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1、(10)申请公布号 CN 102994484 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102994484 A *CN102994484A* (21)申请号 201210544806.8 (22)申请日 2012.12.17 C12N 9/42(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 福建农林大学 地址 350002 福建省福州市仓山区建新镇金 山学区 (72)发明人 邱君志 苏礼超 李小霞 涂洁 宋飞飞 邱云锋 郭庆丰 何肖云 毛丽慧 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (54) 发明名称 一种扁座壳孢。
2、发酵生产几丁质酶的培养基及 方法 (57) 摘要 本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺， 更具 体地， 涉及一种扁座壳孢发酵生产几丁质酶的培 养基及方法。所述培养基的原料含有 1w% 可溶性 淀粉或葡萄糖， 1w% 蛋白胨或酵母粉， 410-4mol/ LBa2+或 Ca 2+， 0.01w%Vc 或 VB 1，培 养 基 初 始 pH=5.5-7.0。该方法通过将发酵种子液接种于所 述培养基中， 250mL 的三角瓶装液量为 50mL， 接种 量 15mL， 于 26， 转速 160r/min 下培养。本发明 的发酵方法具有发酵周期短 ； 条件温和， 易于控 制 ； 提供的用于扁座壳孢发酵生产几。
3、丁质酶的培 养基， 具有几丁质酶产率高， 几丁质酶活力高等优 点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种扁座壳孢发酵生产几丁质酶的培养基， 其特征在于， 所述培养基的原料含有 1w% 可溶性淀粉或葡萄糖， 1w%蛋白胨或酵母粉， 410-4mol/L Ba2+或Ca2+， 0.01w%Vc或VB1， 培养基初始 pH=5.5 7.0。 2. 根据权利要求 1 所述的一种扁座壳孢发酵生产几丁质酶的培养基， 其特征在于， 所 。
4、述培养基的原料按重量分数计， 含有 1w% 可溶性淀粉， 1w% 蛋白胨， 410-4mol/L Ba2+， 0.01 w %Vc， 培养基初始 pH=7.0。 3. 一种扁座壳孢发酵生产几丁质酶的方法， 其特征在于， 所述方法包含以下步骤 ： （a） 将扁座壳孢接种种子培养基， 制得发酵种子液 ； （b） 将步骤 （a） 中制得的发酵种子液接种于如权利要求 1 或 2 所述的培养基， 250mL 的 三角瓶装液量为 50mL， 接种量 15mL， 于 26， 转速 160 r/min 下培养。 4. 如权利 3 所述扁座壳孢发酵生产几丁质酶的方法， 其特征在于， 所述种子培养基的 原料含有 。
5、： 200g/L 土豆， 葡萄糖 20g/L。 权 利 要 求 书 CN 102994484 A 2 1/6 页 3 一种扁座壳孢发酵生产几丁质酶的培养基及方法 技术领域 0001 本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地， 本发明涉及一种扁座壳孢发酵 生产几丁质酶的培养基及方法。 背景技术 0002 扁座壳孢(Aschersonia placenta Berk. et Br.) 是子囊菌门、 粪菌纲、 肉座菌 目、 麦角菌科、 座壳孢属的一个种， 主要寄生在粉虱和介壳上， 在南亚和东南亚等地方都有 分布。在我国南方等省的自然生境和农业生态系统中造成粉虱群流行病， 从而可以控制粉 虱类害虫的。
6、发生与危害。 0003 几丁质酶在微生物中的分布情况， 细菌中有粘质沙雷氏菌， 环状芽孢杆菌， 地衣芽 孢杆菌， 斯氏假单孢菌， 巨大芽孢杆菌， 液化沙雷氏菌， 液化肠杆菌， 嗜水气单孢菌等。放线 菌中有灰色链霉菌， 红色链霉菌及其它一些未定种的链霉菌。真菌中有溜曲霉， 球孢白僵 菌， 米曲霉和木霉等 （关海宁等， 2006） 。从植物、 动物、 真菌和细菌中都能获取几丁质酶， 但 由于细菌具有快速生长和易进行基因操作的特性而倍受人们青睐。 目前报道的产几丁质酶 细菌类型很多 （杨水英等， 2007） 。在真菌几丁质酶相应领域也报道了一些研究结果。肖炎 农等对植物线虫卵寄生真菌淡紫拟青霉 (P。
7、aecilomyces lilacinus) 几丁质酶研究， 翟逸 对莱氏野村菌 (Nomuraea rileyi)CQ031021 几丁质酶的研究， 张洁等球孢白僵 (Beauveria bassiana)Bb174 以麸皮 : 蚕蛹粉 (4:1)、 蛋白胨 1g/L 作为产酶最适培养基， 在 7.5 g 培养 基中接种 3ml 液态种子， 自然 pH 下 28培养 2d , 酶活可达最高， 为 126U/g ( 干培养基 )。 0004 目前， 对虫生真菌几丁质酶的应用主要集中在对害虫的生物防治和几丁质、 壳聚 糖等生物资源的开发利用方面。在生物防治方面， 主要通过基因工程方法来克隆表达一。
8、些 具有很强的致病作用的真菌几丁质酶， 或者通过将虫生真菌几丁质酶基因构建转化到植株 中来提高植物对虫害的抗性， 在这两方面都已经取得了较大进展。 国内、 外已经对很多虫生 真菌的几丁质酶基因进行了克隆， 特别是白僵菌、 绿僵菌和蜡蚧菌的几丁质酶表现出良好 的致病性作用。这些研究的目的是为了解决昆虫病原真菌杀虫速率缓慢的弱点， 以期从分 子生物水平上提高菌株的杀虫毒力， 在最大程度上发挥真菌在害虫控制上的优势及潜力。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种扁座壳孢发酵生产几丁质酶的培养基及方法。 0006 本发明首先提供了一种扁座壳孢发酵生产几丁质酶的培养基， 所述培养基的原 料含有 1。
9、w% 可溶性淀粉或者葡萄糖， 1w% 蛋白胨或者酵母粉， 410-4mol/L Ba2+或者 Ca2+， 0.01w%Vc 或者 VB1， 培养基初始 pH=5.5-7.0。 0007 更优选地， 所述培养基的原料按重量分数计， 1w% 可溶性淀粉， 1w% 蛋白胨， 410-4mol/L Ba2+， 0.01w%Vc， 培养基初始 pH=7.0。 0008 其次， 本发明还提供了一种扁座壳孢发酵产几丁质酶的方法， 所述方法包含以下 步骤 ： 说 明 书 CN 102994484 A 3 2/6 页 4 （a） 将扁座壳孢接种种子培养基， 制得发酵种子液 ； （b） 将步骤 （a） 中制得的发。
10、酵种子液接种于所述的培养基， 250mL 的三角瓶装液量为 50mL， 接种量 15mL， 于 26， 转速 160 r/min 下培养。 0009 所述种子培养基的原料含有 ： 200g/L 土豆， 葡萄糖 20g/L， 自然 pH。 0010 本发明采用的座壳孢为扁座壳孢 ( 何学友等， 油茶黑胶粉虱及扁座壳孢对其自然 控制作用， 中国森林病虫， 2011 年 7 月 )。 0011 采用本发明优化后的培养基， 菌龄 4d， 发酵周期 4d， 发酵产生结果扁座壳孢产几 丁质酶的酶活为 4.0U/mL 以上。 0012 本发明的发酵方法有发酵周期短 ； 条件温和， 易于控制 ； 提供的用于扁。
11、座壳孢发 酵生产几丁质酶的培养基， 具有几丁质酶产率高， 几丁质酶活力高等优点。 附图说明 0013 图 1 为 NAG 标准曲线 ； 图 2 为不同碳源对产酶的影响 ； 图 3 为不同氮源对产酶活性的影响。 具体实施方式 0014 本发明用下列实施例来进一步说明本发明， 但本发明的保护范围并不限于下列实 施例。 0015 实施例 1 单因素实验确定培养基最优成分 （1） 种子培养和基础培养基的配制 ： 土豆 200g， 葡萄糖 20g， 蒸馏水定容至 1000mL， 自然 pH， 分装于 250mL 的三角瓶， 每个三角瓶含 150mL。1.01MPa， 灭菌 20min。 0016 （2）。
12、 发酵种子的制作 ： 将扁座壳孢接种于土豆琼脂培养基上， 于 25下培养 5d， 待 其产孢子， 即活化 ； 将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基， 26， 转速 160 r/min 下培养 4d， 即为发酵液。 0017 （3） 酶液的制备 ： 取步骤 （2） 中的发酵液在 4下， 5000 r/min 离心， 15min， 得上清 液即为粗酶液， 待用。按酶活性测定在波长 550nm 处测定吸光值。换算成酶活单位 U/mL。 0018 （4）几丁质酶酶活测定 ： 取 1mL 发酵上清液加入 1mL 磷酸盐缓冲液 （0.2mol/L） （pH7.0） 和 50mL 5% 胶体几丁质。
13、中 （以不加胶体几丁质的上清液作为对照） ， 37水浴 1h， 加 入 2mL DNS（二硝基水杨酸） （浓度为 0.025 mol/L， 下同） 试剂终止反应， 沸水浴 10min 后 冷却， 离心后取上清液在波长 550nm 下测紫外吸光度， 计算出产生的 N- 乙酰氨基葡萄糖的 含量。酶活力 （U/g 或 U/mL） =AKVn/(tm)（A 为样品的吸光度 ； K 为吸光常数 ； V 为 反应试剂的总体积 ； n 为酶液的稀释倍数 ； t 为反应时间 ； m 为酶液质量或体积， g 或 mL） 。 0019 （5） 标准曲线的制作 ： N- 乙酰葡萄糖胺 （NAG） 标准曲线的制定 ：。
14、 在 0 100g/mL 范围内， 以 550nm 处的吸光值为横坐标 （X） 、 N- 乙酰葡萄糖胺 （NAG） 的浓度为纵坐标 （Y） 制 定标准曲线。具体步骤如下 ： a. 用超纯水配置浓度为 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90 和 100g/mL 的 NAG ； b. 取上述浓度的 NAG 溶液各 1mL 分别与 2mL DNS 显色剂混合并沸水浴 10min ； 说 明 书 CN 102994484 A 4 3/6 页 5 c. 反应完毕后， 测定反应液在 550nm 处的吸光值， 在上述反应体系中以超纯水取代 NAG 为空白对照。试验设置 3 个重。
15、复， 其平均值用于制作标准曲线。根据待测样的吸收值在 标准曲线上找到相应 NAG 的量， 便可计算出样品中几丁质酶的活性。结果见图 1。 0020 （6） 不同碳源、 氮源对产几丁质酶的影响 （a） 碳源对酶产量的影响， 在粉状几丁质 2% (w/v） 、 KH2PO4 0.1 w %、 MgSO47H2O 0.05 w %、 NaCl 0.02 w %、 pH6.5 的培养基中分别添加 1% 的蔗糖、 葡萄糖、 可溶性淀粉、 D- 山梨 醇、 麦芽糖、 胶体几丁质、 L- 阿拉伯糖、 海藻糖， 分别接入 5mL 的扁座壳孢菌液， 在 26、 160 r/min 的摇床中培养 4d， 检测发酵。
16、液中几丁质酶活性。结果见图 2。 0021 （b） 氮源对酶产量的影响， 在粉状几丁质 2% (w/v） 、 KH2PO4 0.1 w %、 MgSO47H2O 0.05 w %、 NaCl 0.02 w %、 pH6.5 的培养基中分别添加 1% 的酵母浸粉、 蛋白胨、 牛肉浸膏、 干酪素、 KNO3、 (NH4)2SO4、 NH4Cl、 Ca(NO3)2， 分别接入 5mL 的扁座壳孢菌液， 在 26、 160 r/min 的摇床中培养 4d， 检测发酵液中几丁质酶活性。结果见图 3。 0022 结果 ： 碳源对酶产量的影响的实验结果 ： 从图 2 分析， 不同碳源对扁座壳孢产几丁质酶有不。
17、 同的影响， 不同处理产酶活性分别是 ： 葡萄糖 1.39 U/mL、 可溶性淀粉 1.35 U/mL、 麦芽糖 0.70 U/mL、 L- 阿拉伯糖 0.59 U/mL， 最低的是海藻糖酶活 0.45 U/mL， 最高的葡萄糖是最低 的将近 3 倍， 所以葡萄糖对扁座壳孢产几丁质酶有较大的影响 （图 2） 。 0023 氮源对酶产量的影响的实验结果 ： 从图 3 分析， 不同的氮源对扁座壳孢产几丁质 酶的影响不同， 产酶最大的蛋白胨达到了酶活最高值为 1.69 U/mL， 酵母粉、 NH4Cl、 干酪素 酶活分别是 1.39 U/mL、 1.38 U/mL、 1.10 U/mL， 最低的是 。
18、(NH4)2SO40.49 U/mL， 有机氮源比 无机氮源更有利于扁座壳孢产几丁质酶。因此， 蛋白胨为扁座壳孢产酶的最佳氮源 （图 3） 。 0024 实施例 2 正交实验确定最优发酵条件 （1） 正交实验确定最佳培养基 分别选取不同碳源、 氮源、 金属离子、 维生素和 pH 值 （表 1） ， 配置不同的培养基， 方法同 实施例 1 中步骤 （1） 、（2） 。见表 1， 将相同量的接种量 （10%） 菌种接种于 250mL， 装有 50mL 培养液， 在 26， 转速 160 r/min 下培养培养 4d。然后按实施例 1 步骤 （3） 、（4） 测定酶活。 为了避免累赘实施例中的培养基。
19、配法、 粗酶液的制作、 酶活测定方法均与实施例 1 的方法 相同。 0025 表 1 扁座壳孢几丁质酶五因子四水平 （45） 正交实验设计 说 明 书 CN 102994484 A 5 4/6 页 6 表 2 扁座壳孢几丁质酶五因子四水平 （45） 正交实验设计实验结果 注 :K1 为各因素水平 1 的所有酶活力之和， K2 为各因素水平 2 的所有酶活力之和， K3 为各因素水平 3 的所有酶活力之和， K4 为各因素水平 4 的所有酶活力之和， R 为极差， 酶活 力的数字代表 3 次重复的平均值 (mean) 标准差 (S.D)。 0026 正交实验中， 筛选出了较有利于产酶的培养基。最。
20、高酶活力达到 2.63U/mL， 相应 水平的碳源、 氮源、 金属离子、 维生素、 pH 分别是可溶性淀粉、 蛋白胨、 Ba2+、 Vc、 pH7.0， 即 A2B1C2D3E4。正交实验结果分析该培养基最有助于产酶 ( 表 1)。从表 1 可见， 氮源对产酶影 响最大， pH 的改变对产酶作用最小。 0027 正交实验确定最优培养条件 在从正交实验确定的最优培养基的基础上， 通过设定不同接种量， 装液量， 菌龄， 培养 说 明 书 CN 102994484 A 6 5/6 页 7 时间 （见表 3） ， 在 26， 转速 160 r/min 下培养。然后按实施例 1 步骤 （3） 、（4） 。
21、测定酶活。 为了避免累赘实施例中的培养基配法、 粗酶液的制作、 酶活测定方法均与实施例 1 的方法 相同。 0028 表 3 扁座壳孢几丁质酶四因子三水平 （34） 正交实验 表 4 扁座壳孢几丁质酶四因子三水平 （34） 正交实验设计实验结果 注 : K1 为各因素水平 1 的所有酶活力之和， K2 为各因素水平 2 的所有酶活力之和， K3 为各因素水平 3 的所有酶活力之和， R 为极差， 酶活力的数字代表 3 次重复的平均值 (mean) 标准差 (S.D)。 0029 总结了 4 个因子 ( 接种量、 装液量、 菌龄、 培养时间 ) 对扁座壳孢几丁质酶产生的 影响。由表 4 可知， 。
22、最高酶活力达到 4.06U/mL， 其相应的实验条件 A1B2C2D2( 接种量 5ml， 装 液量 80ml， 菌龄 4d， 培养时间 4d)。但由表 4 可见， 正交实验分析结果表明最有利于产酶的 条件是 A3B1C2D2， 即有利于产酶的接种量、 装液量、 菌龄和培养时间分别为 15mL、 50mL、 4d 和 4d。由表 4 的极差 R 值可知， 培养条件中， 装液量 (14.7 ml) 对产酶影响最大， 相对而言， 接 种量对产酶作用最小。 说 明 书 CN 102994484 A 7 6/6 页 8 0030 实施例 3 扁座壳孢产几丁质酶发酵方法 （1） 发酵种子的制备 （A） 。
23、菌种和培养基 菌种 ： 扁座壳孢 ； 斜面培养基 ： PDA 培养基 ； 液体种子培养基 ： 土豆200g， 葡萄糖20g， 蒸馏水定容至1000mL， 自然pH， 1.01MPa， 灭菌 20min。 0031 （B） 种子液制备 将斜面上的纯种扁座壳孢转接到多个 250mL 三角瓶中， 其中装有 100mL 培养基， 然后 在27， 在往复式震荡摇床转速160 r/min下培养培养4d， 带菌丝生长健壮， 菌液呈粘稠状 时， 说明种子已经生长好了。 0032 （2） 发酵培养 发酵培养基 ： 按照培养基优化正交实验结果配制， 即 1g 可溶性淀粉， 1g 蛋白胨， 0.083g BaCl2。
24、 (410-4mol/L Ba2+)， 0.01g Vc， 蒸馏水定容至 1000mL， pH 7.0， 1.01MPa， 灭 菌 20min。 0033 将上一步骤中制备的扁座壳孢发酵种子液， 按培养条件正交实验得出的最佳条 件， 接种量 15mL 接种于 250mL 三角瓶中， 瓶中装有 50mL 发酵培养液 ； 摇床温度 ： 26 1， 转速 160 r/min ； 发酵周期 ： 4d ； 发酵产生结果 ： 扁座壳孢生产几丁质酶的酶活为 4.0U/mL 以上， 该实施例表明本发明 的摇瓶实验工艺良好。 说 明 书 CN 102994484 A 8 1/3 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102994484 A 9 2/3 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 102994484 A 10 3/3 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 102994484 A 11 。