一株酿酒酵母菌株及其应用 【技术领域】
本发明涉及一株酿酒酵母菌株及其应用。背景技术 酵母菌是一类单细胞真菌的总称， 并非系统演化分类的单元。酵母菌是人类文明 史中被应用得最早的微生物。目前已知有 1000 多种酵母菌， 根据酵母菌产生孢子 ( 子囊孢 子和担孢子 ) 的能力， 可将酵母分成三类 ： 形成孢子的株系属于子囊菌或担子菌， 不形成孢 子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌， 或者叫 “假酵母” (Kreger-van R， Groningen N Y.The yeasts ： a taxonomic study.Third revisedand enlarged edition[M].The Netherlands ： Elsevier science publishers B.V， 1984.)。 目前已知大部分酵母被分类到 子囊菌门。
酵母菌在自然界分布广泛， 主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中， 例如， 在水 果、 蔬菜、 蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见 ( 于景芝 . 酵母生产与应用手册 [M]. 中国轻工业出版社， 2005)。酵母营专性或兼性好氧生活， 目前未知专性厌氧的酵母。 在缺乏氧气时酵母进行无氧呼吸， 其中发酵型的酵母可以通过糖酵解途径 (EMP 途径 ) 将糖 类转化成为丙酮酸， 丙酮酸再被进一步转化成为二氧化碳和乙醇来获取能量 ( 王镜岩， 朱 胜庚， 徐长法 . 生物化学 ( 第三版， 下册 ). 北京 ： 高等教育出版社 .2002 ： 82)。在酒精工业 上， 利用发酵型的酵母无氧呼吸可产乙醇的特点， 将酵母可以利用的发酵性糖转化为酒精。
乙醇作为可再生能源， 可直接作为液体燃料或者同汽油混合使用， 燃料乙醇作为 新的燃料替代品， 可减少对不可再生能源 - 石油的依赖， 保障国家能源的安全。现行酒精工 业生产采用较多的是发酵法 ： 采用各种含糖 ( 双糖 )、 淀粉 ( 多糖 ) 的农产品或农林业副产 物为原料， 经过水解 ( 即糖化 ) 多糖转化为单糖后发酵、 或直接发酵双糖转化为乙醇。淀粉 质在淀粉酶类的作用下， 水解为葡萄糖， 再进一步发酵生成乙醇 ( 马赞华 . 酒精高效清洁生 产新工艺 [M]. 化学工业出版社， 2003)。
广西地处亚热带地区， 非粮经济作物甘蔗和木薯的种植面积和产量皆为全国第 一。甘蔗主要用于制糖， 糖蜜是甘蔗制糖的副产物， 含有大量酵母可发酵性糖。鲜木薯块 根的淀粉含量达 30％， 木薯淀粉经过 α- 淀粉酶液化和糖化酶糖化后转化为酵母可发酵性 糖 - 葡萄糖。糖蜜和木薯淀粉是酵母发酵产酒精的优良生产原料。2008 年， 广西中粮生物 质能源有限公司已在广西北海建成并投产以糖蜜和木薯为原料年产 20 万吨燃料乙醇的生 产设备。另外， 广西还有 2 家公司较大规模地以糖蜜和木薯为原料生产乙醇， 分别为位于钦 州市的新天德股份有限公司和位于平果县的平果凯特生物化工股份有限公司。
酿酒酵母是酒精工业发酵生产上常用的微生物菌种。 酒精工业生产中对菌株的要 求越来越高， 首先要求酵母菌具有极高的产酒效率， 对发酵性糖的转化率高， 不造成糖质原 料的浪费 ； 其次是发酵液成熟之后酒精含量高， 降低蒸馏能耗 ； 再次是发酵速度快， 提高设 备的利用率， 降低生产成本 ( 江宁 . 生物液体燃料——燃料酒精 [J].Chinese Journal of Nature， 2007， 29(1) ： 30-33)。 限制这三大要求的主要因素是酵母对高浓度发酵性糖和酒精
的耐受力、 对原料的转化率和对各种不利发酵条件 ( 如高温、 低 pH 和有毒物质等 ) 的耐受 力。 国内酒精工业生产中广泛应用的酿酒酵母为湖北安琪酵母股份公司生产的耐高温活性 干酵母 ( 安琪酵母， 简称为 AQ)， 虽然发酵特性较好， 但也难以满足工业上的更高要求。 发明内容
本发明的目的是提供一株酿酒酵母菌株及其应用。
本发明提供的酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)， 命名为 ZM1-5， 简称酿酒酵 母 ZM1-5 或 ZM1-5， 分离自广西壮族自治区钦州市果园土壤， 已于 2010 年 4 月 23 日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地址为 ： 北京市朝阳区北辰 西路 1 号院 3 号 )， 保藏号为 CGMCC No.3761。
酿酒酵母 ZM1-5 可用于生产酒精。
用于生产酒精时， 酿酒酵母 ZM1-5 可以单独使用， 也可与其它酿酒酵母混合使用。
应用所述酿酒酵母 ZM1-5 生产酒精时， pH 值为 3-9， 温度为 28-42℃。应用所述酿 酒酵母 ZM1-5 生产酒精时， pH 值优选为 4-5。应用所述酿酒酵母 ZM1-5 生产酒精时， 温度优 选为 28-40℃， 温度最优选为 32℃。 本发明还保护一种生产酒精的方法， 是通过发酵酿酒酵母 ZM1-5， 得到酒精。
所述方法中， 用于发酵的底物具体可为葡萄糖和 / 或蔗糖。
所述方法中， 用于发酵的底物可为木薯产品 ( 如木薯粉液化醪 )、 糖蜜和甘蔗汁中 的至少一种。
所述发酵的温度可为 32℃至 42℃中的任一温度， 如 32℃、 37℃、 40℃或 42℃。
所述发酵起始时， 所述酿酒酵母 ZM1-5 在发酵体系中的浓度可为 1.5×107 至 2.5×107 个细胞 /mL， 优选为 1.5×107-2.0×107 个细胞 /mL 或 2.0×107-2.5×107 个细胞 /mL， 如 1.5×107 个细胞 /mL、 2.0×107 个细胞 /mL 或 2.5×107 个细胞 /mL。
酿酒酵母 ZM1-5 具有以下生理特征 ： (1) 在酵母粉蛋白胨琼脂平板上 32 ℃培养 2-3 天， 菌落为乳白色、 隆起、 表面光滑、 边缘整齐 ； 细胞圆形或椭圆形， 无性繁殖方式为芽 殖； (2) 菌株最适生长和发酵温度 ： 32℃； pH 范围 ： 3-9 ； 最适生长 pH4-5 ； (3) 该菌株在 32℃、 37℃和 42℃的生长速率快于安琪酵母 ； (4) 该菌株能在 50％的葡萄糖培养基上生长 ； 该菌 株能在含有抑制物 ： 1.6mol/L NaCl、 16％乙醇、 4g/L 乙酸、 200μg/LG418 的 YPD 培养基上生 长； (5) 应用于以木薯粉液化醪、 糖蜜和甘蔗汁为原料发酵生产酒精时， 酒精产量和发酵效 率比目前工业生产用安琪耐高温活性干酵母高。
与现有工业生产常用的安琪耐高温酵母菌比较， 酵母菌株 ZM1-5 具有生长快、 酒 精产量高、 耐高温、 耐高糖、 耐高浓度乙醇和耐酸等多个优点。酿酒酵母 ZM1-5 可应用于以 木薯粉、 糖蜜和甘蔗汁等为原料的浓醪发酵产酒精工艺 ( 同步糖化发酵 ) 中， 解决工业生产 中酵母菌不能耐受高渗透压、 高浓度乙醇和发酵后期效率低等问题， 降低酒精工业生产的 成本。与安琪耐高温酵母菌相比， 酿酒酵母 ZM1-5 在高温条件下发酵具有更高的酒精产量。 酵母菌株 ZM1-5 用于同步糖化发酵产酒精工艺中， 有望解决浓醪发酵中底物浓度高 ( 渗透 压高 )、 发酵罐内温度高、 发酵后期酵母菌受高浓度酒精抑制等问题。
附图说明 图 1 为 ZM1-5 和 AQ 在各种高温条件下在 YPD 平板上的照片。
图 2 为 30℃时 ZM1-5 和 AQ 在各种浓度 NaCl 的 YPD 平板上的照片。
图 3 为 30℃时 ZM1-5 和 AQ 在各种浓度乙醇的 YPD 平板上的照片。
图 4 为 30℃时 ZM1-5 和 AQ 在各种浓度乙酸的 YPD 平板上的照片。
图 5 为 30℃时 ZM1-5 和 AQ 在各种浓度 G418 的 YPD 平板上的照片。
图 6 为 30℃时 ZM1-5 和 AQ 在 50％葡萄糖的 YPD 平板上的照片。
图 7 为 ZM1-5 和 AQ 在不同培养温度下在 YPD 平板上的形态 ； A： AQ 在 32℃的菌落 形态 ； B： ZM1-5 在 32℃的菌落形态 ； C： AQ 在 37℃的菌落形态 ； D： ZM1-5 在 37℃的菌落形态 ； E： AQ 在 42℃的菌落形态 ； F： ZM1-5 在 42℃的菌落形态。
图 8 为 ZM1-5 和 AQ 在电子扫描显微镜下的形态 ； A： AQ 在 32 ℃培养时细胞的显 微形态 ； B： ZM1-5 在 32℃培养时细胞的显微形态 ； C： AQ 在 42℃培养时细胞的显微形态 ； D： ZM1-5 在 42℃培养时细胞的显微形态。
图 9 为 ZM1-5 与 AQ 在不同 pH 条件下生长 24h 的菌体量比较。
图 10 为 ZM1-5 与 AQ 在不同温度条件下生长 20h 的菌体量比较。
图 11 为 ZM1-5 与 AQ 在不同温度条件下的生长曲线比较 ； A： AQ ； B： ZM1-5。
图 12 为 ZM1-5 与 AQ 在不同温度下发酵葡萄糖 72h 后的酒份比较。
图 13 为 ZM1-5 与 AQ 在不同温度下发酵蔗糖 72h 后的酒份比较。
图 14 为 ZM1-5 与 AQ 发酵木薯粉液化醪结果分析 ； A： 酒份 ； B： 活菌浓度 ； C： 残总 糖； D： 残还原糖。
图 15 为 ZM1-5 与 AQ 发酵甘蔗汁产物结果分析 ； A： 酒份 ( 灭菌甘蔗汁为底物 ) ； B： 酒份 ( 新鲜甘蔗汁为底物 ) ； C： 残糖含量 ( 灭菌甘蔗汁为底物 ) ； D： 残糖含量 ( 新鲜甘蔗汁 为底物 ) ； E： CO2 失重 ( 灭菌甘蔗汁为底物 ) ； F： CO2 失重 ( 新鲜甘蔗汁为底物 )。
图 16 为 ZM1-5 与 AQ 在不同温度下发酵甘蔗糖蜜结果分析 ； A： 酒份 ； B： CO2 失重。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。安琪酵母 (AQ， 耐高温活性干酵母 ) ： 购自湖北安琪酵母股 份公司。下述实施例中的％， 如无特殊说明， 均为质量百分含量。
YPD 培养基 (pH4.5) ： 酵母提取物 10g/L、 蛋白胨 20g/L、 葡萄糖 20g/L， 固体培养基 含琼脂 15g/L。
YPD+50％ Glu 培养基 (pH4.5) ： 酵母提取物 10g/L、 蛋白胨 20g/L、 葡萄糖 500g/L， 固体培养基含琼脂 15g/L。
YPD+20％ Glu 培养基 (pH4.5) ： 酵母提取物 10g/L、 蛋白胨 20g/L、 葡萄糖 200g/L， 固体培养基含琼脂 15g/L。
YPD+20％ Suc 培养基 (pH4.5) ： 酵母提取物 10g/L、 蛋白胨 20g/L、 蔗糖 200g/L， 固 体培养基含琼脂 15g/L。
实施例 1、 酵母菌株 ZM1-5 的获得一、 酵母菌株 ZM1-5 的获得
1、 样本采集
样品 ： 果园土壤。采集地点 ： 广西壮族自治区钦州市农村。
2、 酵母菌株的分离
采用稀释涂平板法进行分离 ： 称取 1g 土壤于 100mL 三角瓶中， 加入 10mL 灭菌蒸馏 水， 置于 28℃、 转速为 180rpm 的恒温摇床震荡 2 小时， 取 1mL 悬浊液稀释至 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5 稀释度， 各稀释梯度分别取 100μL 涂布 YPD 平板， 置于 32℃恒温培养箱培养 2 天 后挑出单菌落。
3、 酵母菌株的筛选
酵母菌的具体筛选步骤如下 ：
①观察平板上长出的菌落形态， 并镜检其细胞形态， 对其中确定为酵母菌的菌落 进行纯化， 纯化后作为备选菌株进行菌株耐高温生长试验 ；
②纯化后的菌株分别置于 32℃、 37℃、 42℃培养 3-5 天， 观察菌体生长情况， 选出 耐高温酵母菌株。
③各耐高温酵母菌株分别点接于 YPD 培养基上， 32℃培养 48 小时， 长出菌落后倒 入 TTC 上层培养基 ( 红四氮唑 TTC 0.05g， 葡萄糖 0.5g， 琼脂 1.5g， 水 100mL)， 避光保温 2-3h， 选出显色较深的酵母菌株。 ④ TTC 筛选得到的酵母菌株分别接入 YPD 液体培养基中， 28℃、 180rpm 摇床过夜培 养， 菌液按 OD600 ＝ 0.01 的终浓度接入带有杜氏小管的 YPD 液体培养基中， 分别置于 32℃、 37℃、 40℃、 42℃下培养， 分别在 12h、 24h 和 48h 观察和记录杜氏小管中产气情况， 选出产气 较多的酵母菌株。
⑤杜氏发酵检测产气快且多的菌株接入 50mLYPD 液体培养基， 28℃、 180rpm 摇床 培养 24h， 按 10％的接种量 ( 体积百分含量 ) 接入装有 100mL 含 YPD+20％ Glu 液体培养基 的 250mL 三角瓶， 发酵 72h 后蒸馏检测其酒精产量。
⑥酵母菌在各种培养基上的抗逆性生长检测
采 用 休 止 细 胞 梯 度 生 长 实 验， 将 酵 母 菌 接 种 于 20mL 的 YPD 液 体 培 养 基 中， 32 ℃ 培 养 12h(OD600 ＝ 0.7)， 离 心 收 集 菌 体， 制 备 休 止 细 胞。 调 节 菌 液 浓 度 为 OD600 ＝ 0 -1 -2 -3 -4 1.0， 并稀释至 10 、 10 、 10 、 10 、 10 的浓度， 分别取 4μl 点接于各种高渗透压培养基 [YPD+NaCl(1.2mol/L， 1.4mol/L， 1.6mol/L)， YPD+50 ％ Glu] 平 板， 以 及 YPD+ 乙 醇 (12 ％， 14 ％， 16 ％ )、 YPD+ 乙酸 (3g/L， 4g/L)、 YPD+G418(100μg/L， 200μg/L) 平板， 经 32 ℃培养 2-3 天， 观察菌落生长情况。本段中的％均为体积百分含量。
通过以上分离和筛选， 得到 33 株酵母菌， 其中一株各方面性状良好， 将其命名为 菌株 ZM1-5。
ZM1-5 和 AQ 在各种高温条件下在 YPD 平板上的照片见图 1。30℃时 ZM1-5 和 AQ 在各种浓度 NaCl 条件下在 YPD 平板上的照片见图 2。30℃时 ZM1-5 和 AQ 在各种浓度乙醇 条件下在 YPD 平板上的照片见图 3。30℃时 ZM1-5 和 AQ 在各种浓度乙酸条件下在 YPD 平板 上的照片见图 4。30℃时 ZM1-5 和 AQ 在各种浓度 G418 条件下在 YPD 平板上的照片见图 5。 30℃时 ZM1-5 和 AQ 在 50％葡萄糖条件下在 YPD 平板上的照片见图 6。
二、 酿酒酵母 ZM1-5 的鉴定
ZM1-5 分别在 YPD 平板上 32℃、 37℃、 42℃培养 2 天， 32℃、 37℃生长旺盛， 42℃也 能生长。菌落为乳白色、 隆起、 表面光滑、 边缘整齐 ( 见图 7)。显微镜下细胞圆形或椭圆形， 无性繁殖方式为多边芽殖 ( 见图 8)。
ZM1-5 可同化果糖、 棉子糖、 半乳糖、 麦芽糖、 纤维二糖、 蜜二糖、 海藻糖、 松三糖、 α- 甲基 D 葡萄糖苷、 N- 乙酰葡萄糖胺 ； ZM1-5 可同化硫酸铵、 硝酸钾 ； ZM1-5 可发酵葡萄糖、 蔗糖、 麦芽糖、 半乳糖， 不可发酵乳糖。
根据 ZM1-5 的形态与生理生化特征， 参考 《The Yeast》 和 《常见与常用真菌》 ， 将 ZM1-5 鉴定为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。将酿酒酵母 ZM1-5 保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.3761。
实施例 2、 酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 的最适生长 pH 值的比较
酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 采用完全相同的条件进行处理， 确定最适生长 pH 值。
1、 将酵母菌 ( 酿酒酵母 ZM1-5 或安琪酵母 AQ) 过夜培养， 检测菌液的 OD600 值。
2、 按 OD600 ＝ 0.01 终浓度将菌液接入不同 pH 值 (3、 4、 5、 6、 7、 8 或 9) 的 YPD 液体培 养基中， 28℃、 180rpm 培养 24 小时， 用分光光度计于 600nm 波长下测定光密度值 (OD600 值 )。 设置三次重复试验， 结果取平均值。 ZM1-5 与 AQ 生长 24h 的菌体量比较见图 9。 酿 酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 的最适生长 pH 均为 4-5。
实施例 3、 酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 的最适生长温度的比较
酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 采用完全相同的条件进行处理， 确定最适生长温度。
1、 将酵母菌 ( 酿酒酵母 ZM1-5 或安琪酵母 AQ) 过夜培养， 检测菌液的 OD600 值。
2、 按 OD600 ＝ 0.01 终浓度将菌液接入 YPD 液体培养基 (pH4.5) 中， 不同温度 (28℃、 32℃、 35℃、 37℃、 40℃或 42℃ )、 180rpm 培养 20 小时， 检测菌液的 OD600 值。
设置三次重复试验， 结果取平均值。 ZM1-5 与 AQ 在不同温度条件下生长 20h 的菌体 量比较见图 10。酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 的最适生长温度均为 32℃， 酿酒酵母 ZM1-5 在 28-42℃温度下生长量均比安琪酵母 AQ 高。
实施例 4、 酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 在不同温度下生长曲线的比较
酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 采用完全相同的条件进行处理， 比较不同温度下的 生长曲线。
1、 将酵母菌 ( 酿酒酵母 ZM1-5 或安琪酵母 AQ) 过夜培养， 检测菌液的 OD600 值。
2、 按 OD600 ＝ 0.01 终浓度将菌液接入 YPD 液体培养基 (pH4.5) 中， 分别不同温度 (28℃、 32℃、 35℃、 37℃、 40℃或 42℃ )、 180rpm 培养 72 小时， 分别在 4h、 16h、 22h、 28h、 48h、 68h 取样， 检测菌液的 OD600 值。
设置三次重复试验， 结果取平均值。ZM1-5 与 AQ 在不同温度条件下的生长曲线比 较见图 11。两者于 22h 基本达到稳定期， 22h 之后安琪酵母 AQ 在 32℃时的生长曲线趋于平 稳， 而酿酒酵母 ZM1-5 在 22h 后仍趋于缓慢生长阶段。 两株菌均在 32℃时生长最快， 菌量最 多。在 42℃， 酿酒酵母 ZM1-5 存活能力明显高于安琪酵母 AQ， 说明酿酒酵母 ZM1-5 比安琪 酵母 AQ 有更强的耐受高温的能力。
实施例 5、 酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 发酵葡萄糖的比较
将酵母菌菌液 ( 酿酒酵母 ZM1-5 或安琪酵母 AQ) 接入 100mL 的 YPD+20％ Glu 液体
培养基， 接种量为 1.5×107 个 /mL( 终浓度 )， 分别置于不同温度 (32℃、 37℃、 40℃或 42℃ ) 下发酵， 发酵 72h 后取发酵液测酒精度 ( 酒份 )。
酒精度检测方法 ： 取 100ml 发酵液加入 100mL 蒸馏水， 混匀后加热蒸馏。收集 100mL 馏出液， 加入蒸馏水 100mL， 混匀， 用酒精计测定酒精度， 温度计测定混合液温度 ； 得 到的值查酒度温度校正表换算成 20℃时的酒精度％ ( 体积百分含量 )， 再乘以 2， 即得发酵 液的酒精度。
设置三个重复， 结果取平均值。ZM1-5 与 AQ 在不同温度下发酵葡萄糖 72h 后的 酒份比较见图 12。酿酒酵母 ZM1-5 在 32 ℃时酒份达到最高 (11.3 ％ )， 37 ℃时酒份稍低 (10.8％ )， 40℃时酒份为 10.5％， 42℃时酒份为 7.4％。 安琪酵母 AQ， 40℃时酒份为 9.9％， 42℃时酒份为 6.7％。40℃、 42℃时酿酒酵母 ZM1-5 酒份均显著高于安琪酵母 AQ， 说明酿酒 酵母 ZM1-5 高温下利用葡萄糖产酒能力比安琪酵母 AQ 更强。
实施例 6、 酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 发酵蔗糖比较
将酵母菌菌液 ( 酿酒酵母 ZM1-5 或安琪酵母 AQ) 接入 100mL 的 YPD+20％ Suc 液体 培养基， 接种量为 1.5×107 个 /mL( 终浓度 )， 分别置于不同温度 (32℃、 37℃、 40℃或 42℃ ) 下发酵， 发酵 72h 取发酵液测酒精度 ( 酒份 )。酒精度检测方法同实施例 5。 设置三个重复， 结果取平均值。ZM1-5 与 AQ 在不同温度下发酵蔗糖 72h 后的酒份 比较见图 13。两个菌株均是在 32℃发酵时酒份最高， 37℃、 40℃时酒精产量稍低。42℃时， 酿酒酵母 ZM1-5 的酒份显著高于安琪酵母 AQ， 说明了酿酒酵母 ZM1-5 高温下利用蔗糖产酒 能力比安琪酵母 AQ 更强。
实施例 7、 酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 利用木薯粉液化醪发酵产酒精比较
木薯粉液化醪 ： 广西中粮生物质能源有限公司， 每 100mL 醪液含 27g 总糖。
1、 将酵母菌 ( 酿酒酵母 ZM1-5 或安琪酵母 AQ) 在 YPD 液体培养基中 28℃、 180rpm 摇床培养约 24h， 使活菌浓度达到 OD600 ＝ 2.0 以上， 于显微镜下血球计数板计算菌液浓度。 7 7
2、 分别按 1.5×10 个细胞 /mL， 2.0×10 个细胞 /mL， 2.5×107 个细胞 /mL 的接种 量 ( 终浓度 ) 将菌液接入 9 个装有 500mL 木薯粉液化醪的 1L 三角瓶中 ( 每个接种量 3 瓶 )， 32℃培养 70 小时， 得到发酵液。
3、 测定发酵液中各种成分 ( 酒精， 活菌数、 残总糖、 残还原糖 ) 的含量。
酒精度检测方法同实施例 5。
活菌数检测方法 ( 平板计数法 ) ： 以 10 倍为梯度稀释发酵液， 各梯度取 100μl 涂 布 YPD 平板三块， 32℃恒温培养 2-3 天， 依次观察涂布各个稀释液的平板， 用涂布最大稀释 度的稀释液且有单菌落生长的平板进行计算， 计算生长的单菌落个数 ( 能生长菌落的最大 稀释度的平板上 ) ； 计算公式 ： 活菌数 /ml ＝ ( 三块平板上生长的单菌落个数 /3)×10× 稀 释倍数。
残总糖的测定 ： ①取 1mL 发酵液加入 5mL ddH2O、 1mL 浓盐酸 ； ②于沸水中反应 20min 后于冷水中冷却 ； ③加入一滴酚酞， 并用 4M NaOH 水溶液滴至微红， 最后将溶液定容 至 100mL， 得到反应液 ； ④取 400μL 的反应液加入 800μL DNS 溶液 ( 四水合酒石酸钾钠 200g， 氢氧化钠 10g， 无水亚硫酸钠 0.5g， 结晶酚 2g， DNS 10g， 蒸馏水 1L， 室温避光静置 7 天 后可用 )， 沸水浴 5min 后冷水冷却， 取 200μL 于酶标板， OD540 处测值 ； ⑤所得的值代入葡萄 糖标准曲线即得还原糖的量 ( 残总糖的量 )。
残还原糖的测定 ： ①取 1mL 发酵液加入 19mL ddH2O， 混匀 ； ②取 400μL 混匀液加 入 800μL 的 DNS 溶液， 沸水浴煮 5min 后冷水冷却， 取 200μL 于酶标板， OD540 处测值 ； ③所 得的值代入葡萄糖标准曲线即得还原糖的量 ( 残还原糖的量 )。
实验设置三次重复， 结果取平均值。结果见图 14。
在接种量为 2.0×107 个 /mL 时， 酿酒酵母 ZM1-5 发酵的酒份最高， 达到 15.2％， 比 安琪酵母 AQ 高 0.8％ (t-test， p ＜ 0.05)。
在各个接种量， 酿酒酵母 ZM1-5 的活菌数均比安琪酵母 AQ 显著高 ； 在接种量为 7 1.5×10 个细胞 /mL 并经过 70 小时的发酵后， 酿酒酵母 ZM1-5 增殖到 3.20×108 个 /mL 活 菌浓度 ； 说明酿酒酵母 ZM1-5 在浓醪、 高酒精环境下能较好地存活。
酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 在接种浓度为 2.0×107 个细胞 /mL 时的残总糖 量比其它两个接种量低， 说明接种量为 2.0×107 个细胞 /mL 时发酵效果最好 ； 在接种量为 7 2.0×10 个细胞 /mL 时， 酿酒酵母 ZM1-5 的残总糖量和残还原糖量分别比安琪酵母 AQ 低 0.2g/100mL 和 0.09g/100mL。
实施例 8、 酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 利用甘蔗汁发酵产酒精比较
1、 将酵母菌 ( 酿酒酵母 ZM1-5 或安琪酵母 AQ) 在 YPD 液体培养基中 28℃、 180rpm 摇床培养约 24h， 使活菌浓度达到 OD600 ＝ 2.0 以上。
2、 取 10mL 步骤 1 的菌液接入装有 100mL 甘蔗汁 ( 新鲜糖蔗压榨取得， 总糖含量为 18％ ) 的 250mL 三角瓶中， 分别置于不同温度 (32℃、 37℃、 40℃、 或 42℃ ) 下培养 70 小时， 得到发酵液。
3、 取 10mL 步骤 1 的菌液接入装有 100mL 灭菌甘蔗汁 ( 新鲜糖蔗压榨取得， 总糖含 量为 18％， 分装三角瓶后 121℃灭菌 20 分钟 ) 的 250mL 三角瓶中， 分别置于不同温度 (32℃、 37℃、 40℃、 或 42℃ ) 下培养 70 小时， 得到发酵液。
4、 测定步骤 2 和步骤 3 的发酵液的二氧化碳失重以及发酵液中各种成分 ( 酒精、 残总糖 ) 的含量。
二氧化碳失重 ： 发酵前后发酵液的重量差即二氧化碳失重 (g)。
酒精度检测方法同实施例 5。
残总糖的测定方法： ① 取 1mL 发 酵 液 加 入 3mL ddH2O 和 1mL 的 浓 盐 酸 ； ② 66℃ -68℃反应 10min 后于冷水中冷却 ； ③加入一滴酚酞， 并用 4M NaOH 水溶液滴至微 红， 最后将溶液定容至 10mL， 得到反应液 ； ④取 400μL 反应液加入 800μL 的 DNS 溶液 ； ⑤ 沸水浴煮 5min 后冷水冷却， 取 200μL 于酶标板， OD540 处测值 ； ⑥所得的值代入葡萄糖标准 曲线即得还原糖的量 ( 残总糖的量 )。
实验设置三次重复， 结果取平均值。酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 发酵甘蔗汁产 物结果分析见图 15。 灭菌后的甘蔗汁酒精发酵， 酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 的酒精产量 在 32℃时相当 (10.3％ )， 酿酒酵母 ZM1-5 在 37℃ (10.3％ ) 和 42℃ (7.1％ ) 时的酒精产 量均高于 AQ 的 (10％， 6.5％ ) ； 40℃和 42℃时酿酒酵母 ZM1-5 的残总糖含量比 AQ 的低。在 新鲜甘蔗汁的酒精发酵中， 酿酒酵母 ZM1-5 在 32℃时酒份为 10.1％、 42℃时酒份为 7.6％， 安琪酵母 AQ 在 32℃时酒份为 9.6％、 42℃时酒份为 7％， 酿酒酵母 ZM1-5 的酒份均比安琪酵 母 AQ 的高 ； 32℃和 37℃时， 酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 的残总糖含量都相当低 ； 40℃和 42℃时， 酿酒酵母 ZM1-5 残总糖含量低于安琪酵母 AQ 的。 新鲜蔗汁发酵中， 酿酒酵母 ZM1-5的 CO2 失重在 42℃显著高于安琪酵母 AQ 的。结果表明， 酿酒酵母 ZM1-5 在新鲜蔗汁中发酵 比在灭菌蔗汁中发酵效果好， 且残糖含量低， 如果应用于实际生产， 将可以节省大量能源。
实施例 9、 酿酒酵母 ZM1-5 与安琪酵母 AQ 利用糖蜜发酵产酒精比较
1、 糖蜜与自来水 1 ∶ 2 体积比稀释、 混匀， pH 调至 4.0， 即为糖蜜培养基。
2、 将酵母菌 ( 酿酒酵母 ZM1-5 或安琪酵母 AQ) 在 YPD 液体培养基中 28℃、 180rpm 摇床培养约 24h， 使活菌浓度达到 OD600 ＝ 2.0 左右。
3、 取 10mL 菌液接入含 100mL 糖蜜培养基的 250mL 三角瓶中， 分别置于不同温度 (32℃、 37℃、 40℃或 42℃ ) 培养 70 小时， 得到发酵液。
4、 测定步骤 3 的发酵液的二氧化碳失重以及发酵液的酒精度。
二氧化碳失重 ： 发酵前后发酵液的重量差即二氧化碳失重 (g)。
酒精度检测方法同实施例 5。
实验设置三次重复， 结果取平均值。ZM1-5 与 AQ 在不同温度下发酵甘蔗糖蜜结果 分析见图 16。酿酒酵母 ZM1-5 在不同温度下的酒精度和二氧化碳失重均明显比安琪酵母 AQ 高， 说明它可以糖蜜为底物进行发酵， 且发酵结果较安琪酵母 AQ 好。