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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410355286.5 (22)申请日 2014.07.24 C12P 7/06(2006.01) C12P 19/14(2006.01) (71)申请人 潘崇良 地址 中国台湾基隆市 (72)发明人 潘崇良 吴天池 吴富宏 吴绍祺 林枝扬 李樵 苏明璁 吴奕霈 (74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理 有限责任公司 11139 代理人 孙皓晨 马鑫 (54) 发明名称 一种制备生质乙醇的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种制备生质乙醇的方法， 其 是通过以龙须菜的酵素水解液作为碳源供酵母菌 进行发酵而进行。 (51)Int。
2、.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 附图1页 CN 105296542 A 2016.02.03 CN 105296542 A 1/1 页 2 1. 一种制备生质乙醇的方法， 其包括 ： (a) 将海洋菌株培养在含有龙须菜成分的细菌培养液中， 使该海洋菌株受诱导产生 糖分解酶， 然后将所获得的含有该糖分解酶的海洋菌株培养物予以分离， 去除菌体， 以 获得含有该糖分解酶的粗酵素液， 其中该海洋菌株是选自泡囊假单胞菌 (Pseudomonas vesicularis)、 杀鲑产气单胞菌 (Aeromonas salmonicida) 及。
3、其组合所组成的群组 ； (b) 以热及酸处理龙须菜， 进行第一水解反应， 获得龙须菜热酸水解液 ； (c) 在步骤 (b) 的龙须菜热酸水解液中， 加入步骤 (a) 所得的粗酵素液， 进行第二水解 反应， 以产生龙须菜寡单糖水解液 ； 以及 (d) 将酵母菌接种在步骤 (c) 所得的龙须菜寡单糖水解液， 进行发酵， 以获得含有生质 乙醇的发酵液。 2.如权利要求1所述的方法， 其中在步骤(a)中， 该海洋菌株受诱导产生的糖分解酶包 含洋菜酶。 3.如权利要求1所述的方法， 其中在步骤(a)中， 该海洋菌株受诱导产生的糖分解酶包 含洋菜酶及淀粉酶。 4.如权利要求1所述的方法， 其中在步骤(a)。
4、中， 该海洋菌株受诱导产生的糖分解酶不 包含纤维素酶、 卡拉胶酶或木糖酶。 5. 如权利要求 1 所述的方法， 其中步骤 (a) 使用的细菌培养液包含脱脂大豆粉或酵母 萃取物作为氮源。 6. 如权利要求 1 所述的方法， 其中在步骤 (b) 中， 龙须菜是在 100至 150之间的温 度以 0.1 至 1.0N 的酸处理， 达 10 分钟以上。 7.如权利要求1所述的方法， 其中在步骤(b)中， 龙须菜的热酸处理是重复二次或二次 以上。 8.如权利要求1所述的方法， 其中步骤(c)中， 可进一步加入纤维素酶进行第二水解反 应。 9. 如权利要求 1 所述的方法， 其中步骤 (d) 使用的酵母菌。
5、是选自食品工业发展研究所 的寄存编号为 BCRC 21550、 BCRC 21685 及 BCRC 21686 的菌株及其组合所组成的群组。 10. 如权利要求 1 所述的方法， 其中在步骤 (d) 中， 酵母菌的添加量为每 100ml 发酵总 体积约 2x106-1.5x107个酵母菌。 权 利 要 求 书 CN 105296542 A 2 1/9 页 3 一种制备生质乙醇的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种制备生质乙醇的方法。具体而言， 本发明是提供一种利用龙须菜 的酵素水解液作为碳源供酵母菌发酵以生产生质乙醇的方法。 背景技术 0002 目前石化燃料的主要可再生替代能源包括太阳能、。
6、 风能与生质能等， 其中太阳能 转换效率不高、 风能须在风大的地区才有较佳利用率， 由于植物中的淀粉或纤维素可透过 化学制程或酵素制程使受质水解生成简单糖类， 进而用微生物发酵产生以乙醇为主要成分 的生质乙醇 (bioethanol)， 因此生质乙醇成为现今全球积极开发替代能源之一， 且年产量 全球生质燃料的 90以上。 0003 用在制造生质乙醇的原料包括糖质原料、 淀粉质原料和纤维质原料。糖质原料如 甘蔗汁与葡萄汁等虽可以直接用微生物发酵生产乙醇， 但是会影响到人类的食物供应与相 关产品价格。其中， 淀粉质原料须先经前处理步骤使淀粉释放， 并须经液化、 糖化步骤才分 解成可发酵的单糖 ； 。
7、纤维质原料多半是农业废弃物， 其中所含的纤维素是长链状的高分子 结构， 因此制程上须先经化学或物理方法处理， 诸如， 破坏植物细胞壁并把半纤维素降解为 五碳糖， 再以适当的酵素水解把纤维素降解成六碳糖， 再经发酵才能转化成乙醇。然而， 以 农作物做为生质乙醇的来源会造成粮食短缺以及需要使用更多的可耕农地和淡水资源的 问题， 且经化学或物理处理不但成本提高， 也会有环保上的疑虑。 0004 基于藻类仅含有少量的纤维素， 且以藻类提炼生质能源并不与民争食， 不占用陆 地面积， 因此现有技术已提出以藻类萃取提炼生质柴油的方法。 其中， 若以绿藻或小球藻等 微藻做为料源， 尚需经破除细胞壁等步骤， 且。
8、所得的碳链不高， 故仅可用以制备生质柴油。 另一方面， 可使用石莼、 马尾藻、 或龙须菜等大型藻类， 经水解为简单糖类后， 供酵母菌利用 进行发酵， 即可获得生质乙醇。目前大型藻类的水解技术包括以热酸处理或进一步外加酵 素的方式进行， 然而， 单独热酸处理的水解效果有限， 产生的寡单糖量不足， 而外加酵素则 需挑选适当的酵素种类组合且有反应时间较长及成本较高的问题。 0005 因此， 仍有需要提供一种制备生质乙醇的方法， 特别是以大型藻类为料源且具提 高的生质乙醇产率的方法。 发明内容 0006 本发明非可预期地发现， 以含有龙须菜成分的细菌培养液培养海洋菌株， 即泡囊 假单胞菌(Pseudo。
9、monas vesicularis)及/或杀鲑产气单胞菌(Aeromonas salmonicida)， 可诱导该等海洋菌株的糖分解酶， 尤其是洋菜酶， 其可用在提高龙须菜的水解效率， 进而提 升以龙须菜的水解液作为碳源供酵母菌发酵以产制生质乙醇的产率。 0007 因此， 本发明提供一种制备生质乙醇的方法， 其包括 ： 0008 (a) 将海洋菌株培养在含有龙须菜成分的细菌培养液， 使该海洋菌株受诱导产 生糖分解酶， 然后将所获得的含有该糖分解酶的海洋菌株培养物予以分离， 去除菌体， 以 说 明 书 CN 105296542 A 3 2/9 页 4 获得含有该糖分解酶的粗酵素液， 其中该海洋菌。
10、株是选自泡囊假单胞菌 (Pseudomonas vesicularis)、 杀鲑产气单胞菌 (Aeromonas salmonicida) 及其组合所组成的群组 ； 0009 (b) 以热及酸处理龙须菜， 进行第一水解反应， 获得龙须菜热酸水解液 ； 0010 (c) 在步骤 (b) 的龙须菜热酸水解液中， 加入步骤 (a) 所得的粗酵素液， 进行第二 水解反应， 以产生龙须菜寡单糖水解液 ； 以及 0011 (d) 将酵母菌接种在步骤 (c) 所得的龙须菜寡单糖水解液， 进行发酵， 以获得含有 生质乙醇的发酵液。 0012 特定而言， 在步骤 (a) 中， 该海洋菌株受诱导产生的糖分解酶包含。
11、洋菜酶， 或进一 步包括淀粉酶。在具体实例中， 该海洋菌株受诱导产生的糖分解酶不包含纤维素酶或卡拉 胶酶。 0013 在部分具体实例中， 在步骤 (b) 中， 龙须菜的热酸处理是重复二次或二次以上。 0014 在部分具体实例中， 在步骤 (c) 中， 可进一步加入纤维素酶进行第二水解反应。 0015 在部分具体实例中， 步骤 (d) 使用的酵母菌是选自食品工业发展研究所的寄存编 号为 BCRC 21550、 BCRC 21685 及 BCRC 21686 的菌株及其组合所组成的群组。 0016 本发明的一个或多个具体实施例的细节示于下面的描述。 本发明的其它特征或优 点， 从以下一些具体实施例。
12、的详细描述以及后面的申请专利范围当中将更为清楚明确。 附图说明 0017 结合附图阅读能帮助了解前面的发明内容以及接下来的本发明详细描述。 在此所 所呈现的较佳图式及具体实施例是以阐述本发明为目的。应理解的是， 本发明并不局限在 所示的精确排列及方式。 0018 图 1 是根据本发明的具体实例所进行的各个龙须菜水解样本及酵母菌发酵液的 薄层色层分析检测结果。各栏样本如下 ： 第 1 栏为乳糖 (lactose) 对照组 ； 第 2 栏为半 乳糖 (galactose) 对照组 ； 第 3 栏为经热酸处理所得的龙须菜热酸水解液 ； 第 4-6 栏为 第 3 栏的龙须菜热酸水解液加入粗酵素液反应后。
13、的混合液， 其中该粗酵素液是由泡囊假单 胞菌及杀鲑产气单胞菌培养在含有龙须菜成分的细菌培养液， 使其受诱导产生糖分解酶 并经分离去除菌体而获得含有该糖分解酶的上清液， 其中该细菌培养液分别是以黄豆渣 (okara-enriched， 第 4 栏 )、 脱脂黄豆粉 (soybean meal-enriched， 第 5 栏 ) 及酵母萃取 物 (yeast extract-enriched， 第 6 栏 ) 为氮源 ； 第 7-9 栏为将 12 (v/v) 酵母菌株 BCRC 21812 分别接种在第 4-6 栏的混合液进行发酵 24 小时所得的发酵液 ； 以及第 10-12 栏为将 12 (v。
14、/v) 酵母菌株 BCRC 21812 分别接种在含有第 4-6 栏的混合液的酵母菌培养液中进 行发酵 48 小时所得的发酵液。 0019 图2是使用气相层析仪(gas chromatography， GC)针对不同发酵时间所获得的生 质乙醇发酵液， 分析其所含的乙醇浓度。 具体实施方式 0020 除非另有指明， 所有在此处使用的技术性和科学性术语具有如同本发明所属技艺 中的通常技术者一般所了解的意义。 0021 本文所使用的 “一” 字， 如未特别指明， 是指至少一个 ( 一个或一个以上 ) 的数量。 说 明 书 CN 105296542 A 4 3/9 页 5 0022 本发明是提供一种利。
15、用龙须菜的酵素水解液作为碳源供酵母菌发酵以生产生质 乙醇的方法。具体而言， 本发明的方法包括 ： 0023 (a) 将海洋菌株培养在含有龙须菜成分的细菌培养液， 使该海洋菌株受诱导产 生糖分解酶， 然后将所获得的含有该糖分解酶的海洋菌株培养物予以分离， 去除菌体， 以 获得含有该糖分解酶的粗酵素液， 其中该海洋菌株是选自泡囊假单胞菌 (Pseudomonas vesicularis)、 杀鲑产气单胞菌 (Aeromonas salmonicida) 及其组合所组成的群组 ； 0024 (b) 以热及酸处理龙须菜， 进行第一水解反应， 获得龙须菜热酸水解液 ； 0025 (c) 在步骤 (b) 。
16、的龙须菜热酸水解液中， 加入步骤 (a) 所得的粗酵素液， 进行第二 水解反应， 以产生龙须菜寡单糖水解液 ； 以及 0026 (d) 将酵母菌接种在步骤 (c) 所得的龙须菜寡单糖水解液， 进行发酵， 以获得含有 生质乙醇的发酵液。 0027 本文所述泡囊假单胞菌及杀鲑产气单胞菌是常见的水产动物感染性细菌， 可以常 规方式分离自河口、 海水沿岸等环境， 亦可自陆上淡水、 废水、 土壤等其他环境中分离之， 并 可利用洋菜培养基进一步筛选出具较佳分解洋菜能力的菌株。 0028 本文所述 “龙须菜” 是指龙须菜属 (Gracilaria) 的藻类， 是台湾沿海主要养殖海 藻， 容易取得， 富含多糖。
17、， 人工养殖技术成熟， 可量产， 价格便宜， 常用在提炼洋菜胶。 常见种 类包括但不限于， 细基江蓠 (G.tenuistipitata)、 菊花龙须菜 (G.coforvoides)、 大茎龙须 菜(G.gigas)、 弓龙须菜(G.arcuata)、 缢龙须菜(G.salicornia)、 绳龙须菜(G.chorda)、 及 粗龙须菜 (G.fi rma)。 0029 本文所述 “细菌培养液” 是指一般用在培养海洋细菌的培养液， 例如， 海洋液体培 养基 (Marine Broth， MB)， 或人工海水， 可视需要调整或添加氮源， 如， 以脱脂大豆粉或酵母 萃取物作为氮源添加。 0030。
18、 根据本发明的方法， 在步骤 (a) 中， 将泡囊假单胞菌或杀鲑产气单胞菌或其组合 培养在含有龙须菜成分的细菌培养液， 使其受诱导产生糖分解酶。 在一具体实施例中， 添加 在细菌培养液的龙须菜成分可为干燥龙须菜， 例如， 龙须菜洗净后予以风干或日光晒至干 燥， 或置于烘箱 ( 例如， 60 ) 中干燥， 较佳可进一步切成适当大小或研磨成细粉， 例如， 低 于40目的大小， 以方便操作。 干燥龙须菜添加在细菌培养液的量可为0.1-1.0(w/v)。 在 另一具体实施例中， 添加在细菌培养液的龙须菜成分可为经水解处理产生寡糖或单糖成分 的龙须菜水解样本， 例如， 经热酸处理的龙须菜热酸水解液， 或。
19、再进一步以外加酵素 ( 如， 纤维素酶 ) 处理的龙须菜水解液。龙须菜成分在加入至细菌培养液前可依常规方法予以灭 菌处理或在加入细菌培养液后再一起进行灭菌处理 ( 例如， 121， 20 分钟 )。 0031 依据本发明的方法， 将海洋细菌培养在含有龙须菜成分的细菌培养液， 使其受诱 导产生糖分解酶。具体培养条件可为 23-27培养 1-3 天。 0032 根据本发明的方法， 步骤 (a) 所得的细菌培养液接着予以分离， 去除菌体， 以获得 含有海洋细菌受诱导产生的糖分解酶的粗酵素液。 此处所述的细菌培养物的分离可使用一 般分离方法， 例如， 过滤或离心， 以去除菌体， 获得含有海洋细菌受诱导。
20、产生的糖分解酶的 粗酵素液。步骤 (a) 所得粗酵素液可进一步经酵素活性分析确认含有诱导产生的糖分解 酶， 常用的酵素活性分析方法包括 3， 5- 二硝基水杨酸 (DNS) 呈色分析。经酵素活性分析， 根据本发明的方法的步骤 (a) 所得的粗酵素液含有适合分解龙须菜多糖的分解酶， 其至少 说 明 书 CN 105296542 A 5 4/9 页 6 包含洋菜酶(酵素活性可达0.3-4.0U/mL， 较佳为0.5-4.0U/mL， 更佳为1.0-4.0U/mL)， 或进 一步包含淀粉酶(酵素活性可达0.3-6.5U/mL， 较佳为1.0-6.5U/mL， 更佳为1.5-6.5U/mL)， 但不包。
21、含纤维素酶、 卡拉胶酶或木糖酶， 或活性很低 ( 例如， 酵素活性低于 0.3U/mL)。 0033 根据本发明的方法， 在步骤 (b) 中， 龙须菜经热及酸处理， 进行第一水解反应， 以 获得龙须菜热酸水解液。 本文所述 “以热及酸处理龙须菜” 或 “龙须菜经热酸处理” 或类似用 语是指使龙须菜经酸及热处理， 萃取出多糖成分， 并发生初步水解反应产生寡糖或单糖。 具 体而言， 在第一水解反应中， 热处理可为 100-150， 较佳为 100-121， 以及酸处理可使用 甲酸、 乙酸、 磷酸、 盐酸、 硫酸等酸类进行， 最常使用的是盐酸或硫酸， 浓度为 0.1-1.0N( 当 量 )， 较佳为。
22、 0.2-0.5N。在一具体实施例中， 第一水解反应的热酸处理可达 10 分钟以上， 例 如， 20-40 分钟， 可视需要重复多次， 例如， 3-5 次， 以达较佳水解效果。 0034 根据本发明的方法， 步骤 (c) 是将步骤 (a) 所得的粗酵素液， 加入步骤 (b) 的龙 须菜热酸水解液， 进行第二水解反应， 产生更多的寡糖或单糖， 获得龙须菜寡单糖水解液。 具体而言， 在第二水解反应中， 来自步骤 (a) 的粗酵素液的添加量约基于反应总体积的 5-15 (v/v)， 反应时间可为 1-3 天， 反应温度可为 23-27。在部分具体实施例中， 在步骤 (c) 中， 可进一步外加糖分解酶。
23、以进行第二水解反应， 例如， 纤维素酶， 以达较佳水解反应。 在一具体实例中， 纤维素酶的添加量约 500-1,000U/100mL， 反应时间可为 1-3 天， 反应温度 约 37。 0035 根据本发明的方法， 步骤 (d) 是将酵母菌接种在步骤 (c) 所得的龙须菜寡单糖水 解液， 进行发酵， 以获得含有生质乙醇的发酵液。具体而言， 酵母菌发酵的温度约 23至 27之间， 发酵时间可视需要调整， 至少1天以上， 例如， 1-7天。 在部分具体实例中， 酵母菌 发酵是在 23至 27之间进行 5 天。在部分具体实例中， 步骤 (d) 使用的酵母菌是选自台 湾新竹食品工业发展研究所的寄存编号。
24、为 BCRC 21550、 BCRC 21685 及 BCRC 21686 的菌株 及其组合所组成的群组， 该等菌株可有效利用半乳糖、 葡萄糖为碳源， 在本发明的方法中产 制生质乙醇的效率较高。 0036 在部分具体实施例中， 在步骤 (d) 中， 酵母菌的添加量为基于发酵总体积的 2 至 15 (v/v)， 较佳为 10-15 (v/v)。此处所述的酵母菌的添加量是指将酵母菌的菌量培养 至波长 600nm 下达吸光值 1.0， 也就是约每毫升培养液含有 106个酵母菌， 然后在此酵母菌 菌液中取出 2-15ml， 较佳为 10-15ml， 离心后去除上清液， 取得沉淀菌体， 将菌体再悬浮后，。
25、 加入步骤 (c) 的龙须菜寡单糖水解液 (100ml) 进行发酵。换言之， 步骤 (d) 加入的酵母菌 的含量为每 100ml 发酵总体积约 2x106-1.5x107个酵母菌， 较佳为 1.0 x107-1.5x107个酵母 菌。 0037 在部分具体实施例中， 步骤 (d) 可以批次或批式培养 (Batch culture)、 连续式培 养 (Continuous culture) 或半连续式 - 馈料式培养 (Semi-continuous culture) 进行。 0038 本发明的方法利用龙须菜寡单糖水解液为碳源供酵母菌发酵以生产生质乙醇， 可 提升生质乙醇的产率。在部分具体实例中。
26、， 本发明的方法进行 5 天发酵可达生质乙醇的产 率为每 100 公克干燥龙须菜产生 23.00-27.00 公克的生质乙醇 (g/100g)， 且生质乙醇发酵 液所含乙醇浓度达 1.47-1.79 (v/v)， 相较于过去技术有显著提升。 0039 此外， 习知技术曾提出使用基因转殖的酵母菌与细菌发酵生产乙醇， 然而， 这种方 式对动物、 人类及环境皆有较高的基因改造生物的未知风险， 故以基因转殖的微生物所发 说 明 书 CN 105296542 A 6 5/9 页 7 酵制得的生质乙醇现仅局限用在工业用途。相较之下， 本发明的方法使用天然酵母菌即可 提高生质乙醇的产率， 无基因改造生物的未。
27、知风险， 可应用在医药或食品用途。 0040 本发明通过下面的实施例进一步的说明， 下面的实施例仅提供作为示范目的， 而 非限制本发明。 本领域的技术人员应能根据本发明了解， 不脱离本发明的精神和范围， 而对 本发明所公开的特定具体实施例中进行许多改变， 仍然能获得相同或相似的结果。 0041 实施例 1 ： 龙须菜粉末制备及热酸处理 0042 本实验是将龙须菜以热酸处理， 萃取出多糖成分并产生初步水解反应， 获得龙须 菜热酸水解液。 简言之， 将龙须菜以流水清洗并烘干， 再进行研磨， 获得龙须菜粉末。 以12N 盐酸与纯水配制成 0.4N 稀盐酸， 取 5g 龙须菜粉末分别加入 100mL 。
28、稀盐酸溶液中， 并在灭菌 釜中以100热萃取1至12小时。 冷却后， 以0.1N NaOH测量残余酸浓度， 再加入5(w/v) 龙须菜粉末 ( 即 5g/100mL)， 以 12N HCl 调整至起始酸浓度， 进行第二次热酸水解 (121， 20min)。 冷却后， 再加入5(w/v)龙须菜粉末， 以12N HCl调整至起始酸浓度， 进行第三次 热酸水解(121， 20min)。 热酸水解处理可降解龙须菜多糖及降低水解液黏稠度， 可重复多 次， 以提高水解效率。 0043 实施例 2 ： 以龙须菜诱导海洋菌株产生糖分解酶 0044 本实验是将海洋菌株培养在含有龙须菜成分的细菌培养液， 使其受诱。
29、导产生糖分 解酶， 获得粗酵素液。 简言之， 将0.3(w/v)龙须菜粉末或0.15(v/v)实施例1所得龙须 菜热酸水解液加入细菌培养液中， 将泡囊假单胞菌 (MA103) 及杀鲑产气单胞菌 (MAEF108) 接种在该含有龙须菜成分的细菌培养液中， 在 25培养 24 小时， 使海洋菌株受诱导产生糖 分解酶。然后， 将培养物进行分离， 去除菌体， 取得含有该糖分解酶的上清液， 获得粗酵素 液， 随后进行粗酵素的酵素活性分析。表 1 显示分析结果。 0045 表 1 ： 粗酵素液的酵素活性分析结果 0046 0047 结果显示， 上述海洋菌株培养在含有龙须菜成分的细菌培养液可受诱导产生糖分 。
30、解酶， 特别是洋菜酶， 部分尚可诱导产生淀粉酶， 但几乎不会产生纤维素酶、 卡拉胶酶或木 糖酶， 或活性很低(低于0.3U)。 其中， 泡囊假单胞菌培养在含脱脂大豆粉为氮源的条件下， 说 明 书 CN 105296542 A 7 6/9 页 8 受诱导产生较高的洋菜酶与淀粉酶活性， 分别达 1.13U/mL 与 6.18U/mL( 样本 (d) ； 杀鲑 产气单胞菌则是培养在含酵母萃取物为氮源的条件下， 受诱导产生较高的洋菜酶活性， 达 3.56U/mL( 样本 (h)。 0048 实施例 3 ： 龙须菜经水解后及发酵后的糖类分析 0049 以薄层色层分析(thin layer chromat。
31、ography， TLC)进行龙须菜水解样本的糖类 分析。简言之， 将待测样本经 3kDa 离心式超过滤装置进行区分后， 获得区分液 ； 然后， 该等 区分液以薄层色层分析 (thin layer chromatography， TLC) 分析区分液的糖类组成， 其中 薄层色层分析方法是取 15L 岩藻寡糖区分液在薄层层析用硅胶片 (TLC silica gel)60 F254(10 公分 x10 公分 ) 上进行点样， 并以丁醇 ： 醋酸 ： 纯水 (2 ： 1 ： 1) 展开， 呈色剂为硫酸 / 甲醇 (1 ： 20)， 将呈色剂均匀喷洒在薄层层析用硅胶片表面， 待干后置在 110加热至出。
32、现 糖类生成色斑， 之后测量其滞留时间值 (Rf 值 )。图 1 显示龙须菜热酸水解液 ( 第 3 栏 ) 以 及龙须菜热酸水解液加上粗酵素液反应后的混合液 ( 第 4-6 栏 ) 含有半乳糖的可发酵的糖 类。 0050 接着， 以上述龙须菜热酸水解液加入粗酵素液反应后的混合液 ( 含可发酵的糖 类)作为碳源， 加入酵母菌进行发酵。 详言之， 将12(v/v)食品工业发展研究所生物资源 存及研究中心编号 BCRC 21812 的酵母菌株接种在该混合液中， 在 23至 27避光静置发 酵 24 或 48 小时， 取出发酵液， 然后， 以 TLC 进行糖类分析。图 1 显示发酵液中所含的可发 酵糖。
33、类含量减少(第7-9及10-12栏)， 表示酵母菌可有效利用龙须菜样本经热酸及粗酵素 液水解产生的单糖进行发酵。 0051 另一方面， 在龙须菜热酸水解液中， 依序加入纤维素酶 尹太公司 cellulase AP3， 760U/100mL在37反应约48小时， 然后加入实施例2所获得的粗酵素液(样本(h)， 添加量为总体积 10 ) 在 23-27反应约 48 小时。分别检测各个龙须菜样本的还原糖含 量， 以 DNS 呈色反应分析水解效果。表 2 显示检测结果。 0052 表 2 ： 龙须菜样本的水解效果 0053 0054 如表 2 所示， 龙须菜样本处理前的总糖量由处理前的 264 毫克增。
34、加至 5,972 毫克， 且还原糖含量由处理前的 253 毫克增加至 4,516 毫克， 表示龙须菜经本发明的方法处理可 提高水解效率， 有效将龙须菜水解以产生高量的可发酵糖类。 0055 实施例 4 ： 以酵母菌发酵制备生质乙醇 0056 以实施例3经热酸处理并依序以纤维素酶及粗酵素液水解的龙须菜样本(以下称 “龙须菜寡单糖水解液” ) 作为碳源， 加入酵母菌在 23至 27避光静置发酵 3 至 7 天， 获 得含有乙醇的生质乙醇发酵液。表 3 显示不同酵母菌株的发酵结果。 0057 表 3 ： 酵母菌株利用龙须菜寡单糖水解液的发酵结果 0058 说 明 书 CN 105296542 A 8。
35、 7/9 页 9 0059 0060 结果显示， 多种酵母菌株均可利用本发明的龙须菜寡单糖水解液产生乙醇， 尤其 BCRC21550、 BCRC21685 与 BCRC 21686 的效率较高， 产生较高乙醇浓度。 0061 进一步针对以上三个酵母菌株测试其偏好利用糖类的种类。简言之， 使用前述酵 母菌株 BCRC 21550、 BCRC 21685 与 BCRC21686， 以 12 (v/v) 的菌株量加入含有本发明的 龙须菜寡单糖水解液的酵母菌培养液 (YP broth) 中进行发酵， 酵母菌培养液分别添加半 乳糖、 葡萄糖、 甘露醇、 与木糖为碳源， 在 26下发酵 3 天， 分别获得。
36、酵母菌株 BCRC 21550、 BCRC 21685 及 BCRC 21686 的发酵液， 测量残留还原糖量、 pH 值、 与乙醇浓度。表 4 显示结 果。 0062 表 4 ： 酵母菌株的糖类利用分析結果 0063 说 明 书 CN 105296542 A 9 8/9 页 10 0064 由表 4 结果得知， 酵母菌株 BCRC 21550、 BCRC 21685 及 BCRC 21686 的发酵皆以半 乳糖为碳源可得较高乙醇浓度， 分别为 1.15、 1.09及 1.17， 次高为以葡萄糖为碳源， 分别为 1.06、 1.05及 1.03， 若以甘露醇为碳源， 乙醇浓度分别为 0.96、。
37、 1.03及 1.01。 由上述结果显示， 该三株酵母菌确实能有效利用龙须菜水解液中单糖成分， 但无法 有效利用木糖做为碳源转换乙醇。 0065 实施例 5 ： 酵母菌的批次发酵 0066 以本发明的龙须菜寡单糖水解液作为碳源， 加入 10 (v/v)BCRC 21550 与 BCRC21686 酵母菌株进行批次发酵， 于 25温度下发酵 7 天。 0067 可使用气相层析仪(gas chromatography， GC)针对不同发酵时间所获得的生质乙 醇发酵液， 分析其所含的乙醇浓度。气相层析的分析条件为 ： SHIMADZU GC-14A 机型、 管柱 为 HP-5 3.2 毫米 (mm)。
38、210mm、 携带气体为氢气 (H2)、 流速每分钟 40 毫升 (mL/min)、 注射 体积为 1L、 注射温度为 210、 侦测温度为 280， 管柱温度为 ： 40 ( 恒温 2 分钟 ) 至每 分钟上升 10至 100 (8 分钟 )。结果如图 2， 有二个波峰， 分别为乙醇与丁醇 ( 作为内部 标准品 )， 此两者的停滞时间 (RT) 值分别为 5.30 与 7.83。以两者波峰的积分面积比与已 知浓度的丁醇作图， 即可求得生质乙醇发酵液中所含的乙醇浓度。 0068 另以本发明的龙须菜寡单糖水解液作为碳源， 加入总含量为 12 (v/v) 的酵母菌 株 BCRC 21550、 BC。
39、RC 21685 及 BCRC 21686 群组进行批次发酵， 在 25温度下发酵 7 天。表 5 显示不同时间的发酵液的乙醇浓度及产率。 0069 表 5 ： 不同时间的发酵液的乙醇浓度及产率 0070 0071 由表5可得知， 发酵时间为0小时至120小时的残留总糖量为10.11(mg/mL)、 残留 说 明 书 CN 105296542 A 10 9/9 页 11 还原糖量 16.23mg/mL、 乙醇浓度从 0.000.00至 1.790.02、 生质乙醇所含的乙醇产 率为每 100 公克干重龙须菜粉末可产生 0.000.00 至 28.560.02 公克乙醇 (g/100g) ； 生质乙醇发酵液所含的乙醇产率在发酵时间为 120 小时 (5 天 ) 时达到最高。 说 明 书 CN 105296542 A 11 1/1 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 105296542 A 12 。