技术领域
本发明涉及一种用于生物合成白藜芦醇的融合基因、蛋白、表达载体及应用，具体属于基因工程领域。
背景技术
白藜芦醇是植物在受到外界逆境刺激时产生的一种植物保护素，常见的植物生长逆境有紫外线辐射、真菌感染以及机械损伤等，而白藜芦醇是少数几种高等植物受到真菌感染、损伤及紫外线辐射时产生的一种植保素，是一种非常重要的次级代谢产物。作为红葡萄酒的有效成分，它可预防多种疾病，如抗凝血、抗氧化、抗炎免疫、抗癌、心血管保护和神经保护等作用。因此，白藜芦醇被誉为继紫杉醇之后又一新的绿色抗癌药物。然而，一般植物中白藜芦醇的含量都比较低，难以满足市场的需求。生物合成白藜芦醇是目前的研究热点，该法不仅可以克服植提法所面临的生态破坏与资源匮乏问题，也可以解决化学合成法所带来的环境污染问题。
融合基因技术是将两个或多个表达不同功能蛋白的基因通过分子生物学的手段连接起来，从而能够编码出具有多个功能的复合蛋白。在每个蛋白之间都需要一个起过渡连接作用的柔性氨基酸链(linker)，这样使得最终得到的融合蛋白不仅具有所有蛋白酶的活性，而且还能够增加总酶促反应速率。研究表明，在构建融合基因时，首先应该删除上游基因的终止密码子与下游基因的起始密码子，这样才能实现两个基因的融合表达。基因融合技术在微生物合成白藜芦醇的过程中，对于提高产率具有较好的指导意义。
近10年来，生物合成白藜芦醇一直是科学界的研究热点，该方法不仅可以克服植提法所面临的生态破坏与资源匮乏等问题，也可以解决化学合成法所带来的环境污染问题。目前，国内很多研究学者对白藜芦醇合酶基因(RS)研究的比较深入，但是他们研究主要局限在将该基因转化到目标植物，对于将该基因转化到微生物中仍然面临着微生物表达不稳定以及目标产物得率比较低等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于生物合成白藜芦醇的融合基因、蛋白、表达载体。
另一目的是提供一种用于生物合成白藜芦醇的融合基因的制备及表达方法。
另一目的是提供一种利用重组菌株发酵制备白藜芦醇的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案如下：
一种用于生物合成白藜芦醇的融合基因，它是由拟南芥的对香豆酰辅酶A连接酶基因与花生的白藜芦醇合酶基因融合得到的4CL：：RS融合基因，是SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。测序结果表明，4CL：：RS融合基因全长为2895bp，包括去除终止密码子的4CL基因片段(1693bp)、去除起始密码子的RS基因片段(1167bp)以及柔性linker的45个核苷酸，与原设计一致。DNAMAN软件分析构建的4CL：：RS融合基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序，加框的ATG为4CL：：RS融合基因的起始密码子，中间45个加框序列为linker的核苷酸序列，下划线序列CCATGG，GGATCC，GAATTC分别代表着NcoI、BamHI和EcoRI酶切位点。
用于生物合成白藜芦醇的融合基因编码的蛋白质，它是SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。分析表明4CL：：RS融合基因共编码964个氨基酸，分子量(Mr)为104.7kDa，pI为5.63。
含有上述融合基因的表达载体pET-30a/4CL：：RS。
前述融合基因的制备及表达方法，具体为：首先在大肠杆菌中克隆拟南芥4CL基因与花生RS基因，通过基因融合技术将4CL基因与花生RS基因融合起来，选择大肠杆菌作为宿主菌株，实现4CL：：RS融合基因在原核中的表达；所述的基因融合技术采用的是长度为15个氨基酸的柔性Linker，其氨基酸序列为(GGGGS)3，并将其对应的核苷酸序列设计为ggtggaggcggatccggcggaggtggctctggcggtggcggatcg，所述划线序列为BamHI酶切位点，通过多步PCR反应、BamHI单酶切反应以及连接反应，构建融合基因4CL：：RS，随后，通过NcoI与EcoRI酶切位点构建原核表达载体pET-30a/4CL：：RS，在28℃诱导表达8h，分别通过ProteinIsoTMNi-NTAResin纯化及Westernblot分析验证所构建的原核表达载体pET-30a/4CL：：RS能够表达目的融合基因4CL：：RS，即所得到的重组菌株BL21(DE3)携带重组质粒pET-30a/4CL：：RS。
所采用的引物分成两条设计，4CL：：RS-F1和4CL：：RS-R1为第一个基因4CL的上、下游引物，4CL：：RS-F1中引入了NcoI酶切位点CCATGG，4CL：：RS-R1在引入BamHI酶切位点的同时又将4CL基因的终止密码子TAG敲除；4CL：：RS-F21、4CL：：RS-F22、4CL：：RS-R2为第二个基因(RS)的上、下游引物引物，4CL：：RS-F22在引入BamHI酶切位点的同时又将RS基因的起始密码子ATG敲除，在下游引物4CL：：RS-R2中引入酶切位点EcoRI。
利用前述重组菌株发酵制备白藜芦醇的方法，包括以下步骤：
(一)重组菌株的活化
(1)将-80℃保存的重组菌株的甘油菌放置在38℃～40℃水浴中，不断摇动直至全部融化成液状；
(2)无菌条件下，用接种环将少量融化的菌种划线在含有硫酸卡钠霉素的平板上；
(3)将划线后的平板密封后，37℃条件下静置15min，最后将其在37℃的恒温培养箱中倒置培养12h后观察菌落；
(4)无菌条件下，挑取平板上的单菌落至1mL的LB体培养基，在37℃，200rpm条件下过夜培养；
(二)发酵转化及其产物的提取
(1)无菌条件下，将500μL活化后的重组菌液按1∶50的接种比例接种至50mL新鲜且预热的LB培养基；
(2)37℃，200rpm的恒温培养箱中培养2h，培养基中发酵菌液的OD600值为0.2；
(3)在200μLDMSO中溶解0.00821g的对香豆酸，摇匀充分溶解；
(4)在无菌条件下，将上述配置的对香豆酸溶液全部加入到发酵菌液中，此时对香豆酸的终浓度为1mM；
(5)28℃，200rpm的恒温培养箱中发酵培养48h；
(6)充分摇匀发酵液，无菌条件下取1mL发酵液放置于1.5mL的离心管中，13000rpm离心3min；
(7)将上清液转至新的离心管中并添加50μL的0.1mol/l的HCl，-20℃冷冻过夜；
(8)室温条件下，将冷冻离心管缓慢解冻并加入1mL的乙酸乙酯萃取，重复3次；
(9)萃取结束后，将乙酸乙酯相合并并用氮吹仪将其吹干；
(10)最后将所得残留成分溶解于1mL的色谱甲醇中，进样前置于-20℃保存。
(三)产物检测
将步骤(二)得到的产物经过高效液相色谱检测及紫外吸收检测，与白藜芦醇标品的色谱图和紫外吸收图进行比较，洗脱时间为13min左右时有一个明显的色谱峰，该色谱峰的洗脱时间和对应的紫外吸收波长通过与白藜芦醇的标准品相对比，证实了发酵产物中含有白藜芦醇。
本发明的有益效果是：
(1)根据引物设计原则，若将linker核酸序列中BamHI酶切位点后的序列都设计到第二个基因(RS)的上游引物中，会使得此条引物的长度高达63bp，这样会大大降低引物特异性，因此本发明将此条引物分成两条设计：4CL：：RS-F1和4CL：：RS-R1为第一个基因(4CL)的上、下游引物，4CL：：RS-F1中引入了NcoI酶切位点(CCATGG)，4CL：：RS-R1在引入BamHI酶切位点的同时又将4CL基因的终止密码子TAG敲除；4CL：：RS-F21、4CL：：RS-F22、4CL：：RS-R2为第二个基因(RS)的上、下游引物引物，4CL：：RS-F22在引入BamHI酶切位点的同时又将RS基因的起始密码子ATG敲除，在下游引物4CL：：RS-R2中引入酶切位点EcoRI(GAATTC)，这样大大降低了引物的特异性。
(2)本发明成功构建了重组菌，并且对发酵工艺条件如培养及种类、添加底物浓度、发酵温度、发酵时间以及诱导剂浓度等方面进行进一步优化，使得目标产物白藜芦醇的产量和摩尔转化率都较高。
附图说明
图1是本发明拟南芥4CL基因扩增程序示意图。
图2是本发明菌液PCR反应程序示意图。
图3是本发明4CL：：RS基因片段I的PCR扩增程序示意图。
图4是本发明4CL：：RS基因片段II的PCR扩增程序示意图。
图5是本发明4CL：：RS基因PCR扩增程序示意图。
图6是本发明基因片段I、基因片段II与4CL：：RS的电泳图。
其中，M：BM5000Marker；1-2：基因片段I；3-4：基因片段II；5-6：4CL：：RS
图7是本发明pET-30a/4CL：：RS的菌液PCR鉴定电泳图。
其中，M：BM5000Marker；1-6：阳性菌扩增片段；7：阴性对照；8：阳性对照
图8是本发明pET-30a/4CL：：RS的酶切鉴定电泳图。
其中，M：蛋白分子量Marker；1：未纯化蛋白；2：Ni-NTA纯化蛋白
图9是本发明4CL：：RS融合蛋白SDS-PAGE电泳图。
其中，M：蛋白分子量Marker；1：未纯化蛋白；2：Ni-NTA纯化蛋白
图10是本发明融合蛋白4CL：：RS的Westernblot分析图。
其中，1：5μL样品；2：10μL样品；3：15μL样品；4：20μL样品
图11是本发明白藜芦醇标准曲线。
图12a为本发明白藜芦醇标品的色谱图。
图12b为本发明重组菌发酵产物色谱图。
图13a为本发明白藜芦醇标品紫外吸收图。
图13b为本发明发酵产物的紫外吸收图。
具体实施方式
如果没有特别说明，本发明所采用的各种药品、试剂等均能从市场上获得，对于不能够直接购买的菌株或质粒，都能够按照现有技术给出的方法制备而得。
实施例14CL：：RS融合基因的克隆
本试验使用的菌株和质粒，详见表1。
表1本试验的菌株和质粒
1.2相关溶液及缓冲液
本试验使用的相关溶液及缓冲液，详见表2。
表2本试验使用的溶液和缓冲液
(一)4CL基因的制备
扩增4CL基因的引物及其序列，详见表3。
菌液PCR使用的通用引物及其序列，详见表4。
表3扩增4CL基因的引物
表4菌液PCR引物
所有引物均由北京博迈德基因技术有限公司合成。
1、首先利用Trizol法提取拟南芥叶片总RNA
试验具体步骤如下：
(1)将1.5mL无RNase酶的离心管放置在离心管架上，取4℃保存的Trizol试剂1mL，立即将离心管盖紧并放于冰上，备用；
(2)研钵用少量液氮进行预冷，取0.2g左右的拟南芥嫩叶片，迅速剪碎并放于提前预冷的研钵内，在液氮中迅速研磨成粉末；
(3)将粉末迅速转入Trizol溶液中，轻轻混匀，室温放置8min；
(4)向离心管中缓慢加入200μL的氯仿后，立即涡旋震荡15s，室温静置2min；
(5)将静置后的离心管放入提前预冷至4℃的离心机中离心5min(12000rpm)；
(6)待样品分层稳定后，将500μL的上清液移入新的无RNase酶离心管；
(7)向离心管中加入500μL异丙醇，上下混匀后立即置于-80℃冰箱中，沉淀2h；
(8)室温条件下，冷冻样品缓慢解冻10min后高速离心10min(12000rpm)；
(9)弃去上清液后加入1mL80％乙醇，轻轻将沉淀振起；
(10)放入4℃离心机离心5min(7500rpm)，将上清液小心地去除；
(11)用真空泵吸去余下的乙醇，在超净工作台中吹至乙醇完全挥发；
(12)向离心管中加入约30μL的无RNase酶H2O充分溶解沉淀，可在55℃水浴中使未溶解的沉淀彻底溶解，长期保存应置于-80℃；
(13)电泳检测提取总RNA的纯度与亮度(RNA电泳时，应将仪器装置洗干净，电泳缓冲液也要重新配置，以减少RNA的降解)。
2、拟南芥cDNA的合成
本试验采用BeijingTransGenBiotech公司的反转录试剂盒，参照该试剂盒的说明书，操作步骤如下：
(1)配制cDNA合成体系，详见表5；
表5拟南芥cDNA合成体系
3拟南芥4CL基因片段的分离
3.1PCR扩增4CL基因片段
根据NCBI数据库中已有的拟南芥4CL(AY376729)基因的cDNA序列设计PCR特异性扩增引物4CL-F1及4CL-R1。
以拟南芥的cDNA为模板，4CL-F1和4CL-R1为引物，用2×GoldFastPfuPCRMasterMix扩增拟南芥4CL基因片段。扩增体系见表6，PCR扩增程序如图1。
表6拟南芥4CL基因PCR扩增体系
PCR扩增终止后，取少量的PCR产物经1％的凝胶进行检测，并对结果进行分析。
3.24CL基因片段的回收
采用北京博迈德生物技术有限公司的核酸凝胶纯化回收试剂盒对上述扩增的4CL基因进行纯化回收，具体步骤如下：
(1)在长波长紫外灯下，用灼烧后的干净刀片迅速将含有目的基因片段的凝胶切割分离下来，最终得到的凝胶体积应尽可能的小；
(2)迅速将切割下来的凝胶放入提前称重的1.5mL离心管中，称取凝胶的净重；
(3)根据切割得到的凝胶重量，粗略地计算出体积，然后迅速加入3倍体积的溶胶液DD(凝胶质量1mg，其体积约为1μL)；
(4)将加入溶胶液的离心管放在56℃的水浴中，每隔2min剧烈摇动一次，直到凝胶完全溶解；
(5)将吸附柱EC放入收集管中，把溶胶液全部移入吸附柱EC中，室温静置1min，离心30s(12000rpm)；
(6)将500μL漂洗液WB迅速加入到吸附住EC中，高速离心30s(12000rpm)后，弃去滤液并重复此操作；
(7)为了尽可能的除去漂洗液WB，将吸附柱EC高速离心2min(13000rpm)；
(8)将离心后的吸附柱EC安置在新的灭菌收集管中，50μL的ddH2O从柱中央缓慢加入(预热至55℃，洗脱效果更好)，将回收片段室温溶解2min后高速离心1min(12000rpm)，所得产物在-20℃保存。
44CL基因的克隆
4.1克隆载体pMD18-T及转化菌株E.coilJM109
载体pMD18-T是由pUC18载体经过特殊处理以后得到的常用克隆载体，具体处理是在pUC18载体上插入了EcoRV酶切位点以后经过该酶的单酶切反应，最后分别在3′端添加碱基“T”。一般PCR扩增反应中使用的耐热性DNA聚合酶都会在所得到的扩增产物末端继续延伸添加一个“A”碱基，形成3′粘性末端，正是由于这个特性，使得扩增产物能够很高效、方便地连接到pMD18-T克隆载体上。本实验选用Takara公司的pMD18-T载体试剂盒，所得连接产物可以直接转化宿主菌株，通过蓝白斑鉴定可以初步筛选出阳性克隆。
本实验选择的宿主菌株是北京博迈德生物技术有限公司的E.coliJM109，利用连接液转化该宿主菌细胞后，首先利用蓝白斑的方法初步筛选阳性重组子，然后再通过菌液PCR与酶切鉴定。
4.2连接反应及转化
参照克隆载体pMD18-T和E.coliJM109感受态的使用说明书，操作如下：
(1)将4CL基因回收片段和pMD18-T载体按照一定的比例配制连接反应体系，详见表7；
表7pMD18-T/4CL连接反应
(2)在上述混合液中加入等量的SolutionI连接液，16℃连接过夜；
(3)连接反应结束以后，将连接液全部转化到100μL的E.coliJM109感受态中，缓慢地将其摇匀后在冰浴中放置30min；
(4)上述转化混合反应液在42℃水浴中加热90s后迅速在冰浴中冷却2min；
(5)无菌条件下，将500μL的SOC培养基加到上述离心管中，然后恒温振荡培养45min(37℃，200rpm)；
(6)将上述培养的菌液在4000rpm的条件下离心30s，去除约350μL的上清液，余下摇匀后加到含有20mg/L的X-Gal、200mg/L的IPTG及50mg/L的Amp抗生素的LB平板上，用涂布棒均匀涂开；
(7)将涂布后的平板密封后(用封口膜)，37℃条件下静置15min(将菌液完全吸收)，最后将其倒置培养12h(37℃恒温条件下)。
4.3菌液PCR鉴定
挑取单菌落接种至1mL液体LB(Amp+，50mg/L)，37℃，200rpm培养12h。以通用引物M13F(-47)与M13R(-48)为扩增引物。具体操作步骤如下：
(1)无菌条件下，将1mL的LB培养基(Amp+，50mg/L)加到无菌离心管中；
(2)用白枪头挑取平板上的白色菌落单斑，然后迅速将带有白色菌落的枪头放入离心管中，恒温培养过夜(37℃，200rpm)；
(4)按表8配制菌液PCR反应体系，并按照图2反应条件进行PCR反应。
表8菌落PCR反应体系
(5)PCR扩增终止后，取少量的PCR产物经1％的凝胶进行检测，并对结果进行分析，初步筛选出阳性重组菌。
4.4重组质粒的提取
将上步初选得到的阳性重组菌按照1∶50的比例接种至新鲜且预热的LB液体培养基(Amp+，50mg/L)中，恒温培养过夜12h(37℃，200rpm)。本试验选用北京博迈德生物技术有限公司的质粒提取试剂盒提取重组质粒，具体操作步骤如下：
(1)取2mL菌液(分两次离心收集)，离心30s(9000rpm)后尽量将上清除尽；
(2)向上述离心管中缓慢地加入250μL的溶液P1(已加入指定量的RNaseA)，剧烈摇动至没有明显菌块；
(3)将250μL的溶液P2缓慢的加入到上述溶解液中，上下摇动离心管7次，直至菌体彻底破碎裂解成透明溶液；
(4)取350μL的溶液P3加入到上述离心管中，迅速上下颠倒混匀7次(出现白色絮状沉淀)后高速离心5min(12000rpm)；
(5)缓慢地将离心所得的上部澄清溶液吸入至试剂盒中的吸附柱AC，然后离心1min(12000rpm)后弃尽滤液；
(6)将500μL的溶液WB(已加入指定体积的无水乙醇！)吸取至吸附柱AC中，然后高速离心30s(12000rpm)后弃去滤液；
(7)吸附柱AC重新高速离心2min(13000rpm)，最大程度除去残留的溶液WB；
(8)将吸附柱AC重新安置于灭菌离心管中，吸取50μL的ddH2O从柱中央缓慢地加入(预热至55℃，洗脱效果更好)，室温溶解2min后高速离心1min(12000rpm)，所得产物放于-20℃保存。
(二)花生RS基因的克隆
扩增RS基因引物及其序列，详见表9。
表9扩增RS基因的引物
菌液PCR所使用的通用引物及其序列，同表4。
1、花生嫩叶总RNA的提取
选用Takara公司的TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit试剂盒。试验步骤具体如下：
(1)研钵用少量液氮进行预冷，取0.2g左右的花生嫩叶片，迅速剪碎并放于提前预冷的研钵内，在液氮中迅速研磨成粉末；
(2)在1.5mL无RNase酶离心管中加入450μL的溶液BufferPE，小心加入约50mg的粉末状样品，上下剧烈震荡直至离心管中无明显花生嫩叶的粉末；
(3)将摇匀后的离心管放入提前预冷至4℃离心机中高速离心5min(12000rpm)；
(4)缓慢地将离心管上部澄清溶液移至新的无RNase酶离心管中，然后迅速加入40μL的BufferNB，剧烈振荡使其混匀；
(5)上述混合液在4℃条件下高速离心5min(12000rpm)，然后将离心管上部的澄清溶液移至新的无RNase酶离心管；
(6)向离心管中加入450μL的BufferRL(已加入指定体积的50×DTTSolution)，轻轻地将溶液混匀；
(7)将450μL的无水乙醇迅速加入至上述离心管中(会出现少量白色絮状沉淀)，上下颠倒离心管使其混匀；
(8)迅速地将含有沉淀的混合液吸入到RNASpinColumn(安置在CollectionTube内)中，然后高速离心1min(12000rpm)后小心弃去滤液；
(9)吸取500μL的溶液BufferRWA至上述RNASpinColumn中，然后高速离心30s(12000rpm)后小心弃去滤液；
(10)吸取600μL的溶液BufferRWB至上述RNASpinColumn中，然后高速离心30s(12000rpm)后小心弃去滤液；
(11)重复操作步骤(10)；
(12)为了彻底清除残余溶剂，将上述离心后的RNASpinColumn重新安置在收集管中高速离心2min(12000rpm)；
(13)将RNASpinColumn重新放置在新的离心管中，100μL无RNase酶H2O缓慢加入(预热至55℃，洗脱效果更好)，室温溶解5min后高速离心2min(12000rpm)，所得产物放于-20℃保存，若长期保存需放于-70℃；
(14)电泳检测提取总RNA的纯度与亮度(RNA电泳时，应将仪器装置洗干净，电泳缓冲液也要重新配置，以减少RNA的降解)。
2花生cDNA的合成
(1)方法及操作同拟南芥cDNA的合成。但此时的反应体系见表10。
表10拟南芥cDNA合成体系
(2)反应液轻轻混匀后，50℃条件下反转录30min，85℃加热5min以停止反应，反应产物在4℃条件下保存。
3花生RS基因片段的分离
3.1PCR扩增RS基因片段
根据NCBI数据库中已有的花生RS基因(AY170347)的cDNA序列设计PCR特异性扩增引物RS-F1及RS-R1：
以花生cDNA为模板，RS-F1和RS-R1为引物，用2×GoldFastPfuPCRMasterMix扩增花生RS基因片段。扩增体系见表11，PCR扩增程序如图2。
表11RS基因PCR扩增体系
Tab.3-3ThePCRamplificationsystemfortheRSgene
PCR扩增终止后，取少量的PCR产物经1％的凝胶进行检测，并对结果进行分析。
3.2RS基因片段的回收
方法及操作步骤同拟南芥4CL基因片段的回收。
4、RS基因的克隆
4.1连接反应及转化
方法及操作步骤同拟南芥。但此时的连接反应体系见表12。
表12pMD18-T/RS连接反应
4.2菌液PCR鉴定
方法及操作步骤参照拟南芥。
4.3重组质粒的提取
方法及操作步骤参照拟南芥。
(三)4CL：：RS融合基因的克隆、表达
1、引物
4CL：：RS融合基因的扩增引物及其序列，详见表13。
菌液PCR需要的通用引物及其序列，详见表14。
表13扩增4CL：：RS融合基因的引物
注：小写字母为柔性linker的编码序列。
表14基因片段I的PCR扩增体系
2、实验方法
2.1柔性linker的设计
本研究中所设计的柔性linker是指在4CL和RS酶蛋白之间接入一段起连接作用的过渡氨基酸链，它具有一定的柔性能够使得4CL和RS酶蛋白各自保留活性，同时又能提高总酶促反应效率。本实验设计的linker序列为GGGGSGGGGSGGGGS，并将柔性linker的核苷酸序列设计为ggtggaggcggatcc(BamHI)ggcggaggtggctctggcggtggcggatcg。
2.2引物设计
设计引物主要是为了能够将linker编码的核苷酸序列引入到4CL基因和RS基因之间。然而根据引物设计原则，若将linker核酸序列中BamHI酶切位点后的序列都设计到第二个基因(RS)的上游引物中，会使得此条引物的长度高达63bp，这样会大大降低引物特异性，因此将此条引物分成两条设计。4CL：：RS-F1和4CL：：RS-R1为第一个基因(4CL)的上、下游引物，4CL：：RS-F1中引入了NcoI酶切位点(CCATGG)，4CL：：RS-R1在引入BamHI酶切位点的同时又将4CL基因的终止密码子TAG敲除；4CL：：RS-F21、4CL：：RS-F22、4CL：：RS-R2为第二个基因(RS)的上、下游引物引物，4CL：：RS-F22在引入BamHI酶切位点的同时又将RS基因的起始密码子ATG敲除，在下游引物4CL：：RS-R2中引入酶切位点EcoRI(GAATTC)。
2.34CL：：RS融合基因的构建
2.3.1基因片段I的合成
以pMD18-T/4CL为模板，4CL：：RS-F1、4CL：：RS-R1为引物合成基因片段I：(NcoI)CCATGG+4CL(-TGA)+ggtggaggcggatcc(BamHI)。反应体系如表4，PCR反应程序如图3。
2.3.2基因片段II的合成
以pMD18-T/RS为模板，先以4CL：：RS-F21，4CL：：RS-R2为引物进行扩增，将PCR产物割胶回收后，再以割胶回收产物为模板，4CL：：RS-F22，4CL：：RS-R2为引物合成基因片段II：(BamHI)ggatccggcggaggtggctctggcggtggcggatca+RS(-ATG)+GAATTC(EcoRI)。反应体系如表15，表16，PCR反应程序如图4。
表15基因片段II的PCR扩增1
表16基因片段II的PCR扩增2
2.3.3单酶切反应
将上述基因片段I和基因片段II分别割胶回收后进行BamHI单酶切反应，单酶切反应体系详见表17，表18。
表17基因片段I的BamHI单酶切反应
表18基因片段II的BamHI单酶切反应
37℃孵育3h，将上述反应产物分别经Takara公司的TaKaRaMiniBESTDNAfragmentpurificationkit试剂盒纯化回收。参照试剂盒说明书，操作步骤如下：
(1)根据酶切反应体系确定向上述各酶切反应液中加入的BufferDC的体积(体积应为酶切反应体积的三倍)；
(2)将上述混合液缓慢地吸入到SpinColumn中(安置在CollectionTube内)，然后高速离心1min(12000rpm)后弃去滤液；
(3)取700μL溶液BufferWB加到SpinColumn中(重新安置在CollectionTube内)，然后高速离心30s(12000rpm)后弃去滤液；
(4)重复操作步骤(3)；
(5)为了彻底去除溶剂BufferWB，以减少对下游实验的影响，现将SpinColumn重新高速离心2min(13000rpm)；
(6)将SpinColumn重新安置于灭菌离心管中，吸取25μL的ddH2O从柱中央缓慢加入(预热至55℃，洗脱效果更好)，室温溶解2min后高速离心1min(12000rpm)，所得产物放于-20℃保存。
2.3.3连接与转化
将单酶切反应回收得到的两个基因片段在T4DNALigase条件下按1∶1进行连接。连接反应体系详见表19。
表194CL：：RS基因的连接反应
16℃连接过夜。考虑到连接效率不高以及连接产物不纯，本实验又以连接产物为模板，4CL：：RS-F1、4CL：：RS-R2为引物进行PCR扩增，反应体系如表10，PCR反应程序如图5。
表204CL：：RS基因PCR扩增
Tab.10ThePCRamplificationsystemforthe4CL：：RSgene
PCR扩增终止后，将PCR产物经1％的凝胶进行检测，并对结果进行分析。按照2.2.3.2步骤回收基因片段4CL：：RS，回收片段连接到pMD19-T载体并转化JM109感受态。无菌条件下，挑取单克隆阳性菌落至新鲜培养基恒温培养12h(37℃，200rpm)后送至公司进行测序。
2.4pET-30a/4CL：：RS的构建及其转化
2.4.1双酶切反应
选取上述测序正确的菌株，按照前述方法提取重组质粒pMD19-T/4CL：：RS。重组质粒pMD19-T/4CL：：RS与原核表达载体pET-30a分别经NcoI和EcoRI双酶切。反应体系见表21，22。
表21pMD19-T/4CL：：RS双酶切反应
表22pET-30a双酶切反应
在37℃条件下酶切反应3h。参照2.2.6.2的方法对上述各个产物分别进行纯化回收。
2.4.2连接并转化
将上述纯化的pMD19-T/4CL：：RS酶切片段与pET-30a酶切片段按3∶1的比例在T4连接酶作用下连接。反应体系见表23。
表23pET-30a/4CL：：RS连接反应
16℃连接过夜，转化方法及步骤参照拟南芥。
2.5pET-30a/4CL：：RS的阳性鉴定
2.5.1菌液PCR鉴定
方法及步骤参照拟南芥。
2.5.2酶切鉴定
经菌液PCR鉴定为阳性的菌株按1∶50重新过夜培养后，按前述步骤提取重组质粒pET-30a/4CL：：RS，然后分别经过NcoI单酶切、EcoRI单酶切和NcoI与EcoRI的双酶切鉴定。
NcoI单酶切反应体系见表24，EcoRI单酶切反应体系见表25，NcoI与EcoRI双酶切反应体系见表26。
37℃水浴反应3h，酶切产物纯化回收后用1％琼脂糖凝胶检测。
4.2.5.3测序分析
将上述初步鉴定为阳性的菌液质粒送至公司进行测序。
表24pET-30a/4CL：：RS的NcoI酶切反应
表25pET-30a/4CL：：RS的EcoRI酶切反应
表26pET-30a/4CL：：RS的NcoI与EcoRI双酶切反应
2.6融合基因的诱导表达及其纯化
2.6.1诱导表达
将上述鉴定为阳性的重组菌以1∶50的比例接种于5mL新鲜的LB培养基(Kan+，30mg/L)中，过夜培养。然后又将培养物扩培至新鲜且预热的培养基中，恒温培养4h(37℃，200rpm)后添加外源诱导剂IPTG至终浓度为0.3mM，28℃诱导温度条件下诱导表达8h。
2.6.2融合蛋白的纯化
使用pET-30a表达载体，会使得表达的融合蛋白含有His标签，这种标签为检测与纯化蛋白提供了方便。ProteinIsoTMNi-NTAResin是螯合金属Ni2+而形成的一种亲和层析介质。该产品中的金属Ni2+对融合蛋白中的His标签具有特异吸附能力，从而使含有His标签的蛋白通过与金属Ni2+结合之后被分离纯化。本实验具体步骤如下：
(1)样品的准备：约取50mL诱导菌液，4000rpm离心5min，尽可能地弃去上液；加5mL的PBS溶液涡旋后立即置于冰上；菌液在冰水浴上超声破碎至透明；缓慢地将超声至透明的液体移至新的灭菌离心管中，然后高速离心30min(13000rpm，4℃)，尽可能的将上清液移至新的离心管中；室温条件下，小心地向离心管中加入适量的饱和硫酸铵溶液(盐析表达蛋白)；待上清蛋白完全沉淀下来之后，小心地将溶液过滤去除，加入50mL的平衡缓冲液，使上清蛋白沉淀重新溶解；上样前需经0.45μm的过滤膜过滤。
(2)装柱与平衡：将25mL柱介质溶液充分混合均匀后，缓慢地加入到柱中。用100mL的平衡缓冲液平衡柱子。
(3)上样与洗涤：将过滤后的样品缓慢地加入到柱子中，冰浴上轻摇1h后用100mL的平衡缓冲液洗涤层析柱。
(4)洗脱：洗涤结束后，用50mL的洗脱缓冲液洗脱层析柱，收集流出液。
(5)检测：在200μL的离心管中分别取10μL纯化前后的蛋白样品液，然后分别加入10μL的2×SDS上样缓冲液，全部煮沸3min后经蛋白胶检测。
2.7Westernblot分析
提取总蛋白后配制蛋白胶，根据融合基因编码的氨基酸序列，预测融合蛋白的大小应该在104kDa左右，故分离胶的浓度应采用8％，浓缩胶仍然采用5％。10mL8％的分离胶配方如表4-15，4mL5％的浓缩胶配方如表27。待分离胶凝聚后，慢慢倒出重蒸水并用滤纸充分吸干，然后将充分摇匀的浓缩胶加入到玻璃板中，迅速将样品梳插入。
表278％分离胶的配方
2.7.3SDS-PAGE电泳：
(1)点样：将已处理好的蛋白样品分别以5μL样品，10μL样品，15μL样品，20μL样品顺序加入加样孔中，此时选择的预染蛋白分子量Marker的加样量为7μL；
(2)电泳：浓缩胶80V，分离胶120V电泳，至前沿1-2cm时停止。
2.7.4转膜
(1)电泳结束后，小心的将玻璃板撬开，去除浓缩胶后在分离胶的右上角切去一小块作为标记，用转移缓冲液湿润凝胶；
(2)根据得到分离胶的大小，小心地剪取滤纸和PVDF膜，剪取过程中应保证与最终分离胶的大小相一致。将剪取的滤纸和PVDF膜首先在甲醇溶液中浸泡5min，然后转移至电转缓冲液中浸润平衡30min，备用；
(3)将转移夹板的黑色底板(负极)朝下，依次放海绵垫、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵垫，注意每层之间都要将气泡赶尽；
(4)向电转槽内加入适量的电转缓冲液，盖紧槽盖，连通电源。同时要将整个电转装置放入冰浴(或4℃冰箱)，80V恒压电转1h；
(5)电转后，观察预染蛋白分子量Marker的转移情况分析目标蛋白是否转移完全。
2.7.5Westernblot
(1)封膜：将电转完毕的PVDF膜标记后，转移至封闭液中室温振摇封闭2h；
(2)一抗孵育：用滤纸将经过封膜之后PVDF膜的残留液除尽。将膜正面朝上放入杂交袋中，用一抗[His抗体sc-803]进行杂交。4℃孵育过夜，在平皿中用TBST溶液漂洗3次，每次10min；
(3)二抗孵育：将膜正面朝上放入另一杂交袋中，加入二抗[ProteinFindGoatAnti-MouseIgG(H+L)，HRPConjugate]稀释液(1∶1000)，室温条件下振荡孵育1h后，在平皿中用TBST溶液漂洗3次，每次10min。取出膜，在滤纸上沥干TBST缓冲液；
(4)ECL发光：将膜浸入发光液(临用前配制)，室温孵育3min，曝光照相。
3、结果与分析
3.14CL：：RS融合基因的克隆
分别将PCR扩增得到的基因片段I和基因片段II进行琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示基因片段I序列大小约为1700bp，这与理论上将4CL基因去除终止密码子TGA，上游引入NcoI酶切序列和下游引入15bp(含BamHI酶切序列)的一段Linker核苷酸序列之后得到的基因片段大小相符。电泳图还显示基因片段II序列大小约为1200bp，这与理论上将RS基因去除起始密码子ATG，上游引入30bp(含BamHI酶切序列)的另一段Linker核苷酸序列和下游引入EcoRI酶切序列之后得到的基因片段大小相符。分别将这两个基因片段割胶回收，经过BamHI单酶切后进行过夜连接，最后以连接产物为模板，4CL：：RS-F1、4CL：：RS-R2为引物进行扩增，得到的片段经琼脂糖凝胶电泳检测(图6)，电泳图显示得到的片段大小为2913bp，这与理论设计的4CL：：RS融合基因序列大小相一致，割胶回收4CL：：RS融合基因片段。
3.24CL：：RS融合基因的序列分析
测序结果表明，4CL：：RS融合基因全长为2895bp，包括去除终止密码子的4CL基因片段(1693bp)、去除起始密码子的RS基因片段(1167bp)以及柔性linker的45个核苷酸，与原设计一致。DNAMAN软件分析构建的4CL：：RS融合基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序，加框的ATG为4CL：：RS融合基因的起始密码子，中间45个加框序列为linker的核苷酸序列，下划线序列CCATGG，GGATCC，GAATTC分别代表着NcoI、BamHI和EcoRI酶切位点。进一步分析表明4CL：：RS融合基因共编码964个氨基酸，分子量(Mr)为104.7kDa，pI为5.63。
3.3原核表达载体的鉴定
3.3.1菌液PCR鉴定
菌液PCR鉴定结果经琼脂糖凝胶电泳检测(图7)，阴性对照扩增片段大小为410bp，表明空载体上T7上下游引物之间序列为410bp，菌液与连接产物扩增片段大小都为3381bp，与融合基因序列及酶切序列对比表明原核表达载体已构建成功。
3.3.2酶切鉴定
提取经菌液PCR鉴定为阳性的菌株质粒，分别经NcoI与EcoRI单酶切及其双酶切反应，酶切结果经琼脂糖凝胶电泳检测(图8)：重组质粒单酶切片段大小为8303bp，双酶切片段大小分别为：5408bp和2895bp，前者与双酶切pET-30a空载体得到的片段相符，后者与融合基因4CL：：RS片段大小相符，进一步验证了构建成功的原核表达载体。
3.3.3测序鉴定
将上述初步鉴定为阳性的菌液送至测序公司进行测序。测序结果表明，融合基因4CL：：RS已成功地通过NcoI与EcoRI酶切位点连接到pET-30a原核表达载体。
3.44CL：：RS融合基因的诱导表达
通过外源添加蛋白表达诱导剂(IPTG)对目的融合蛋白进行诱导表达，SDS-PAGE电泳检测(图9)，电泳图结果表明重组菌诱导表达的融合蛋白分子量约为105kDa，这与利用相关软件分析预测的融合蛋白分子量大小相一致。收集表达后的菌体，低温超声破碎后，4℃，13000rpm离心30min，将上清液通过ProteinIsoNi-NTAResin纯化，收集纯化后的蛋白并通过SDS-PAGE胶检测分析(图10)。
3.5Westernblot分析
将构建的重组菌在28℃诱导条件下诱导表达8h，收集表达的蛋白经过Westernblot分析，结果如图10所示。结果表明胶图中有一条亮带，分子量约为105kDa，这进一步说明了构建的原核表达载体pET-30a/4CL：：RS成功地表达出了目的融合蛋白，这为后面的重组菌发酵制备白藜芦醇提供了基础。
实施例2利用重组菌株发酵制备白藜芦醇的方法
使用的菌株是实施例1所构建的重组菌株BL21(DE3)，并携带重组质粒pET-30a/4CL：：RS。
1、白藜芦醇标准曲线的建立
精确称取白藜芦醇标准品0.0010g溶解于色谱甲醇中，并用色谱甲醇定容至1mL，即为1000mg/L的标准品溶液，并按照比例与色谱甲醇混合配成浓度分别为1mg/L，5mg/L，10mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L的标准品溶液。经过高效液相色谱测定，测定方法见5.2.1，每个浓度做3个重复，记录白藜芦醇浓度与峰面积的数据。最后，根据实验结果建立了白藜芦醇标品的色谱峰面积与其浓度的线性回归方程(图11)，这为后续发酵试验定量分析白藜芦醇的浓度提供了理论依据。
2、重组菌发酵合成白藜芦醇
2.1重组菌种的活化
重组菌的活化就是将低温保存的甘油重组菌重新接种于新鲜且预热的培养基(含相应抗生素)中扩大培养，通过多次扩培筛选后得到生长良好、菌种单一与状态稳定的目的重组菌。活化后的重组菌可以通过菌液PCR、酶切反应以及测序来鉴定所得到的重组菌是否发生变异。具体活化操作如下：
(1)将-80℃保存的甘油菌立即放置在38℃-40℃水浴中，不断摇动直至全部融化成液状；
(2)无菌条件下，用接种环将少量融化的菌种划线在含有硫酸卡钠霉素的平板上；
(3)将划线后的平板密封后(可用封口膜)，37℃条件下静置15min(吸收菌液)，
最后将其在37℃的恒温培养箱中倒置培养12h后观察菌落；
(4)无菌条件下，挑取平板上的单菌落至1mL的LB体培养基(Kan+，30mg/L)，在37℃，200rpm条件下过夜培养。
活化后的重组菌液应该放置在4℃冰箱中保存，为后续的发酵实验做准备。若重组菌液保存时间超过一周，需重新扩培活化与鉴定。
2.2发酵转化及其产物的提取
通过第四章的研究，我们已经得到了能够表达目的融合蛋白4CL：：RS的重组菌株。然而，对于表达的融合蛋白4CL：：RS是否具有对香豆酰辅酶辅酶A以及白藜芦醇合酶的双重催化活性，我们需通过底物的转化或发酵产物的生成来检测。本实验中添加的底物为对香豆酸(终浓度为1mM)，通过酶促转化以后可以形成白藜芦醇。利用HPLC检测产物中是否有白藜芦醇的生成以及生成的含量。最后，通过白藜芦醇的产量计算出对香豆酸的转化率。Watts等[76]研究发现，在重组大肠杆菌中构建苯丙烷代谢途径时，经过发酵转化以后，仅有不超过5％的代谢产物存在于微生物细胞中，其余大部分都存在于发酵液中。因此，本研究在分析白藜芦醇的产量时，首先将适量的重组菌发酵液离心，然后对其上清液的成分进行分析。发酵实验过程具体如下：
(1)无菌条件下，将500μL活化后的重组菌液按1∶50的接种比例接种至50mL新鲜且预热的LB培养基(Kan+，30mg/L)；
(2)37℃，200rpm的恒温培养箱中培养2h(OD600值约为0.2)；
(3)在200μLDMSO中溶解0.00821g的对香豆酸，摇匀充分溶解；
(4)在无菌条件下，将上述配置的对香豆酸溶液全部加入到发酵菌液中，此时对香豆酸的终浓度为1mM；
(5)28℃，200rpm的恒温培养箱中发酵培养48h；
(6)充分摇匀发酵液，无菌条件下取1mL发酵液放置于1.5mL的离心管中，13000rpm离心3min；
(7)小心将上清液转至新的离心管中并添加50μL的HCl(1M)，-20℃冷冻过夜；
(8)室温条件下，将冷冻离心管缓慢解冻并加入1mL的乙酸乙酯萃取，重复3次；
(9)萃取结束后，将乙酸乙酯相合并并用氮吹仪小心地将其吹干；
(10)最后将所得残留成分溶解于1mL的色谱甲醇中，进样前置于-20℃保存。
3结果及分析
3.1高效液相色谱检测及紫外吸收
图12a为白藜芦醇标品的色谱图，在保留时间为13min左右时有一明显的色谱峰，对应的紫外吸收波长为305.7nm(图13a)。
图12b为重组菌发酵产物色谱图，保留时间为8min时有一明显的色谱峰，其对应的紫外吸收波长为310.4nm(图13b)，与对香豆酸标准品的色谱图及紫外吸收图对比，表明此峰代表的是对香豆酸，即未转化的底物。在色谱图12b中，洗脱时间约为13min时还有一个明显的色谱峰，该色谱峰的洗脱时间和对应的紫外吸收波长通过与白藜芦醇的标准品相对比，证实了发酵产物中含有白藜芦醇。
实验结果表明，本研究构建的重组菌株所表达的融合蛋白4CL：：RS具有很好的催化活性，能够催化底物对香豆酸转化为白藜芦醇。
3.2白藜芦醇的产量及其转化率
3.2.1白藜芦醇的产量
通过对发酵产物的色谱图及紫外吸收图进行分析，我们已经证实了重组菌的发酵液中含有白藜芦醇。至于发酵产物中白藜芦醇的含量可以根据色谱峰的峰面积并结合建立的白藜芦醇标准曲线求得。对重组菌发酵产物的色谱峰进行手动积分三次，所得平均峰面积为2005281，由白藜芦醇的标准曲线可以得到产物的进样浓度为80.524mg/L。根据样品提取时每步所对应的稀释倍数，推算出原发酵液中白藜芦醇的浓度为80.524mg/L，即摩尔浓度为0.3528mM。
5.3.2.2白藜芦醇的摩尔转化率
利用重组微生物将底物生物转化为目标产物时，为了衡量重组菌的生物转化能力需要对底物的利用率做出计算。白藜芦醇的摩尔转化率是指在白藜芦醇的生物合成过程中，单位摩尔的对香豆酸经过重组菌发酵转化以后生成白藜芦醇的摩尔数。本研究中，所使用的底物浓度为1mM，而发酵液中白藜芦醇的摩尔浓度为0.3528mM。根据此定义，可以计算出本研究的白藜芦醇的摩尔转化率为35.28％。