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辅助鉴定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性状小麦的方法及其专用引物
    【技术领域】

    本发明涉及辅助鉴定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性状小麦的方法及其专用引物。

    背景技术

    面粉及其制品颜色是小麦品质遗传改良的重要内容。脂肪氧化酶(Lipoxygenase，LOX)活性是影响面制品颜色和加工品质的主要因素，在小麦制品加工和贮存期间引起面粉和面制品失色、变白。通过遗传育种途径提高小麦LOX活性，培育LOX活性高的小麦品种是小麦品质改良的重要目标。

    研究人员已作过许多关于小麦LOX活性的遗传研究，Borrelli等(1999)研究表明，基因型、环境以及基因和环境互作对LOX活性均有显著的影响，但主要受遗传因素影响。Leenhardt等(2006)对一粒小麦、硬粒小麦和普通小麦籽粒中类胡萝卜素含量(叶黄素Lutein)和LOX活性进行了研究，发现在不同小麦类型中叶黄素含量依次显著降低，而普通小麦LOX活性分别是硬粒小麦和一粒小麦的3倍和7倍。

    根据禾本科作物基因共线性原理，结合玉米和水稻中LOX活性相关基因的定位结果，Li等(1999)和Wang等(2008)推测控制小麦LOX活性的重要基因位于第4和第5同源染色体组上。目前，大量QTL定位结果也表明，普通小麦及硬粒小麦LOX活性基因位于第4和第5同源染色体组上，第4同源染色体尤为重要(Hart and Langston，1977；Carrera等，2007)。此外，1A、7B等其它染色体上也存在QTL(Trufanov等，2007)。硬粒小麦4B染色体长臂上存在效应较大的QTL(Hessle等，2002)，而Carrera等(2007)和Pshenichnikova等(2008)也将控制普通小麦LOX活性的位点定位于4BL上。此外，水稻、硬粒小麦等谷物作物的LOX基因研究要比小麦深入，基因全序列已被克隆。普通小麦LOX基因全序列未克隆，其LOX基因cDNA全序列已克隆，但迄今为止还未开发出可应用于小麦育种的LOX基因分子标记。

    【发明内容】

    本发明的目的是提供一种辅助鉴定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性状小麦的方法及其专用引物。

    本发明提供的辅助鉴定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性状小麦的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，同时用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增；如果得到235bp的DNA片段和117bp的DNA片段，待测小麦为候选的具有高籽粒脂肪氧化酶活性性状的小麦；如果没有得到235bp的DNA片段和117bp的DNA片段，待测小麦为候选的具有低籽粒脂肪氧化酶活性性状的小麦；所述高籽粒脂肪氧化酶活性性状为籽粒的脂肪氧化酶活性为75A₂₃₄min^-1g^-1以上；所述低籽粒脂肪氧化酶活性性状为籽粒的脂肪氧化酶活性为70A₂₃₄min^-1g^-1以下；所述引物对甲是序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA组成的引物对；所述引物对乙是序列表的序列3所示DNA和序列4所示DNA组成的引物对。

    本发明提供的另一种辅助鉴定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性状小麦的方法，包括如下步骤：包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增；如果用引物对甲得到235bp的DNA片段且用引物对乙得到117bp的DNA片段，待测小麦为候选的具有高籽粒脂肪氧化酶活性性状的小麦；如果用引物对甲没有得到235bp的DNA片段且用引物对乙没有得到117bp的DNA片段，待测小麦为候选的具有低籽粒脂肪氧化酶活性性状的小麦；所述高籽粒脂肪氧化酶活性性状为籽粒的脂肪氧化酶活性为75A₂₃₄min^-1g^-1以上；所述低籽粒脂肪氧化酶活性性状为籽粒的脂肪氧化酶活性为70A₂₃₄min^-1g^-1以下；所述引物对甲是序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA组成的引物对；所述引物对乙是序列表的序列3所示DNA和序列4所示DNA组成的引物对。

    本发明提供的鉴定小麦的籽粒脂肪氧化酶活性性状的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，同时用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增；如果得到235bp的DNA片段和117bp的DNA片段，待测小麦的脂肪氧化酶活性为75A₂₃₄min^-1g^-1以上；如果没有得到235bp的DNA片段和117bp的DNA片段，待测小麦的脂肪氧化酶活性为70A₂₃₄min^-1g^-1以下；所述引物对甲是序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA组成的引物对；所述引物对乙是序列表的序列3所示DNA和序列4所示DNA组成的引物对。

    本发明提供的另一种鉴定小麦的籽粒脂肪氧化酶活性性状的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增；如果用引物对甲得到235bp的DNA片段且用引物对乙得到117bp的DNA片段，待测小麦的脂肪氧化酶活性为75A₂₃₄min^-1g^-1以上；如果用引物对甲没有得到235bp的DNA片段且用引物对乙没有得到117bp的DNA片段，待测小麦的脂肪氧化酶活性为70A₂₃₄min^-1g^-1以下；所述引物对甲是序列表的序列1所示DNA和序列2所示DNA组成的引物对；所述引物对乙是序列表的序列3所示DNA和序列4所示DNA组成的引物对。

    以上任一所述的方法中，所述待测小麦具体可为为CA 0431小麦或泰山21小麦；所述脂肪氧化酶活性(A₂₃₄min^-1g^-1)定义为：以亚油酸为底物，每克小麦每分钟反应产物在234nm吸光度下的增加值；所述反应产物为共轭二烯。

    本发明保护一种引物组合物，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述引物对乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。

    本发明还保护引物对甲和/或引物对乙在制备如下(A)或(B)试剂盒中的应用：

    (A)辅助鉴定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性状小麦的试剂盒；

    (B)鉴定小麦的籽粒脂肪氧化酶活性性状的试剂盒；

    所述引物对甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述引物对乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。

    本发明同时保护辅助鉴定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性状小麦的试剂盒或鉴定小麦的籽粒脂肪氧化酶活性性状的试剂盒，由引物对甲和/或引物对乙组成；所述引物对甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述引物对乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。

    引物对甲和/或引物对乙在辅助鉴定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性状小麦或鉴定小麦的籽粒脂肪氧化酶活性性状中的应用也属于本发明的保护范围；所述引物对甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；所述引物对乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。

    本发明还保护序列表的序列5所示的DNA片段(235bp的DNA片段)或序列表的序列6所示的DNA片段(117bp的DNA片段)。

    本发明应用分子数量遗传学方法和小麦微卫星(microsatellite或SSR)技术在小麦染色体1A和4B长臂上发现了两个小麦脂肪氧化酶活性的主效QTL QLpx.caas-1AL和QLpx.caas-4B，距主效QTL最近的分子标记分别为Xwmc312(遗传距离为2.0)和Xgwm251(遗传距离为1.2cM)，所述标记Xwmc312和Xgwm251可以在多个环境条件下被检测到，是稳定的分子标记，其效应也尤为突出。本发明同时还提供了LOX基因的SSR复合分子标记Xwmc312/Xgwm251，利用该复合标记采用多重PCR的方式，可以对小麦脂肪氧化酶基因LOX进行分子标记辅助选择，从而培育出脂肪氧化酶活性高的优良小麦品种；此外，还可利用该分子标记检测小麦中脂肪氧化酶的活性，检测方法简单易行、稳定可靠。本发明的方法及其专用引物将在小麦脂肪氧化酶活性性状的检测和小麦育种中发挥重要作用。

    【附图说明】

    图1为复合区间作图法在DH群体中优9507/CA9632中定位的脂肪氧化酶活性相关基因曲线图。

    图2为Xwmc312/Xgwm251对16个小麦品种的多重PCR扩增产物电泳图。

    【具体实施方式】

    以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

    实施例1、小麦LOX基因的SSR分子标记组合Xwmc312/Xgwm251的获得

    用中国农科院作物所培育的LOX活性高的小麦品种‘中优9507’与PPO活性较低的小麦品种“CA9632”杂交，F₁代种于试验田中，抽穗时取花药离体培养，并进行单倍体加倍，得到DH群体，然后进行LOX活性分析。

    田间试验分别在中国农业科学院棉花研究所所(安阳)和山东农业科学院作物所(济南)2个地点进行，每个地点重复2次，小区为3行区，行长2米，每行播种80粒。收获后测试每个DH系的LOX活性。

    用125对SSR引物(wmc336a，Xgwm136，gdm33c，wmc329，wmc84b，Xgwm357，wmc469，wmc312，Xgwm448c，Xgwm99，wmc367，Xgwm26，gdm33b，wmc336b，wmc522，wmc177，Xgwm356，wmc191，Xgwm372，Xgwm425，Xgwm448b，Xgwm382，Xgwm312，Xgwm294，Xgwm410，Xgwm374，wmc154，wmc257b，Xgwm261，Xgwm296，Xgwm157，Xgwm539，Xgwm349，wmc419，wmc256a，wmc200a，wmc132c，wmc36a，wmc41，wmc410，wmc532，Xgwm66，Xgwm493，wmc326，wmc308c，Xgwm114c，Xgwm264a，Xgwm285，wmc291，Xgwm376，Xgwm247，Xgwm389，gdm72，wmc533，Xgwm3，wmc170b，Xgwm645，Xgwm383，wmc236，wmc132e，wmc297，wmc308a，wmc238，Xgwm495，wmc349，Xgwm6，Xgwm251，Xgwm149，wmc449，wmc459，wmc285，wmc473，gdm125，wmc308b，wmc457，gdm133a，Xgwm194，Xgwm293，wmc257a，Xgwm186，wmc327b，Xgwm126，gdm133c，wmc537，Xgwm67，wmc118，gdm132b，Xgwm190，gdm68，Xgwm182，Xgwm272，Xgwm114a，wmc215，wmc132a，gdm33a，wmc201，Xgwm570，wmc256b，wmc32，wmc84a，Xgwm169，Xgwm518，Xgwm114g，Xgwm193，gdm132a，Xgwm325，wmc479，wmc17，Xgwm276，Xgwm282，wmc36b，Xgwm264b，Xgwm569，Xgwm297，wmc402b，wmc396，wmc76，Xgwm400，Xgwm577，wmc323，wmc132b，Xgwm111，wmc346，wmc38，wmc438)、4对贮藏蛋白的STS引物(Glu-A3，Glu-B3，Gli-B1，Glu-D1)和26对AFLP引物组合(P41-M32e，P33-M38c，P42-M45c，P42-M45a，P32-M35e，P41-M32a，P42-M45h，P42-M45j，P32-M35b，P33-M38a，P31-M31a，P38-M46d，P42-M45g，P38-M46b，P38-M46a，P42-M45d，P42-M45e，P31-M31c，P42-M45f，P41-M32c，P35-M41d，P42-M45i，P35-M41a，P31-M31e，P35-M41b，P31-M31b)对该DH群体进行遗传分析，应用MAPMAKER 3.0软件构建连锁图，并用Cartographer软件包的复合区间作图法(CIM)分别进行2个地点(北京、安阳)LOX活性的QTL分析。

    结果如图1所示，表明在小麦染色体1A长臂(1AL)和4B长臂(4BL)上各有一个主效LOX活性基因，分别与微卫星标记Xwmc312和Xgwm251紧密连锁，其中Xwmc312与LOX基因的遗传距离为2.0cM，而Xgwm251与LOX基因的遗传距离为1.2cM。

    实施例2、小麦脂肪氧化酶(LOX)活性的测定

    实施例所用的小麦品种：

    (1)衡7228，购自河北省农林科学院旱作农业研究所)；

    (2)藁城8901，购自河北省藁城农业科学研究所)；

    (3)泰山269，购自山东省农科院作物所；

    (4)周892，购自河南省周口市农业科学院；

    (5)观35，购自河北省农林科学院旱作农业研究所；

    (6)石新733，购自石家庄小麦新品种新技术研究所；

    (7)京9428，购自北京市种子公司；

    (8)CA0431；获自中国农业科学院作物科学研究所的国家种质库；

    (9)泰山21，购自山东省农科院作物所；

    (10)良星66，购自山东良星种业有限公司；

    (11)济麦21，购自山东省农科院作物所；

    (12)周麦11，购自河南省周口市农业科学院；

    (13)藁城9411，购自河北省藁城农业科学研究所；

    (14)临麦2号，购自山东省临沂市农业科学研究所；

    (15)石6365，购自石家庄市农业科学研究院；

    (16)CA0477，获自中国农业科学院作物科学研究所的国家种质库。

    将上述16个冬小麦品种种植于中国农科院棉花研究所(安阳)和山东农科院作物所(济南)，田间管理按常规方法进行，收获籽粒。

    一、LOX活性测定

    按下述方法测定籽粒的LOX活性：

    1、LOX的提取

    ①精选约100粒种子，磨成全粉(即LOX活性定义中所指的粗麦粉)，称取0.20g放入2mL的离心管中，加入1mL的0.1mM的磷酸缓冲液(PH＝6.5)，放在混旋器上震荡10min。

    ②将震荡完毕的离心管立刻放入4℃冰箱中1h，期间每隔10min摇晃一下离心管，使提取液与样品充分接触。

    ③以12000rpm的转速，在4℃条件下离心10min。

    ④吸取上清液，即为脂肪氧化酶粗提物，4℃下保存(24h后降解作用明显)。

    2、底物的制备

    ①将240μl Tween20和200μl亚油酸(底物)依次加到100ml的容量瓶中。

    ②将5ml的0.1M磷酸缓冲液(pH＝9)加入容量瓶中，待底物溶解后，用0.1M的磷酸缓冲液(6.5)补足至100ml，得到底物溶液；底物溶液中的亚油酸浓度在7.5mM左右，Tween 20的浓度约为0.24％，整个过程必须在N₂条件下进行操作。

    ③将配制好的100ml底物溶液分装到1.5ml的离心管中，管中充入氮气后盖紧管盖，保存于-80℃。

    3、LOX活性检测

    ①用0.1mM的磷酸缓冲液(PH＝6.5)进行调零。

    ②依次向比色皿中加入2.8mL 0.1mM的磷酸缓冲液(PH＝6.5)、180μl步骤2的底物溶液和20μl步骤1的LOX粗提物。

    ③用分光光度计取1.0cm比色皿，在234nm下测定混合液在120s内吸光度的增加值(ΔA₂₃₄)，间隔10s测定一次反应产物。

    LOX活性被定义为，每克粗麦粉每分钟反应产物(共轭二烯)在234nm吸光度下的增加值(A₂₃₄min^-1g^-1)。LOX活性(A₂₃₄min^-1g^-1)＝ΔA₂₃₄min^-1g^-1×6×10²。

    式中：ΔA₂₃₄为234nm波长下10s内吸光度的平均增加值。

    各个品种小麦的籽粒的LOX活性见表1。

    表1各个品种小麦的籽粒的LOX活性

       编号  品种  LOX活性  编号  品种  LOX活性  1  衡7228  58.8 A₂₃₄min^-1g^-1  9  泰山21  79.8 A₂₃₄min^-1g^-1  2  藁城8901  54.7 A₂₃₄min^-1g^-1  10  良星66  68.2 A₂₃₄min^-1g^-1  3  泰山269  69.2 A₂₃₄min^-1g^-1  11  济麦21  68.7 A₂₃₄min^-1g^-1  4  周892  67.7 A₂₃₄min^-1g^-1  12  周麦11  61.2 A₂₃₄min^-1g^-1  5  观35  46.6 A₂₃₄min^-1g^-1  13  藁城9411  57.9 A₂₃₄min^-1g^-1  6  石新733  53.6 A₂₃₄min^-1g^-1  14  临麦2号  68.6 A₂₃₄min^-1g^-1  7  京9428  69.7 A₂₃₄min^-1g^-1  15  石6365  56.7 A₂₃₄min^-1g^-1

       编号  品种  LOX活性  编号  品种  LOX活性  8  CA0431  85.4 A₂₃₄min^-1g^-1  16  CA0477  56.0 A₂₃₄min^-1g^-1

    结果表明：CA 0431(籽粒LOX活性：85.4 A₂₃₄min^-1g^-1)和泰山21(籽粒LOX活性：79.8 A₂₃₄min^-1g^-1)两种小麦的LOX活性最高，均为75 A₂₃₄min^-1g^-1以上。

    二、Xwmc312/Xgwm251复合分子标记用于检测小麦脂肪氧化酶活性性状的有效性验证

    Xwmc312：序列表中序列1和序列2所示的核苷酸组成的引物对；

    Xgwm251：序列表中序列3和序列4所示的核苷酸组成的引物对。

    序列1：5’-ccgacgcagg tgagcgaag-3’；

    序列2：5’-tgtgcccgct ggtgcgaag-3’；

    序列3：5’-caactggttg ctacacaagc a-3’；

    序列4：5’-gggatgtctg ttccatctta g-3’。

    提取各个小麦品种的籽粒的基因组DNA作为模板，分别用Xwmc312和Xgwm251对18份小麦品种进行单标记的PCR扩增。聚丙烯酰胺凝胶电泳分别检测PCR产物。

    提取各个小麦品种的籽粒的基因组DNA作为模板，同时用Xwmc312和Xgwm251对18份小麦品种进行复合标记的多重PCR扩增。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物。

    PCR扩增的反应体系均为：20μl总体积中包含1×PCR缓冲液(50mmol·L^-1KCl，10mmol·L^-1Tris·HCl，0.01％明胶)、MgCl₂ 1.5mM、dNTP(A/T/C/G)各250μM、TaqDNA聚合酶1U、每条引物4pmol、模板DNA 80ng。PCR扩增的反应条件均为：首先94℃变性5min；然后94℃变性1min，55℃退火55sec，72℃延伸1min，共40个循环；最后72℃延伸10min。

    电泳检测的方法均为：电泳缓冲液为pH8.0的1×TBE；制胶用6％聚丙烯酰胺胶储存液(尿素420.2g，丙稀酰胺60.0g，N’N-甲叉双丙烯酰胺3.16g，10×TBE 50ml，定容至1000ml)60ml，10％过硫酸铵(APS)300μl，TEMED 60μl，混合均匀后灌胶，胶型为380mm/300mm/0.4mm；电泳程序为首先100W预电泳30min，插60孔加样梳，点样后80W电泳60min。电泳结束后进行银染程序：(1)脱色与固定：将胶板放入10％冰醋酸中轻摇30min；(2)漂洗：用蒸馏水漂洗3次，每次3min；(3)银染：1L 1％的AgNO₃溶液中加2ml 37％的甲醛，放入胶板轻摇30min；(4)蒸馏水漂洗约20sec；(5)显影：在预冷的1L 30％的Na₂CO₃溶液中加2ml甲醛和200μl 1％NaS₂O₃溶液，放入胶板轻摇直到目标片段显示出来；(6)终止：迅速将胶板转入10％冰醋酸溶液中，终止显色反应；(7)用蒸馏水飘洗2min；(8)将胶板自然干燥后，记录带型并用数码相机照相。

    分别用Xwmc312和Xgwm251进行PCR扩增的扩增产物的电泳图叠加后，与同时用Xwmc312和Xgwm251进行PCR扩增的扩增产物的电泳图完全一致。表明用Xwmc312/Xgwm251引物组合，通过多重PCR的方式检测小麦品种LOX活性的结果与单标记检测的结果是一致的，由于多重PCR具有简单、快捷，经济、高效的优点，在育种实践中加以应用将能提高选择的效率。

    同时用Xwmc312和Xgwm251进行PCR扩增的扩增产物电泳图见图2。图2中，M为DNA ladder pUC 18，1为衡7228，2为藁城8901，3为泰山269，4为周892，5为观35，6为石新733，8为京9428，9为CA 0431，10为泰山21，11为良星66，12为济麦21，13为周麦11，14为藁城9411，16为临麦2号，17为石6365，18为CA0477。

    回收各个特异条带，进行测序，测序结果表明，具有相同碱基个数的DNA片段同样具有相同的核苷酸序列。根据组成DNA片段的碱基个数，分别将各个条带命名为Xwmc312_-227、Xwmc312_-235、Xwmc312_-247、Xgwm251_-113、Xgwm251_-117和Xgwm251_-125。

    Xwmc312_-235的核苷酸序列如序列表中序列5所示，Xgwm251₁₁₇的核苷酸序列如序列表中序列6所示。

    同时用Xwmc312和Xgwm251进行PCR扩增的扩增产物电泳共出现了9种带型：Xwmc312_-235/Xgwm251_-117，Xwmc312_-247/Xgwm251_-117，Xwmc312_-235/Xgwm251_-113，Xwmc312_-227/Xgwm251_-117，Xwmc312_-235/Xgwm251_-125，Xwmc312_-247/Xgwm251_-113，Xwmc312_-247/Xgwm251_-125，Xwmc312_-227/Xgwm251_-113和Xwmc312_-227/Xgwm251_-125；其中Xwmc312_-227、Xwmc312_-235和Xwmc312_-247是以Xwmc312(序列1和序列2)进行扩增的特异性条带；而Xgwm251₁₁₃、Xgwm251₁₁₇和Xgwm251₁₂₅是以Xgwm251(序列3和序列4)进行扩增的特异性条带。

    以CA 0431和泰山21的基因组DNA为模板的PCR扩增产物均为带型Xwmc312_-235/Xgwm251_-117。

    LOX活性和电泳结果联合分析，CA 0431和泰山21这两种小麦的LOX活性明显高于其它小麦品种，PCR扩增产物均为带型Xwmc312_-235/Xgwm251_-117，从而证明带型为Xwmc312_-235/Xgwm251_-117的小麦品种LOX活性高。

    【序列表】

    <110>中国农业科学院作物科学研究所

    <120>辅助鉴定具有高籽粒脂肪氧化酶活性性状小麦的方法及其专用引物

     

    <130>CCGNARY102159

     

    <160>6

     

    <210>1

    <211>19

    <212>DNA

    <213>人工序列

     

    <220>

     

    <223>

     

    <400>1

    ccgacgcagg tgagcgaag                 19

     

    <210>2

    <211>19

    <212>DNA

    <213>人工序列

     

    <220>

     

    <223>

    <400>2

    tgtgcccgct ggtgcgaag                 19

     

    <210>3

    <211>21

    <212>DNA

    <213>人工序列

     

    <220>

     

    <223>

     

    <400>3

    caactggttg ctacacaagc a              21

     

    <210>4

    <211>21

    <212>DNA

    <213>人工序列

     

    <220>

     

    <223>

     

    <400>4

    gggatgtctg ttccatctta g              21

     

    <210>5

    <211>235

    <212>DNA

    <213>小麦

    <400>5

    ccgacgcagg tgagcgaagc tggacgccgt ctctctctct ctctctctct ctctctctct     60

    ctctctctct ctctctctct ctctctcttc atctttctct ccacgcatct gcagctggcc    120

    tacgctcaga ttatccagag gcgaccatgc gcacgtagct cgccgccgcc gccgccaccg    180

    ccgagggtaa acccttctcg cccttctctc gtctcgcttc gcaccagcgg gcaca         235

     

    <210>6

    <211>117

    <212>DNA

    <213>小麦

     

    <400>6

    caactggttg ctacacaagc agacacacac acacacacac acacacacac acacacacac     60

    acacacacac acacacacac acacacacac acagagctaa gatggaacag acatccc       117