 开发之外， 还使用这些试验筛选了现有小分子库， 从而产生前导化合物 (lead compound)。 鉴定出的先导化合物随后与靶共结晶， 从而获得关于小分子结合可如何改进的信息 ( 基于 这些发现， 设计、 合成、 测试和共结晶新型化合物 )。重复这种优化过程数轮， 导致成功抑制 其靶蛋白功能的本发明的高亲和性化合物的开发。最后， 使用标准试验 ( 经由加拿大， 魁北克， 蒙特利尔的 MDS Pharma Services 可商业上获得的服务 )， 测试该化合物的毒性， 在这之 后， 在动物模型系统中进行筛选。
核酶
反式 - 剪切催化 RNA( 核酶 ) 是具有内切核糖核酸酶活性的 RNA 分子。核酶是针 对特定的靶而特异性设计的， 且该靶信使必须含有特异性核苷酸序列。它们被设计从而剪 切细胞 RNA 本底中位点特异的任何 RNA 种类。该剪切事件使得 mRNA 不稳定并阻止蛋白质 表达。重要地， 为了通过检测表型效应， 在体外或体内环境确定未知功能的基因的功能， 核 酶可用于抑制该基因的表达。
一种普遍使用的核酶基序是底物序列要求最低的锤头状 (hammerhead)。锤头状 核酶的涉及在本领域中是熟知的， 这如核酶的治疗用途一样。核酶可以例如按美国专利 5,254,678 中描述的进行制备和使用。 HIV-IRNA 的核酶剪切描述在美国专利 5,144,019 中 ； 使用核酶剪切 RNA 的方法描述在美国专利 5,116,742 中 ； 提高核酶特异性的方法描述在美 国专利 5,225,337 中。锤头或发夹结构的核酶片段的制备和用途在本领域中也是已知的。 核酶也可通过旋转转录 (rolling transcription) 制取。
核酶的杂交区 (hybridizing region) 可被修饰或可制备成分支结构。核酶的基 本结构也可以本领域技术人员熟悉的方法进行化学改变， 且化学合成的核酶可作为单体单 元修饰的合成的寡核苷酸衍生物而给予。在治疗环境中， 脂质体介导的核酶递送提高细胞 吸收。
核酶的治疗和功能基因组应用的开展， 从知晓待抑制的基因的编码序列的一部分 开始。因而， 对于许多基因， 核酸序列可提供用于构建有效核酶的足够序列。在靶序列中选 择靶剪切位点， 并基于侧接于剪切位点的 5’ 和 3’ 核苷酸序列构建核酶。逆转录病毒载体 被设计为表达单体和多体垂头状核酶， 该垂头状核酶靶向靶编码序列的 mRNA。在体外测试 这些单体和多体核酶剪切靶 mRNA 的能力。用表达核酶的逆转录病毒载体稳定转导细胞系， 并通过 Northern 印迹分析和逆转录聚合物链式反应 (RT-PCR) 确认该转导。通过诸如疾病 标记物的表达减少或靶 mRNA 的基因产物减少的一类指示物， 针对靶 mRNA 的失活来筛选细 胞。
反义
反 义 多 核 苷 酸 被 设 计 成 特 异 性 结 合 RNA， 导 致 RNA-DNA 或 RNA-RNA 杂 合 体 (hybrid) 的形成， 其中遏制 DNA 复制、 逆转录或信使 RNA 翻译。 基于选择序列的反义多核苷 酸可干扰相应基因的表达。
典型地， 通过含有反义链作为转录链的反义构建体的表达， 反义多核苷酸在细胞 内产生。反义多核苷酸将结合和 / 或干扰相应的 mRNA 的翻译。因此， 反义在治疗上可用于 抑制肿瘤基因的表达。
反义 RNA 或反义寡脱氧核苷酸 ( 反义 ODN) 都可使用并也可在体外合成制备或通 过重组 DNA 技术制备。两种方法都在本领域技术人员所能及的范围之内。ODN 比完整的反 义 RNA 小， 并因此具有更容易进入靶细胞的优点。为了避免被 DNAse 消化， 可化学修饰 OND 和反义 RNA。为了靶向期望的靶细胞， 该分子可连接到在靶细胞上发现的受体的配体上， 或 可连接到针对靶细胞表面上的分子的抗体上。
RNAiRNAi 指 的 是 引 入 同 源 双 链 RNA， 从 而 特 异 性 靶 向 基 因 的 转 录 产 物， 导致无效 (null) 或亚等位基因 (hypomorphic) 表型。RNA 干扰需要起始步骤和效应步骤。在第一 步骤中， 引入的双链 (ds)RNA 被治疗成核苷酸 ‘引导序列’ 。这些可以是单链或双链。该引 导 RNA 并入核酸酶复合体中， 该复合体称为 RNA- 诱导沉默复合体 (RISC)， 其在第二生效步 骤起作用， 从而破坏被引导 RNA 通过碱基配对相互作用识别的 mRNA。RNAi 分子因而是双链 RNA(dsRNA)， 该双链 RNA 对于沉默靶基因的表达非常有效。本发明提供了与编码本发明生 物标记物的基因互补的 dsRNA。
dsRNA 抑制与它自身序列对应的基因表达的能力也称为转录后基因沉默或 PTGS。 在细胞的细胞质中正常发现的唯一的 RNA 分子是单链 mRNA 分子。如果细胞发现双链 RNA 分子， dsRNA， 那么它将使用酶将它们切割成一般含有 21 个碱基对 ( 约 2 圈 (turns) 的双链 螺旋 ) 的片段。每个片段的两个链然后分开到足以使反义链暴露， 以便它可结合到 mRNA 分 子上的互补有义序列上。 这在该区域引发切割 dsRNA， 因而破坏它被翻译成多肽的能力。 引 入对应于特定基因的 dsRNA 将敲除该基因的细胞内源表达。这可在选择的时间在特定组织 中完成。简单地将 dsRNA 片段引入到细胞中的可能缺点是基因表达仅暂时降低。然而， 提 供了更永久的方法， 其通过在细胞中引入 DNA 载体来实现， 该 DNA 载体可连续合成对应于待 被抑制的基因的 dsRNA。
RNAi 分子通过本领域人员所熟知的方法制备。一般地， 分离的包含核苷酸序列 的核酸序列可用作 RNAi 分子， 这种核苷酸序列与编码本发明生物标记物的基因中的至少 一个基因的序列基本同源， 并可以形成一个或更多转录本， 该转录本可以和 ( 部分 ) 所述 基因的转录产物形成部分或完全的双链 (ds)RNA。该双链区可以是数量级为 10-250， 优选 1-100， 更优选 20-50 个核苷酸长度。
RNAi 分子优选在转导的宿主细胞中由重组载体表达， 造血干细胞非常适合在那 里。
显性阴性突变
对于相应的多聚体形式活性蛋白质， 显性隐形突变容易产生。突变多肽将与野生 型多肽 ( 由其它等位基因获得 ) 相互作用并形成无功能的多聚体。 因而， 突变在底物结合结 构域、 催化结构域、 或细胞定位结构域中。优选地， 过度生产突变多肽。形成具有此种效果 的点突变。另外， 各种长度的不同多肽融合到蛋白质末端可产生显性阴性突变。一般策略 可用于形成显性阴性突变。此种技术可用于创建对确定蛋白质功能有用的功能突变丧失。
构成抗体的多肽的用途
一方面， 本发明提供了适合于治疗和 / 或诊断用途的抗体。
治疗性抗体包括可特异性结合到编码本发明生物标记物的基因的表达产物的抗 体。 通过直接结合到基因产物， 该抗体通过例如在蛋白质情况下的空间位阻， 或通过阻断这 些蛋白质的至少一个功能结构域， 可影响它们的靶的功能。 因此， 这些抗体可用作基因产物 功能的抑制剂。可例如针对蛋白质功能上相关的结构域产生此种抗体， 且随后使用标准技 术和试验对它们干扰靶功能的能力进行筛选。
可替换地， 抗 -RNA 抗体可例如用于沉默本发明的肿瘤相关基因的信使。在另一个 可替换的实施方式中， 抗体也可用于直接影响它们的靶功能， 例如通过结合到信号途径的 成员， 以便影响靶蛋白质或核酸的功能。 在又一个实施方式中， 治疗性抗体可携带一个或更多毒性化合物到那里， 该毒性化合物凭借该携带抗体的结合对靶或靶细胞发挥其作用。
对于诊断目的， 可使用类似于上述的那些抗体， 优选使用能够结合到本发明基因 的表达产物上并具有可检测标签， 例如荧光、 发光或放射性同位素标签从而允许检测基因 产物的那些抗体。优选地， 此种诊断性抗体被靶向蛋白质靶， 该蛋白质靶存在于细胞外膜 (outer envelop) 上， 例如膜结合靶蛋白质 ( 生物标记物 )。
用在本发明中的抗体可以来自任何动物来源， 包括鸟类和哺乳动物 ( 例如， 人、 鼠、 驴、 绵羊、 兔、 山羊、 豚鼠、 骆驼、 马， 或鸡 )。优选地， 本发明抗体是人或人源化单克隆抗 体。如本文使用的， “人” 抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体， 并包括从人免疫 球蛋白文库分离的抗体 ( 包括但不限于， 与人免疫球蛋白序列同源的免疫球蛋白序列的合 成库 )， 或从表达人基因的抗体的小鼠中分离的抗体。
对于一些用途， 包括在人中抗体的体内治疗或诊断用途和体外检测试验， 可优选 使用人或嵌合抗体。完全人抗体对人对象的治疗治疗特别理想。可利用源自人免疫球蛋白 序列或与人免疫球蛋白序列同源的合成序列的抗体文库， 通过本领域中已知的多种方法， 包括上述噬菌体展示方法， 来制造人抗体。也可参见美国专利 4,444,887 和 4,716,111 ； 和 PCT 公开 WO98/46645， WO98/50433， WO98/24893 和 WO98/16654， 它们中的每篇均完整地结合 于此， 以供参考。 与本发明方法一起使用的抗体包括经修饰的衍生物， 即， 通过将任何类型的分 子共价连接到抗体上， 以便共价连接。另外， 该衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸 (non-classical amino acids)。
在本发明的某些实施方式中， 当与未经修饰的抗体相比时， 与本发明一起使用的 抗体在哺乳动物， 优选人中具有延长的半衰期。体内半衰期延长的抗体或其抗原结合片段 可通过本领域技术人员已知的技术生产 ( 参见， 例如， PCT 公开 WO97/34631)。
在某些实施方式中， 与本发明方法一起使用的抗体是单链抗体。单链抗体的设计 和构造在本领域中是熟知的。
在某些实施方式中， 与本发明一起使用的抗体结合到细胞内表位上， 即， 为胞内抗 体。胞内抗体包含能够免疫特异性地结合抗原的抗体的至少一部分， 并优选不含有编码其 分泌 (secretion) 的序列。此种抗体将在细胞内结合其抗原。在一个实施方式中， 胞内抗 体包含单链 Fv(“sFv” )。在进一步的实施方式中， 该胞内抗体优选不编码可操作性分泌序 列， 因而保持在细胞内。
胞内抗体的生成对技术人员是熟知的， 且描述在， 例如美国专利 6,004,940、 6,072,036、 5,965,371 中， 这些专利完整地结合于此， 以供参考。
在一个实施方式中， 胞内抗体在细胞质中表达。在其他实施方式中， 该胞内抗体 被定位到各种细胞内位置。在此种实施方式中， 特异性定位序列可连接到核苷酸内多肽 (intranucleotidepolypepetide) 上， 从而将胞内抗体引导到特定位置。
与本发明方法一起使用的抗体或其片段可通过本领域中用于合成抗体的任何已 知方法生产， 特别地通过化学合成， 或优选地通过重组表达技术。
单克隆抗体可使用本领域已知的多种技术制备， 包括使用杂交瘤技术、 重组技术 和噬菌体展示技术， 或这些技术的组合。 例如， 可使用包括本领域中已知技术的杂交瘤技术 生产单克隆抗体。术语 “单克隆抗体” ， 如本文使用的， 不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。
术语 “单克隆抗体” 是指源自单克隆的抗体， 包括任何真核、 原核、 或噬菌体克隆， 不是指用 于生产它的方法。
可用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的实例包括 WO97/13844 和美国专利 5,580,717、 5,821,047、 5,571,698、 5,780,225 和 5,969,108 中公开的方法， 这些文献中每 篇均结合于此， 以供参考。
如上面参考文献中所描述的， 在噬菌体选择 (phage selection) 之后， 来自噬菌 体的抗体编码区 (antibody coding region) 可被分离并可用于产生全抗体， 包括人抗体， 或任何其他期望的抗原结合片段， 且在任何期望的宿主中表达， 包括哺乳动物细胞、 昆虫细 胞、 植物细胞、 酵母和细菌， 例如， 如下所述的。也可使用本领域中已知的方法， 例如 PCT 公 开 WO92/22324 所公开的那些， 采用重组生产 Fab、 Fab′和 (Fab’ )2 片段的技术。
也可以生产治疗上有用的 IgG、 IgA、 IgM 和 IgE 抗体。对于生产人抗体和人单克 隆抗体的技术和用于生产此种抗体的方案的详细讨论， 参见例如 PCT 公开 WO98/24893， 其完整地结合于此， 以供参考。另外， 诸如 Medarex 公司 (Princeton， NJ)、 Abgenix 公司 (Freemont， CA) 和 Genpharm(San Jose， CA) 等公司， 使用与上述技术类似的技术， 提供针对 选择抗原的人抗体。
用于生产该抗体、 其衍生物或类似物 ( 例如， 本发明抗体的重链或轻链或者它们 的部分， 或者本发明的单链抗体 ) 的重组表达， 需要构建含有编码此抗体的多核苷酸的表 达载体， 和所述载体在合适的宿主细胞或甚至在体内表达。已获得编码抗体分子或抗体的 重链或轻链， 或者它们的部分 ( 优选地， 但不是必须地， 含有重链或轻链可变域 ) 的本发明 多核苷酸后， 可通过使用本领域中熟知的技术通过重组 DNA 技术生产用于生产抗体分子的 载体。因而， 在此描述了通过表达含有编码核苷酸序列的抗体的多核苷酸用于制备蛋白质 的方法。本领域中技术人员所熟知的方法可用于构建含有抗体编码序列和适当的转录和 翻译控制信号的表达载体。这些方法包括， 例如体外重组 DNA 技术、 合成技术， 和体内基 因重组。本发明因而提供了可复制的包含核苷酸序列的载体， 该核苷酸序列编码本发明 的抗体分子、 抗体的重链或轻链、 抗体或其部分的重链或轻链可变域、 或可操作地连接到 启动子的重链或轻链 CDR。此种载体可包括编码抗体分子的恒定区 ( 参见， 例如 PCT 公开 WO86/05807、 PCT 公开 WO89/01036， 和美国专利 5,122,464) 的核苷酸序列， 且该抗体的可变 域可被克隆到此种载体中， 用以表达整个重链、 整个轻链， 或整个重链和轻链二者。
通过传统技术将表达载体转移到宿主细胞中， 转染的细胞然后通过传统技术培 养， 从而生产本发明的抗体。因而， 本发明包括含有多核苷酸的宿主细胞， 该多核苷酸编码 本发明抗体或其片段， 或它的重链或轻链， 或它的一部分， 或可操作地连接到异源启动子的 本发明单链单体。在用于表达双链抗体的优选实施方式中， 编码重链和轻链的载体可在宿 主细胞中共表达， 用于表达整个免疫球蛋白分子， 详细描述如下文。
可采用多种宿主 - 表达载体系统， 从而表达如在此定义的抗体分子。
在哺乳动物宿主细胞中， 可利用一些基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载 体的情况下， 感兴趣的抗体编码序列可连接到腺病毒转录 / 翻译控制复合体， 例如， 后期启 动子和三联前导序列 (tripartite leader sequence)。 这种嵌合基因然后可通过体外或体 内重组插入腺病毒基因组。在病毒基因组的非必需区 ( 例如， 区 E1 或 E3) 中的插入将产生 重组病毒， 该重组病毒是可存活的并能够表达感染宿主中的抗体分子。插入的抗体编码序列的高效翻译也需要特异性起始信号。这些信号包括 ATG 起始密码子和相邻序列。而且， 起始密码子必须与期望的编码序列的阅读框同相， 从而确保整个插入片段的翻译。这些外 源翻译控制信号和起始密码子可以是多种来源的， 既有天然的， 又有合成的。 表达效率可通 过包括适当的转录增强子元件、 转录终止子等而提高。
与本发明方法一起使用的抗体分子已通过重组表达产生之后， 可通过本领域中 已知用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法进行纯化， 例如， 通过色谱法 ( 例如， 离子交 换、 亲和性、 特别是通过在蛋白质 A 之后对特异抗原的亲和性， 以及尺寸柱色谱 (sizing columnchromatography))、 离心法、 差异溶解法， 或通过纯化蛋白质的任何其它标准技术。 进一步地， 本发明抗体或其片段可融合到本文描述的异源多肽序列或本领域中已知的其它 序列上， 从而促进纯化。
如上所述， 根据进一步的方面， 本发明提供了如上定义的抗体， 其用于治疗中。
对于治疗治疗， 该抗体可在体外生产并应用到需要它的对象。该抗体可通过任何 合适的路径， 优选以适合此种路径的药物组合物形式和以对预期治疗有效的剂量向患者给 予。技术人员容易确定降低疾病进展速率或除去疾病状况所需要的抗体的治疗有效剂量。
可替换地， 对象本身可通过使用如上所述的体内抗体生产方法生产抗体。 合适地， 用于此种体内生产的载体是病毒载体， 优选对在此提及的特异性靶细胞具有靶细胞选择性 的病毒载体。
因此， 根据又一个方面， 本发明提供了如上定义的抗体在药剂制造中的用途， 该药 剂可用于治疗对象， 从而实现所述治疗效果。 该治疗包含该药剂的给予， 给予剂量为足以实 现期望的治疗效果的剂量。该治疗可包括抗体的重复给予。
根据又一个方面， 本发明提供了治疗人的方法， 该方法包括如上定义抗体的给予， 给予剂量为足以实现期望的治疗效果的剂量。 该治疗效果是患心血管事件的风险的减小或 阻止。
诊断性和治疗性抗体优选用在它们靶向激酶或磷酸酶的各个应用中， 该激酶或磷 酸酶经常偶联到细胞表面上的受体分子上。 因此， 能够结合到这些受体分子上的抗体， 通过 结合到各个受体， 可对激酶或磷酸酶施加活性调整作用。 转运蛋白 (transporter protein) 也可有利地靶向， 原因与当细胞外存在时抗体能够施加其活性调整作用的原因相同。上述 靶， 连同信号分子， 表示优选的用于本发明抗体用途的靶， 因此本发明抗体用作更有效的治 疗和更容易的诊断是可能的。
诊断性抗体适合用于在确定蛋白质的水平变化或其中结构改变的试验中定性和 定量检测基因产物， 优选蛋白质。例如， 可在细胞、 细胞提取物、 上清液、 体液中确定蛋白 质水平， 其通过例如免疫染色的靶细胞的流式细胞术评价进行， 优选在血液中或内皮细胞 (EPC) 或所述血液中存在的多形核白细胞 (PMN) 中。可替换地， 定量蛋白试验， 例如 ELISA 或 RIA、 Western 印迹和成像技术 ( 例如， 使用共聚焦激光扫描显微术 ) 可与如在此描述的 用于诊断心血管事件风险提高的抗体合作使用。
药物组合物和治疗用途
药物组合物可包含多肽、 抗体、 多核苷酸 ( 反义、 RNAi、 核酶 )， 或要求保护的本发 明的小分子、 在此统称为抑制剂化合物。 该药物组合物将包含治疗有效量的生物标记蛋白、 抗体、 多核苷酸或在此描述的小分子。抑制剂化合物也可包括能够 ( 化学 ) 干扰鉴定的调节基因功能的物质， 该干扰例 如可通过受体封阻 (receptor blockage) 实现。 可替换地， 可采用转录因子诱捕技术 (decoy technology)， 例如美国专利 6,774,118 中所描述的， 该专利全部引用在此， 以供参考。
生物标记物的抑制剂可以是抑制生物标记物的生物学活性的抗生物标记物的抗 体、 抗所述生物标记物受体的抗体、 生物标记物结合蛋白质， 或同种型突变蛋白 (isoforms mutein)、 融合蛋白， 或它们的功能衍生物。
技术人员也可发现在如此处定义的活化 EPC 中被下调的基因， 并可发现这些下调 基因或它们的表达产物作为本发明多方面中的治疗靶或治疗剂的合适用途。 在活化细胞中 被下调的表达产物的抑制剂可适合用作新血管疾病治疗方法中的治疗剂。
术语 “治疗有效量” ， 如本文中所用， 指的是治疗、 改善或预防预期疾病或病况的治 疗剂的量， 或表现出可检测的治疗或预防效果的治疗剂的量。该效果可通过例如化学标记 物或抗原水平检测。治疗效果也包括身体症状的减轻， 例如体温降低。用于对象的精确有 效量将取决于对象的尺寸和健康、 病症的性质和程度以及选择用于给予的疗法或疗法的组 合。因而， 提前规定精确的有效量是没有意义的。然而， 用于给定情况的有效量可通过常规 实验确定并在临床医师的判断范围之内。 具体地， 本发明的组合物可用于治疗、 改善或预防 对象中心血管事件和 / 或伴随生物或物理表现的发生。
对于本发明的目的， 在被给予的个体中， 有效剂量可以是约 0.01mg/kg ～ 50mg/kg 或 0.05mg/kg ～约 10mg/kg 的多核苷酸、 多肽或抗体组合物。
药物组合物也可含有药用载体。术语 “药用载体” 指的是用于给予治疗剂， 例如抗 体或多肽、 基因， 和其他治疗剂的载体。 该术语指的是本身不会导致对接受该组合物的个体 有害的抗体产生， 且可被给予而没有不适当的毒性的任何药物载体。合适的载体可以是大 的、 代谢缓慢的大分子， 例如蛋白质、 多糖、 聚乳酸、 聚乙醇酸、 聚合的氨基酸、 氨基酸共聚物 和无活性病毒颗粒。此种载体是本领域中普通技术人员所熟知的。
药用盐可用在其中， 例如， 无机酸盐， 例如盐酸盐、 氢溴酸盐、 磷酸盐、 硫酸盐 等； 有机酸盐， 例如醋酸盐、 丙酸盐、 丙二酸盐、 苯甲酸盐等。药用赋形剂的详尽讨论可在 Remington′ sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.， N.J.1991) 中获得。
治疗组合物中的药用载体可包含液体， 例如水、 盐水、 甘油和乙醇。 另外， 此种媒介 物 (vehicle) 中可存在辅助物质， 例如湿润剂或乳化剂、 PH 缓冲物质等。典型地， 治疗组合 物可制成注射物， 要么制成液体溶液， 要么制成悬浮液 ； 也可制成在注射之前， 适合于溶解 或悬浮在液体媒介物中的固体形式。脂质体包括在药用载体的定义内。
递送方法
经配制之后， 本发明药物组合物可以 (1) 直接给予对象 ； (2) 回体递送到源自对象 的细胞 ； 或 (3) 体外递送， 以表达重组蛋白质。
组合物的直接递送一般可通过注射完成， 该注射可为皮下注射、 腹膜内注射、 静脉 注射或肌肉注射， 或者可递送到组织的胞间隙。该组合物也可给予至斑块 (plaque) 或病变 区中。 给予的其他模式包括局部、 口服、 导管插入和肺部给予、 栓剂、 和经皮应用、 注射针、 和 粒子枪 (particle gun) 或无针注射器。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
回体递送方法和再植入转化细胞到对象中的方法是本领域中已知的， 并描述在例 如， 国际公开 WO93/14778 中。在回体应用中有用的细胞实例包括， 例如， 干细胞， 特别是造血细胞、 淋巴细胞、 巨噬细胞、 树突细胞， 或肿瘤细胞。
一般地， 对于回体和体外应用的核酸递送可通过如下方式完成， 例如， 葡聚糖介导 的转染、 磷酸钙沉淀法、 聚凝胺 介导的转染、 原生质体融合、 电穿孔、 ( 一种 或多种 ) 多核苷酸在脂质体中的包封、 以及 DNA 直接显微注射到细胞核， 这些都是本领域中 所熟知的。
多种方法可用于将治疗组合物直接给予至体内特异位点上。例如， 定位靶位置并 直接在靶中注射治疗组合物。可替换地， 鉴定出服务 (serve) 靶位置的动脉， 并将治疗组合 物注射到此动脉中， 以便将该组合物直接递送到靶位置。将反义组合物直接给予至动脉粥 样硬化病变区的表面上， 例如， 通过该组合物的局部施用。使用 X- 射线成像辅助某些上述 递送方法。
也使用了治疗组合物到特异组织的受体介导的靶向递送， 该治疗组合物包含反义 多核苷酸、 亚基因组多核苷酸 (subgenomicpolynucleotides) 或抗体。受体介导的 DNA 递 送技术是本领域中熟知的。优选地， 含有本发明抗体的治疗组合物的受体介导的靶向递送 用于将该抗体递送到特异组织中。
在基因治疗方案中， 对于局部给予， 含有反义、 核酶或 RNAi 多核苷酸的药物组合 物的给予范围为约 100ng ～约 200mg 多核苷酸。在基因治疗方案期间， 也可使用浓度范围 为约 500ng ～约 50mg、 约 1μg ～约 2mg、 约 5μg ～约 500μg 以及约 20μg ～约 100μg 的 多核苷酸。诸如作用方法和转化及表达效率等因素是需要考虑的问题， 这些问题影响多核 苷酸发挥最终功效所需的剂量。如果期望在面积较大的组织上进行更大的表达， 则需要较 大量的多核苷酸或在连续的给予方案中相同量的再给予， 或向例如动脉粥样硬化位点的不 同的邻近或靠近组织部分多次给予， 从而达到积极的治疗效果。 在所有情况下， 临床试验中 的常规实验均可确定最佳治疗效果的具体范围。基因治疗载体， 尤其是逆转录病毒载体的 更完整的描述包含在美国系列号 08/869,309 中， 该专利清楚地结合于此。
所有引用在此的参考文献均完整地结合于此， 以供参考。
下面， 在下述实验部分中进一步解释本发明。
实验部分
实施例 1
通过血管发生的血管再形成， 可构成对用于严重的肢体缺血和缺血性心脏病有吸 引力的治疗策略。 我们在适当的动物模型中已鉴定出可通过其控制血管生成的新的分子途 径， 并测试了它们使血管功能恢复的能力。通过 DNA 芯片微阵列分析， 我们在小鼠发育中鉴 定出与血管生成的不同阶段相关的 1160 个差异表达的克隆。我们然后结合小鼠和斑马鱼 基因组研究的互补强度 (complementarystrength)， 从而在这些基因当中鉴定出用于血管 生成的关键的选择基因 (selector gene)。从微阵列获得的基因用于 (1) 获得它们的斑马 鱼直系同源物并用于在鱼胚胎中进行整体原位杂交， 从而鉴定它们的表达模式， 和 (2) 用 于在斑马鱼中使用反义吗啉环 (morpholino)， 从而敲低 (knock down) 在成血管细胞和血 管中特异性表达的那些基因。近 30 个基因通过这些筛滤 (1) 和 (2)。通过异位表达和敲低 分析， 我们进一步在体外研究了感兴趣的这些基因在 3D 基质胶内皮细胞培养物中的效果， 并在体内研究了感兴趣的这些基因在斑马鱼发育和在肢体缺血、 动脉粥样硬化、 易损斑块 形成、 急性心肌梗塞和肿瘤血管发生的小鼠模型中的效果。研究了这些小鼠中的功能意义(functional implication)， 包括定量组织学分析、 激光多普勒成像和血管造影术。 对从来 自血液样本的循环 PML 分离的 RNA 表达进行互补的定量 PCR 分析， 验证了鉴定出的候选血 管生成基因在缺血性新血管疾病患者中的表达。 已经鉴定出有推定的调节作用的数个候选 基因， 包括血红素加氧酶家族 (Hmox1/2)、 stab1 和 2。
因为在胚胎血管生成期间， Hmox 系统被鉴定为其中一个上调基因系统， 所以我们 正在使用我们生成的 Hmox1- 敲除小鼠， 研究血红素加氧酶系统在血管生成中的作用。我们 假定在导致代偿性血管生成和血管修复的缺血和动脉修复期间， 这些候选基因和基因产物 提供了代偿系统。
基于这些在斑马鱼、 小鼠、 新血管疾病患者中进行的胚胎学和缺血研究， 我们对缺 血性疾病和动脉修复中血管生成和成血管细胞分化的分子机制有了必要的理解， 并在广泛 的环境中将这些基因鉴定为缺血和动脉受损之后进行性血管生成和动脉修复的指示物。
基于胚胎学和缺血的研究， 我们能够鉴定出调节基因和信号途径， 该调节基因 和信号途径涉及血管生成的起始、 新毛细管网到血液动力重要的动脉床 (hemodynamic significant arterial bed) 的成熟和重塑。这些调节基因涉及 EPC 募集、 活化和迁移至 因缺血和动脉受损造成的新血管形成的区域中。在早期胚胎发生期间， 可独立于胚胎内 (intra-embryonic) 血生成研究血管生成， 而在确立了初始的基本血管形态的时期， 则在胚 胎内血生成之前研究血管生成。通过使用 DNA- 微阵列的全基因组筛选， 鉴定出小鼠血管 生成的这些不同阶段涉及的已知和未知基因 (EST 标签 )， 并已使用表达谱分析通过在小鼠 和 CAD 患者发育和缺血期间在成血管细胞中的定量 PCR 进一步选择这些基因。这些候选基 因包含转录因子、 生长因子和蛋白激酶和磷酸酶 (phosphatises)。我们已结合小鼠和斑马 鱼基因组研究的互补强度， 从而在这些基因中鉴定出对于血管生成关键的选择基因， 该选 择基因因而也涉及动脉修复和缺血驱动的 (ischemia-driven)EPC 活化及随后的新血管形 成。 随后， 通过微阵列鉴定的基因已用于在鱼胚胎中进行整体原位杂交， 从而鉴定发育时期 它们的表达模式， 并用于在斑马鱼中使用反义的吗啉环， 以敲低在成血管细胞和血管中被 特异性表达的那些基因。 通过这个方法， 64 个基因已通过这些选择标准 ( 即， 特异性成血管 细胞表达和沉默后血管生成表型 )。
这 64 个候选基因在血管生成和动脉修复中的作用进一步被探究并使用基因转移 分析通过病毒载体介导的靶基因的过表达和沉默在体外在 3D 基质胶系统中被验证。在标 准化的小鼠肢体缺血模型、 动脉粥样硬化模型、 标准化的易损斑块形成模型和肿瘤血管发 生模型中， 通过病毒载体介导的候选基因的基因转移， 在体内测试了血管生成因子在哺乳 动物系统中的意义。 通过 ( 共聚焦 (confoal)) 组织学分析、 激光多普勒成像和血管造影学， 监测这些新血管营养和成熟因子的持续表达或沉默对新血管形成的影响。
技术人员应当理解， 怎样在急性心肌梗塞的小鼠模型中通过这些血管生成基因的 表达， 和通过在心血管患者的各种亚组中基因产物的表达分析， 进一步调查和进行在此提 出的多方面的临床验证研究， 其中心血管患者的各种亚组包括但不限于， 稳定型心绞痛、 不 稳定型心绞痛、 急性冠状动脉综合征、 经受短暂性缺血性脑血管事件 (TIA/CVA) 的患者、 外 周血管疾病和患有顽固性心绞痛的患者。
当前， 本发明人已鉴定出在鼠和鱼成血管细胞发育期间和成年缺血期间被特异性 表达的 64 个克隆， 其包括编码 Hmoxl 及 stab1 和 2 的基因。因为 Hmox1 鉴定为在鼠和鱼胚胎的血管生成期间被表达的可能的关键调节蛋白， 所以通过体外分析进一步深入研究了 Hmox 系统在 Hmox1-/- 胚体中的血管丛形成中的作用。 随后在体内在 Hmox1- 无效 ( 败合， nullizygous) 小鼠的缺血性腿模型中并通过利用 siRNA 敲低分析， 测试了 Hmox1 表达缺失的意义， 并将其与野生型同窝出生动物 (littermate) 或 混杂 siRNA 治疗的动物相比较。
为了鉴定血管生成的遗传定子， 我们已使用 DNA 芯片分析小鼠胚胎发生期间血管 发育的各个阶段， 从而进行候选调节基因的全基因组筛选。为了鉴定定向于内皮细胞谱系 的成血管细胞， 我们使用 Flk1 辅助的细胞分选 (cell sorting)， 之前已显示该细胞分选 可指定早期造血干细胞、 专用成血管细胞， 及完全分化的内皮细胞， 从而包括血管原细胞 (haemangioblast) 到 EC 的完全分化过程。在不同胚龄进行的免疫标记研究， 表示 Flk1 早 在受孕后 (dpc) 第 8 天被表达并在胚胎发生的较晚阶段与 PECAM、 vWF、 E- 选择蛋白、 Tie-2 和 VE- 钙粘着蛋白表达交叉相关。同样地， Drake 和同事证明了血管的形态发生可以顺序 表达模式来限定， 其中 TAL1 和 Flk1 首先被表达， 接着 PECAM、 CD34、 VE- 钙粘着蛋白被表达， 以及更晚被表达的是 Tie2， 暗示了 Flk1+ 细胞确实定向于内皮细胞谱系。相比， Flk1 表达 在胚外 (extra-embryonic) 造血干细胞中被迅速下调， 因为它们定向于造血谱系。 原位杂交和免疫定位研究表明 Flk1 转录最早可在小鼠胚胎早期， 在 8pc 天， 刚 好在体节发生 (somitogenesis) 开始之前检测到。在这个阶段， 在确定的血管形成之前， Flk1/CD34 转录可在推定的血管内皮祖细胞中检测到。后来， 可在发育的背主动脉的内皮 前躯细胞 (pre-endothelial cell) 中和在颅内皮前驱细胞中检测 Flk1 转录， 该颅内皮前 驱细胞后来聚结以形成血管网。早在发育的第 9 天， 含有许多染色的内皮前驱细胞的颅间 充质形成毛细管网。 更重要地， 在发育的这些早期阶段， 血管生成可在没有血生成的情况下 观测到， 因为在发育的小鼠胚内， 血管生成发生在血生成之前， 血生成可在 11.5dpc 以后观 测。因此， 这个时间窗 (8-11dpc 天 ) 提供了在正常小鼠发育的情况下和在没有血生成的情 况下在体内研究血管生成的唯一时机。
在早期小鼠胚胎发生的这个研究中， 我们通过流式细胞术细胞分选， 已从在 8、 9、 10、 11 和 16dpc 天的 FVB/n 小鼠胚胎中分离出 Flk1+ 成血管细胞和 Flk1-- 对照细胞。使 用 DNA 芯片阵列对总 RNA 的差异 RNA 表达进行了分离和筛选。在最初的选择中， 我们已计 入上调两倍以上的基因。仅选择具有可靠的杂交模式 ( 基于匹配 - 不匹配谱 ) 的基因用于 进一步分析 (Rosetta Resolver)。该分析中包括了未知基因 (EST 标签而不限定功能或表 达谱 )， 而从进一步分析中排除了已知的结构和看家基因。使用同源物检索、 聚类和结构域 分析 (CELERA)， 排序并进一步分析选择的 EST 克隆的完全开放的阅读框。因为我们主要对 调节蛋白质 ( 和信号途径 ) 感兴趣， 所以特别选择了蛋白质激酶和磷酸酶。基于序列分析、 相关功能的文献检索和动物模型中的初步表达数据， 选择了共 1160 个已知和未知克隆， 用 于在斑马鱼发育中进行进一步的体内分析。先前显示， 类似的跨物种表达谱分析方法成功 分析了人胚胎造血的基因调节， 该方法运用吗啉环注射在斑马鱼胚胎中产生了 23％的处于 明确表型的人克隆， 证明这种联合人 / 鱼表达谱分析方法的效率和可行性。
为了进一步选择候选的调节基因和证明成年血管生成中选择的候选基因和人疾 病之间的相关性， 使用定量 (RT)PCR(QPCR)， 将胚胎表达数据， 与在斑马鱼发育中、 在后肢缺 血的成年小鼠模型中和在人疾病中的内源基因表达交叉相关。
为了进一步选择候选的调节基因， 在斑马鱼胚胎发生期间验证了发育的血管树中 候选基因的表达。我们已鉴定出这些选择的基因的 1160 个斑马鱼直系同源物， 并已将它们 转化成反义的核糖核酸探针 ( 从 IMAGE 数据库获得， 其它的由 RT PCR 克隆 )。已在斑马鱼 成血管细胞迁移和血管生成的各个阶段进行整体原位杂交 (WISH)。 斑马鱼特别适合于这个 方法， 因为不需切开该材料和因为在一个 WISH 中结合和分析血管形成的不同阶段。这些研 究将 1160 个候选基因的选择缩小到 73 个克隆， 这是基于它们在斑马鱼胚胎发生， 在发育的 血管树和相关疾病模型中的表达模式进行的。
为了证明选择的候选基因在成年血管生成中的相关性， 我们随后验证选择的克 隆的内源表达， 这是通过 QPCR， 在肢体缺血 ( 被结扎的股动脉 ) 的小鼠体内模型中， 根 据 Couffinhal 和 他 的 同 事 描 述 的 方 法 (Circulation
[1999] Vol.99(24) ： 3188-98 ； Am J Pathol
[1998] Vol.152(6) ： 1667-79) 进行的。
为了证明选择的候选基因在人新血管疾病中的相关性， 我们当前正通过 QPCR 和 微阵列分析， 验证分离的人循环内皮祖细胞 (EPC) 中的表达， 该分离的人循环内皮祖细胞 收集于急性冠状动脉综合症患者。已显示， 循环 EPC 涉及成年血管生成反应和新血管疾病 患者中的动脉修复， 并在急性冠状动脉综合征之后， 显著提升了 2-7 天， 急性冠状动脉综合 征揭示进行性缺血的血管生成。我们实验室通过流式细胞术细胞分选按常规进行了 EPC 分 析和分离。另外， 通过 QPCR(CAD)， 在从心脏外植体中获得的患者材料中也验证了选择的克 隆的差异基因表达。这些人样本按常规收集并储存， 并因而容易得到。
这个亚研究 (sub study) 已将选择的血管生成克隆数目缩小到 64 个候选基因， 并 确认这些克隆在成年血管生成的其他模型中和在人 CAD 疾病中被等同地影响。
在胚胎和缺血性的和肿瘤的血管生成或 PCE 期间被差异表达的基因， 已通过基于 吗啉环的敲低方法， 在斑马鱼发育中在体内进一步评估。使用反向遗传、 反义方法， 正对源 自选择筛滤 1( 在斑马鱼发育、 小鼠缺血模型和人 CAD 疾病中的表达分析 ) 的 64 个候选基 因进行功能分析。斑马鱼提供了研究血管生成的遗传学的优良模型， 因为斑马鱼胚胎在子 宫外面发育并在 24 小时内经历血管生成， 而控制这个过程的基因似乎穿过物种边界被保 存。另外， 在包括鱼的低等脊椎动物中， 特定反义化学物质 ( 称为吗啉环 ) 的使用已证明可 提供沉默特异性基因表达的容易而稳健的方式， 该方式分别根据啉代是否针对翻译起始密 码子或外显子 - 内含子边界， 通过抑制翻译或干扰靶 mRNA 的剪接进行。抗所有斑马鱼基因 的吗啉环， 已被设计成， 如概述的， 在发育期间的成血管细胞和血管中被表达， 并用于研究 在用于 fli::GFP 和 GATA2::GFP 胚胎转基因中的影响。这些 fli::GFP 转基因鱼表达内皮 细胞中的荧光 GFP 蛋白， 这使得可在各个阶段目测和分析活胚胎 (life embryo) 中的血管 形成。这种研究策略可用来对在人、 小鼠和鱼血管生成干细胞分化中有可疑作用的基因进 行分析， 并从 73 个基因中鉴定出 64 个， 这 73 个基因是通过转录谱分析方法在人中初始鉴 定的， 且在被敲低的时候显示斑马鱼胚胎中的明显的表型。
血管生成潜在调节基因的敲低分析， 可产生多种感兴趣的血管生成表型， 包括， 血 管生成的缺失 (a- 血管生成 )、 旺盛的血管生成或缺少完整性的异常血管形态， 如 Fli::GFP 斑马鱼中的 GTP 表达、 异常循环和血管完整性所证明的。
例如， Sox7/18 及通过 DNA 阵列和 ISH 分析鉴定的两个候选基因的吗啉环诱导的 敲低分析， 可在 Fli::GFP 斑马鱼中产生这种表型， 即， 含有背主动脉和心大静脉之间的大量分流形成 (prominentshunt formation)( 暗示异常小管再生 )、 水肿形成和缺陷循环。
实施例 2
在胚胎和缺血的血管生成期间差异表达的基因 ： 在 3D 基质胶阵列中的体外研究 ； 在哺乳动物后肢缺血模型和动脉粥样硬化 ( 和斑块去稳定 )、 肿瘤血管发生和急性心肌梗 塞的小鼠模型中的体内研究。
为了进一步选择和定义候选基因在哺乳动物血管生成期间的具体作用， 可在体外 血管生成模型 ( 使用重组病毒载体 - 介导的基因转移和 siRNA 致使的基因沉默 ) 中利用 功能增益和功能缺损修饰， 分析选择的涉及血管生成调节的基因， 如用之前的 DNA- 微阵列 分析、 QPCR 研究、 和在斑马鱼中的 WISH 分析、 在斑马鱼发育中的吗啉环敲低分析所鉴定的 基因。我们使用 3D 基质胶系统作为体外血管生成模型。基因经修饰的 EC 和 EPC 细胞的分 化， 其中已引入功能增益或功能缺损修饰， 可供给优良的替换物以在体内研究转基因动物， 从而分析关于血管发育过程的具体突变的结果， 尤其当这些突变对胚胎致命时。慢病毒和 腺病毒载体系统 ( 猫科动物免疫缺陷载体系统 -FIV、 Ad5) 被用于在细胞培养物和动物模型 中表达感兴趣的基因， 该动物模型如允许研究缺血性疾病发病机理中感兴趣基因的体内功 能的体细胞 (somatic) 转基因模型。
使用重组病毒载体系统， 可在鼠和人内皮细胞和内皮祖细胞中过表达涉及血管生 成调节的基因， 如用 DNA- 微阵列分析、 QPCR 研究、 和在斑马鱼中的 WISH 分析鉴定的基因。 可结合计算机辅助的图像分析 ( 使用 2D 绘制 ) 使用共聚焦显微术分析血管形态测定。 分别 使用双重标记的 Flk1/ 碘化丙啶、 Flk1/ 膜联蛋白 -V- 氟和 Flk1/MMP9， 使用流式细胞术分 析了细胞周期进程、 细胞凋亡、 和金属蛋白酶的蛋白质含量。可在 Fk1+ 细胞中使用 CD 表面 标记物的 FAC 扫描分析， 评估细胞分化中的移位 (shift)， 其中 Fk1+ 细胞包括 CD34、 TAL1、 CD133、 CD45、 CD14、 Tie-2、 VE- 钙粘着蛋白和 Sca1。在选择的基因当中， 我们制得了编码靶 向感兴趣基因的短干扰发夹 RNA(siRNA) 的重组病毒载体。通过 RT-QPCR 在受感染的 EC 中 验证了靶基因的充分沉默。另外使用共聚焦显微镜和流式细胞术， 在 3D EC 基质胶模型中， 测试了基因沉默对血管丛形成的影响。
已采用重组病毒载体的肌肉注射， 在急性后肢缺血的标准化小鼠模型中过表达 或沉默鼠后肢中的感兴趣基因， 其中该重组病毒载体编码选择的候选基因或它们的匹配 siRNA。在这种缺血模型中， 股动脉按 Couffinhal 等人 ( 上文 ) 描述的方法结扎， 接着通过 肌肉注射将基因转移到其中一个后肢， 而对侧的缺血性后肢用作对照。血管营养或重塑因 子的持续表达对新血管形成的影响， 通过免疫组织学定量分析 ( 用于内皮、 vsmc 和炎症标 记物、 细胞外基质合成、 缺血性肢体中毛细管 / 小动脉的数目和尺寸 )、 激光多普勒成像和 血管造影术监测。为了评估血管营养因子稳定表达的长期功能和形态学效果， 在基因转移 后的 0、 1、 4 和 8 周处死动物。使用激光多普勒衍生的流量计量法、 血管造影术 (Rentrop 评 分 ) 和传统的 ( 免疫 ) 组织学分析监测体内血管形成。
在后肢缺血模型中， 评估在循环成血管细胞中被特异性表达的血管生成调节基因 的影响， 其中该后肢缺血模型与自体外周内皮祖细胞中的回体基因转移相结合。 分离、 繁殖 单核细胞组分， 并且在自身细胞组分的静脉输注之前， 用编码选择的血管生成基因或靶向 siRNA 并具有核标记的 β- 半乳糖苷酶报告基因的病毒载体转染。 在这些动物中， 两个股动 脉都被结扎。在对照组动物中， 同样收获分离的单核细胞组分， 用单独的 FIV-ntLacZ( 以等量的 tu) 转染并转移 (donated) 该组分。使用为增殖标记物 (Ki67) 和分化标记物 (Flk1、 CD34、 PECAM、 Tie2、 结蛋白 ) 进行核染色 (nuclear staining) 和双重标记的 β- 半乳糖苷 酶， 鉴定和量化并入到新形成的血管中的分化的 EPC(7AAD-/CD45+/CD34+/Flk1+)。
由于通过我们的 DNA 微阵列和 QPCR 分析， 鉴定出 Hmox 系统为鼠胚胎血管生成期 间在成血管细胞中被特异性上调的基因系统之一， 因而我们使用编码 Hmox1/2 的重组病毒 和我们已制得的血红素加氧酶 1 敲除小鼠， 进一步研究了血红素加氧酶系统在血管生成中 的作用。血红素加氧酶 (Hmox) 是血红素生物催化作用和 CO 生产的重要调节物。CO 活化 鸟苷酸环化酶活性并因此诱导 cGMP 的产生， cGMP 的产生又促进 cGMP 依赖性激酶的活性。 Hmox 系统由相应多应力刺激的组成型表达 (Hmox2/3) 和诱导型同种型 (Hmox1) 组成。 之前 显示， Hmox1 诱导 CO 产生可调节血管紧张度 (vessel tone) 和血小板凝聚。 另外， 我们之前 的研究暗示， 通过上调 p21， Hmox1 可在体外和在体内有效抑制有丝分裂发生和遏制 G1/G0 阶段中的 vsmc， 导致长期生长停滞。因为 Hmox1 的抑制和鸟苷酸环化酶途径导致生长抑制 的逆转 (reversal)， 且 NOS 抑制未能使生长抑制正常化， 这暗示这些影响似乎不同于转向 (sheddingto)NOS/NO°系统。 我们假定 Hmox/CO 和 NOS/NO°系统在血管生成和血管修复反 应中也具有类似的， 但不同的功能。两个系统都活化可溶的鸟苷酸， 诱导 cGMP 生产和活化 PKG。尽管惊人的相似， 气态的 NO° /CO 第二信使系统也具有不同的特性。例如， Hmox1 以 组织特异性方式表达。在心肌中， NOS 不能被检测到， 而这里， Hmox 是 cGMP 生产的主要调节 物。在低氧情况下， Hmox1， 而不是 NOS 增大培养的心肌细胞 (cardiomyocytes) 和 vsmc 中 的 cGMP。我们研究产生的这些和初步结果暗示 NOS 和 Hmox 系统具有维持细胞稳态的互补 功能。据此， 体外初步研究显示， VEGF 在 EC 培养物中的有丝分裂的潜在性被 Hmox1 抑制剂 SnPPIX 减小， 而 CO 释放加强了 EC 培养物中 VEGF 的释放， 暗示 Hmox/CO 系统作用在 Flk1 受 体的下游， 并有必要固定 (mount) 通过 VEGF 引出的足够的 EC 有丝分裂反应。
与这些观测结果一致， 我们的 DNA 阵列分析确实鉴定出血红素加氧酶 (Hmox) 系统 是胚胎和缺血的血管生成中的上调基因之一。为了进一步阐明血红素加氧酶在胚胎和缺 血 ( 新 ) 血管形成中的作用， 我们制得了 Hmox1- 敲除小鼠和编码 Hmox1/2 的重组病毒和 Hmox1/2- 沉默 siRNA。与用空病毒 (sham virus) 处理相比， 在 EC 培养物中 siRNA 致使的 Hmox1 沉默， 使得对 FGF/VEGF 刺激的反应变小。我们推断出血红素加氧酶系统提供了允许 内皮细胞静止的可替换的细胞保护系统和在缺血和代偿性新血管形成期间的细胞保护特 性。
Hmox 系统的作用的最初研究是通过在慢病毒基因转移之后， 在 Hmox1 或 2- 过表 达的 3D 基质胶原代培养物和 HMO1 或 2- 沉默的 EC 中分析毛细管样结构的体外形成而进行 的。如描述的， 使用共聚焦显微术和形态测定法， 分析血管芽 (vascular sprout)。
在与野生型同窝出生动物相比， 在 Hmox1- 无效 ( 败合， nullizygous) 小鼠的缺血 性腿模型中， 测试 Hmox1 缺失对血管生成的体内意义。如前面描述的， 在结扎之后的 0、 1、 2 和 3 周， 通过激光多普勒血流成像 (flow imaging)、 血管造影术和定量组织学分析监测血 管形成。
在从 Hmox- 缺陷供体到野生型同窝出生动物中的骨髓移植之后， 使用急性后肢缺 血模型， 研究了成熟的血管生成中 Hmox 的具体要求。辐射野生型 C57B16 小鼠， 从而使其骨 髓衰竭， 接着进行骨髓细胞的静脉灌注， 该细胞是从 Hmox1-/- 野生型同窝出生动物中收获的。对照动物接受来自 Hmox1+/+ 野生型同窝出生动物的骨髓。用 3 周让动物恢复并结扎 其双侧股动脉。使用激光多普勒血流成像、 血管造影术和共聚焦显微术 ( 包括 Hmox1- 免疫 染色 )， 测试新血管发生。 这个研究阐明了在循环成血管细胞中 Hmox1 表达对血管生成反应 的相对贡献。
鉴定的血管生成基因的预测价值的表达， 可通过在心血管患者的不同亚群中使用 微阵列分析进一步验证， 并与患者结果和表型相关。 使用全基因组微阵列分析， 我们正在验 证血管生成基因和基因产物在不同患者组中的表达， 并交叉相关于传统的缺血测量和肌坏 死检测， 并使 DNA/RNA/ 蛋白质谱与疾病结果和预后相关。患者群包括但不限于， 稳定型心 绞痛患者、 不稳定型心绞痛患者、 急性冠状动脉综合征患者、 经受短暂性缺血性脑血管事件 (TIA/CVA) 的患者、 外周血管疾病患者和顽固性心绞痛患者。这些基因的表达谱与以下相 关 ( 但不限于 ) ： 诊断、 缺血的其他具体化指示物 ( 细胞核灌注成像、 肌坏死标记物 (TropT、 CKMB)、 血管造影术分析 )、 复发 - 事件 (re-event) 的发生、 心绞痛的进展和启动药物治疗的 功效。使用 DNA 微阵列分析， 正在分析 1000 例心血管患者， 该 DNA 微阵列分析包括我们新 鉴定出的血管生成候选基因 ( 涉及缺血驱动的 EPC 活化、 新血管形成， 和血管修复 )， 但也包 括之前显示涉及新血管形成的基因 ( 作为阳性对照 )。
这些研究试图， 通过全基因组分析在胚胎和缺血相关的血管形成期间的候选调节 基因， 描绘血管生成的基因调节。 使用小鼠发育中内源表达模式的分析评估了候选基因， 并 使用与斑马鱼发育中、 成年小鼠缺血模型和人 CAD 疾病中的表达的交叉相关， 进一步探究 和选择了候选基因。小鼠、 斑马鱼和人基因组学的结合提供了高效 ( 选择 ) 策略， 从而为之 前在小鼠和斑马鱼发育期间鉴定的进化保守基因获得鱼和小鼠中的功能敲低数据。 斑马鱼 发育期间血管形成的体内转基因分析和体外 3D 基质胶分析进一步将候选基因的选择缩小 到 64 个候选基因， 通过病毒载体介导的基因转移分析， 在缺血的血管生成的鼠模型中进一 步深入探究了这 64 个基因。 选择的克隆尤其包含血红素加氧酶家族。 使用 Hmox1- 敲除小鼠 和骨髓移植， 用 Hmox 家族成员的过表达或沉默在体外研究和在新血管形成的小鼠模型中 在体内研究， 作为鉴定的调节基因家族的一员的血红素加氧酶的作用。通过在心血管患者 中利用 QPCR 和微阵列分析的另外表达谱分析， 进一步验证血管生成和动脉修复中的这些 调节基因与这些患者的进展和预后之间的关系。之前的这些研究提供了对血管生成 ( 和动 脉修复 ) 分子机制的洞察， 并可构成心血管缺血性疾病的有吸引力的新型分子治疗策略。
实施例 3
在人和实验动物模型中对本发明多个方面引用的基因的验证
本发明涉及用于诊断和预后心血管疾病的组合物和方法， 该诊断和预后是通过评 价选择的血管生成 / 血管发生基因进行的， 如之前通过微阵列分析所鉴定的基因。特别地， 本发明包括使用血液循环内皮祖细胞的特异性基因表达谱来诊断心血管疾病和预测临床 结果。在人组和在心血管疾病的实验动物模型中评估和验证了用于该途径的方法的可行 性。
实施例 3.1
本发明多个方面中的基因在缺血性猪模型中的血液单核细胞组分中表达的验证。
目的 (1) ： 为了测试本申请中引用的基因是否确实在健康和缺血后动物中的血液 单核细胞组分和内皮祖细胞中被表达。目的 (2) ： 为了测试源自血液的单核细胞组分内皮细胞组分是否可用于候选基因 的基因谱分析。
目的 (3) ： 为了评估缺血是否诱导本发明多个方面引用的基因表达谱的改变。
材料和方法 ： 在心血管患者中， 冠脉血管闭塞可引起心脏中局部低氧 ( 缺血 ) 状 态， 该状态随后导致心脏组织损伤和心脏功能缺损。尽管缺血可引起心脏病真正发作， 但 早期缺血状态可以是静止的 ( 休眠的 )， 所以避开了通过传统诊断方法的检测。在此， 我们 在良好验证的猪模型中模拟了缺血的早发。在总共 6 只猪中， 通过在其中一个主冠状动脉 (LAD) 中用直径为 3mm 的气囊导管充气 6 分钟， 诱导轻度缺血阶段。 动物通过在该步骤期间 吸入异氟烷 / 氧气被麻醉， 然后让动物恢复。在该步骤之前和在该步骤之后 24 小时， 收集 25mL 静脉血 (venal blood) 并立即处理。 通过聚蔗糖梯度法 (Ficoll gradient) 分离单核 组分。简言之， 移取血液样本置入加在 50mL Falcon 管中的 12， 5mL Ficoll-Paque 上部， 在 2000rpm 下离心， 从而分离单核细胞带。通过移液收集单核组分， 在加入 2mL ACK 裂解缓冲 液以裂解剩余的红细胞之前用冰冷的 PBS 洗涤该细胞两次。在室温下孵育 2 分钟后， 用冰 冷的 PBS 洗涤该细胞两次， 并用 RLT 裂解缓冲液 (Qiagen) 处理该颗粒， 用以提取 RNA。使用 流式细胞术细胞分选， 采用 7AAD/CD45/CD34/flk1 选择， 选取内皮祖细胞。用可商购的 RNA 提取试剂盒 (Qiagen) 进行 RNA 提取。使用 Invitrogen 逆转录试剂盒， 遵照制造商的用法 说明， 采用随机六聚体 (Invitrogen) 逆转录该 RNA。我们使用定量 (Q)PCR 技术， 分析本发 明多个方面引用的基因的基因表达。简言之， 使用 3 引物 (3primer) 软件， 设计本发明多个 方面引用的基因引物， 并使用 Biorad cybergreen 检测混合物 (Biorad)， 遵照制造商方案， 进行 QPCR。通过 MyiQ 实时 PCR 检测系统 (Biorad) 通过 cybergreen 检测， 测量 QPCR 样本， 并使用附带的 Biorad 软件随后分析数据。表达水平校正为看家基因 β- 肌动蛋白的表达。
目标 1 和 2 结果 ：
从源自血液样本的单核组分中分离足够量的总 RNA 是可行的 ： 平均， ＞ 10 微克的 总 RNA 可从 25mL 全血中获得。我们测试了以下基因的表达 ： Adora2a、 Agtrl1、 ets1、 Dll4、 Lgmn、 Rin3、 Thsd1、 Cngl1 和 Elk3。Adora2a、 Agtrl1、 ets1、 Dll4、 Lgmn、 Rin3、 Thsd1、 Cngl1 和 Elk3 都可在缺血诱导之前和之后在血液单核细胞组分中检测到。QPCR 分析示出这些基 因的平均循环阈值 (thresholdcycle) ＜ 30， 表明这些基因在血液单核细胞中被高度表达。
目标 1 和 2 结论 ： 从来自 25mL 血液的单核细胞组分中分离足够量的 RNA 是可行 的。另外， Adora2a、 Agtrl1、 ets1、 Dll4、 Lgmn、 Rin3、 Thsd1、 Cngl1 和 Elk3 在健康和缺血后 组的血液单核细胞组分中可检测到。
目标 3 结果 ： 缺 血 事 件 24 小 时 之 后 我 们 观 测 到 以 下 基 因 表 达 的 显 著 上 调 ： Adora2a( 缺血后和缺血前分别为 +214±13％与 +31±10％ )、 Agtrl1( 缺血后和缺血前分 别为 +301±11％与 +14±9％ )、 Dll4( 缺血后和缺血前分别为 +152±16％与 +21±5％ )、 Lgmn( 缺血后和缺血前分别为 +411±31 ％与 +14±16 ％ )、 Rin3( 缺血后和缺血前分别 为 +143±25 ％与 +6±10 ％ )、 Thsd1( 缺血后和缺血前分别为 +156±5 ％与 +24±7 ％ )、 Cngl1( 缺血后和缺血前分别为 +199±9％与 +17±14％ ) 和 Elk3( 缺血后和缺血前分别为 +205±12 ％与 +1±3 ％ )， 而 ets1( 缺血后和缺血前分别为 +15±23 ％与 +14±9 ％ ) 表达 没有被显著影响。GAPDH 看家基因作为对照被包括。这个基因的表达水平没有被显著影响 ( 缺血后和缺血前分别为 +2±12％与 +1±30％ )。目标 3 结论 ： Adora2a、 Agtrl1、 Dll4、 Lgmn、 Rin3、 Thsd1、 Cngl1 和 Elk3 的表达水 平是用于检测轻微缺血的高度灵敏的生物标记物。
实施例 3.2
本发明多个方面引用的基因在健康动物和心肌患者的血液单核细胞组分中的表 达的验证。
目标 (1) ： 为了测试本发明多个方面引用的基因是否确实在健康对象和急性的心 肌梗塞患者中的血液单核细胞组分中被表达。
目标 (2) ： 为了测试源自血液的单核细胞组分是否可用于候选基因的基因谱分 析。
材料和方法 ：
共 6 位患者进入心血管疾病或进行性缺血的临床症状。年龄在 24 和 60 之间随机 选择的 6 位健康自愿者作为对照被包括。收集 50ml 静脉血并立即处理。通过聚蔗糖梯度 法 (Ficoll gradient) 分离单核组分。 简言之， 移取血液样本置入加在 50mL Falcon 管中的 12， 5mL Ficoll-Paque 上部， 在 2000rpm 下离心， 从而分离单核细胞带。通过移液收集单核 组分带， 在加入 2mL ACK 裂解缓冲液以裂解剩余的红细胞之前用冰冷的 PBS 洗涤该细胞两 次。在室温下孵育 2 分钟后， 用冰冷的 PBS 洗涤该细胞两次， 并用 RLT 裂解缓冲液 (Qiagen) 处理该颗粒， 用以提取 RNA。采用 7AAD/CD45+/CD34+/KDR+ 的免疫标记， 通过流式细胞术细 胞分选， 从单核细胞组分选取 EPC。用可商购的 RNA 提取试剂盒 (Qiagen) 进行 RNA 提取。 使用 Invitrogen 逆转录试剂盒， 遵照制造商的用法说明， 采用随机六聚体 (Invitrogen) 逆 转录该 RNA。我们使用定量 (Q)PCR 技术， 分析本发明多个方面引用的基因的基因表达。简 言之， 使用 3 引物 (3primer) 软件， 设计本发明多个方面引用的基因引物， 并使用 Biorad cybergreen 检测混合物 (Biorad)， 遵照制造商方案， 进行 QPCR。使用 MyiQ 实时 PCR 检测系 统 (Biorad) 通过 cybergreen 检测， 测量 QPCR 样本， 并使用附带的 Biorad 软件随后分析数 据。表达水平校正为看家基因 β- 肌动蛋白的表达。
目标 1 和 2 的结果 ： 从源自血液样本的单核组分和内皮祖细胞中分离足够量的总 RNA 是可行的 ： 平均， ＞ 15 微克的来自 PBMC 的总 RNA 可从 50mL 全血中获得。对于将来的微 阵列分析， 仅需要 1 微克。33 个基因被测试 ( 包括 ： Sox7、 Sox18、 Adora2A、 Lama4、 Lamb1-1、 Crip2、 Rock2、 Rin3、 Cgnl1、 Fgd5、 Elk3、 Agtrl1、 Apelin、 KDR、 Ets2、 NRP1、 NRP2、 Notch4、 DLL4、 Eelk3、 Erg1、 Stab1、 Stab2、 Grrp1、 Thsd1、 HO-1、 (Hmox1)、 HO-2(Hmox2)、 Lgmn、 Exoc3L、 HO-2、 PLVAP、 Xlkd1、 TNFα 诱导蛋白 8(TNFaip8)) 并显示表达， 但 Rin3、 PVLAP、 Crip2、 Lgmn、 NRP2、 NRP1、 Notch1、 Notch4、 Sox7、 TNFaIP8L1、 Elk3 和 Sox18 在健康的人对象和急性心肌 梗塞患者中的单核细胞组分中都显示高度表达的水平。
目标 1 和 2 的结论 ： 从来自 50mL 血液的单核细胞组分中分离足够量的 RNA 是可 行的， 其中该 RNA 用于 QPCR 和将来的微阵列分析。另外， Sox7、 Sox18、 Adora2A、 Lama4、 Lamb1-1、 Crip2、 Rock2、 Rin3、 Cgnl1、 Fgd5、 Elk3、 Agtrl1、 Apelin、 KDR、 Ets2、 NRP1、 NRP2、 Notch4、 DLL4、 Eelk3、 Erg1、 Stab1、 Stab2、 Grrp1、 Thsd1、 HO-1、 (Hmox1)、 HO-2(Hmox2)、 Lgmn、 Exoc3L、 HO-2、 PLVAP、 Xlkd1、 TNF α- 诱导蛋白 8(TNF aip8) 升高的表达水平可在急性心肌 梗塞患者中检测到。
实施例 3.3在本发明多个方面中引用的基因中的两个 (Agtrl1 和 apelin) 在缺血和心肌梗塞 的良好验证的鼠模型中的验证。
一个基因的实施例 ：
文献研究鉴定出 Agtrl1 是配体 apelin 的细胞膜受体。这里我们评估 ：
目标 (1) ： 在健康动物中小鼠的循环内皮祖细胞的细胞膜上 Agtrl1 的表达水平和 对实验诱导的缺血和心肌梗塞的反应。
材料和方法 ： 小鼠缺血是通过股动脉的永久结扎诱导的， 该永久结扎导致后肢肌 肉随后处于低氧状态。小鼠心肌梗塞是通过其中一个主冠状动脉的永久闭塞诱导的， 该永 久闭塞导致心肌梗塞。简言之， c57bl/6 小鼠通过吸入异氟烷 / 氧气麻醉。解剖股动脉并 进行结扎， 以诱导后肢缺血， 或者打开胸腔， 解剖 LAD 并进行结扎， 以诱导心肌梗塞。关闭后 肢组织或胸腔， 使动物恢复。在 4 天后处死动物。从未经治疗的对照动物， 和经受后肢缺血 或心肌梗塞的动物收集 1mL 血液样本。通过聚蔗糖梯度法分离单核组分。简言之， 移取血 液样本置入加在 50mL Falcon 管中的 12,5mL Ficoll-Paque 上部， 在 2000rpm 下离心， 从而 分离单核细胞带。通过移液收集单核组分带， 在加入 2mL ACK 裂解缓冲液以裂解剩余的红 细胞之前用冰冷的 PBS 洗涤该细胞两次。在室温下孵育 2 分钟后， 用冰冷的 PBS 洗涤该细 胞两次。使用针对 Agtrl1(Abcam) 的兔多克隆抗体， 和针对 c-kit 和 Flk1 的大鼠单克隆抗 体 ( 分别直接用 FITC 和 APC 标记 )， 在 200 微升的 FACs 缓冲液中， 在室温下使细胞染色 20 分钟。然后在用针对兔 IgG 的第二抗体孵育之前用冰冷的 FACS 缓冲液洗涤两次， 接着用冰 冷的 FAC 缓冲液洗涤两次。在通过流式细胞术在 FACSCanto 流式细胞计数器 (BD) 上进行 分析之前， 使颗粒再悬浮在 500 微升的 FAC 缓冲液中， 接着使用附带的软件进行分析。使用 特异性细胞膜标记物 c-kit+/Sca1+ 和 Flk1 鉴定内皮祖细胞， 并通过流式细胞术测量在这 些内皮祖细胞的细胞膜上 Agrtl1 蛋白质的表达。
目标 1 的结果 ： 相比于不相关的白细胞， Agrtl1 在内皮祖细胞 (c-kit/Flk1+) 的 特异性亚群上被高度表达 ( 分别为 4530±312 与 1211±141)。循环 Agrtl1- 高 c-kit/ Flk1+ 细胞的数目增大， 以响应心肌梗塞 ( 在健康组与心肌组中分别为， 总的细胞群体的 1,5±0,11％与总的细胞群体的 4,1±0,31％ )， 但没有响应后肢缺血 ( 在健康组与心肌组 分别为， 总的细胞群体 1,5±0,11％与总的细胞群体 1,7±0,44％ )。
目标 1 的结论 ： Agrtl1 在内皮祖细胞的细胞膜上是可检测到的。特别地， Agrtl1 在 c-kit/Flk1 祖细胞亚群 (subpopulation) 的细胞膜上被高度表达。心肌梗塞可募集 Agrtl1- 高 c-kit/Flk1 祖细胞到血液循环中。 因此， 这些结果证明 Agrtl1 是心肌梗塞的高 效诊断和预后标记物。
可对剩余基因进行相同类型的动物研究， 该剩余基因涉及发育中的血管生成 过程， 并在发育和缺血驱动的血管生成反应的血管生成过程中被上调， 这些基因包括 ： Sox7、 Sox18、 Adora2A、 Lama4、 Lamb1-1、 Crip2、 Rock2、 Rin3、 Cgnl1、 Fgd5、 Elk3、 Agtrl1、 Apelin、 KDR、 Ets2、 NRP1、 NRP2、 Notch4、 DLL4、 Eelk3、 Erg1、 Stab1、 Stab2、 Grrp1、 Thsd1、 HO-1(Hmox1)、 HO-2(Hmox2)、 Lgmn、 Exoc3L、 HO-2、 PLVAP、 Xlkd 1、 TNFα- 诱 导 蛋 白 8(TNFaip8) 和 TNFaip8l1。候选基因涉及血管生成途径的各个方面， 包括成血管细胞迁移、 血管透化 ( 血管渗透 )、 EPC 趋化性和 EPC 存活和分化， 包括动 - 静脉 (ateriovenous) 分化。 它们似乎都涉及发育和成年的血管生成反应。当前， 尤其对 FGD5、 TNFaIP8L1、 rin3、 Thsd1、stab1、 stab2、 sox7、 sox18、 GGRP、 Agtrl/apelin、 Hmox1/2 和 PLVAP 在各种动物模型和人患 者中进行了广泛研究。41