技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及可特异结合CTLA4蛋白的单克隆抗体UMAB249、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。
背景技术
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)是免疫球蛋白超家族成员之一，是由223个氨基酸组成的I型跨膜蛋白，分子量大小约为24.7kDa，主要表达于被激活的T细胞表面。CTLA4是共刺激分子B7(CD80、CD86)的受体，CD80和CD86限制性表达于抗原呈递细胞(APCs)和其他免疫细胞(包括T细胞)表面。CTLA4有大约30％的序列与T细胞上表达的决定性协同刺激分子CD28相同。与CD28一样，CTLA4与B7-1(CD80)和B7-2(CD86)结合，比CD28与CD80/CD86结合具有更高的亲和力(10-40倍)。通过对配体的竞争抑制CD28对T细胞的诱导激活，造成细胞因子产生减少和细胞周期阻滞，从而在T细胞激活的初始阶段起到负性调控作用。
机体的免疫系统能够识别和消除肿瘤细胞表达的抗原，又通过复杂的免疫抑制效应来避免对自体抗原的杀伤。肿瘤细胞存在的免疫逃避已成为限制肿瘤免疫治疗疗效的主要原因之一。过去的数十年的研究中，研究者们对于肿瘤细胞的免疫逃逸机制已有所了解，其中之一就是免疫细胞内在检查点诱导后控制的T细胞活化。通过阻滞这些检查点分子，改善癌症生存的第一个证据CTLA-4抗体ipilimumab于2011年3月25日被FDA批准作为单一疗法用于治疗不可切除或转移性黑色素瘤的初治患者或未化疗患者，后于同年7月被欧盟委员会(european commission)批准用于未经治疗的晚期黑色素瘤患者。
目前在临床上通常用流式细胞术检测血清样本中CTLA4阳性的T细胞比例，分析病患机体的细胞免疫应答水平。但是，目前市场上并没有利用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)病理实验方法来检测肿瘤组织中CTLA4的表达状况，其主要原因是缺乏能做IHC的足够灵敏度且特异性好的CTLA4单克隆抗体。因此，研制出一种能做IHC且特异性较高的针对CTLA4蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的CTLA4蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测CTLA4蛋白的免疫检测工具中的应用。
本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2017年4月6日，保藏编号为CGMCC No.13824。
本发明还提供了一种特异性结合CTLA4蛋白的单克隆抗体UMAB249，由上述杂交瘤细胞株产生。
本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：
(1)单克隆抗体的筛选与制备：采用CTLA4真核重组蛋白(来自OriGene，货号TP700216)免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗CTLA4特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为UMAB249，亚型鉴定为IgG1；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得CTLA4单克隆抗体。通过蛋白印记(Western-blot，WB)、免疫组织化学实验(IHC)验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。
进一步采用OriGene高密度蛋白芯片对上述单克隆抗体的特异性进行验证：
OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物(不包括CTLA4蛋白)，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。
本发明将所述单克隆抗体UMAB249与上述芯片杂交并确定信号位点，结果显示：本发明所述单克隆抗体UMAB249与该芯片所有蛋白无交叉反应，一定程度上说明该抗体UMAB249相对是特异性的。
本发明还提供了单克隆抗体UMAB249在制备用于检测CTLA4蛋白的免疫检测工具中的应用。
具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组织化学检测试剂盒，包括上述单克隆抗体UMAB249，可检测肿瘤细胞中CTLA4的表达状况。
本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于检测肿瘤细胞中CTLA4蛋白水平的试剂盒中的应用。
其中所述肿瘤具体包括但不限于结直肠癌和乳腺癌等。
与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCC No.13824)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体UMAB249。本发明还提供了单克隆抗体UMAB249在制备用于检测CTLA4蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体UMAB249的免疫组织化学检测试剂盒，以及单克隆抗体UMAB249在制备用于标记肿瘤细胞中CTLA4蛋白水平的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与CTLA4蛋白特异性结合，而与芯片上其他近10000种其他蛋白无交叉反应，显著提高了CTLA4蛋白免疫检测的特异性和可靠性，广泛适用于用于各种肿瘤细胞中CTLA4的检测。
保藏信息
用于保藏的杂交瘤细胞株UMAB249的分类命名为：鼠抗人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)单克隆杂交瘤细胞株；
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位简称：CGMCC；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
保藏日期：2017年4月6日；
保藏编号：CGMCC No.13824。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例2 CTLA4单克隆抗体UMAB249的Western blot检测结果图，以UMAB249检测瞬时转染CTLA4质粒的HEK293T细胞中CTLA4蛋白的表达，其中泳道L为转染空载体的HEK293T细胞裂解液为抗原的检测结果、泳道R为转染pCMV6-CTLA4质粒的HEK293T细胞裂解液抗原的检测结果；
图2示实施例3乳腺癌组织免疫组织化学检测结果图(一抗为CTLA4单克隆抗体UMAB249，1:300)；
图3示实施例3结肠癌组织免疫组织化学检测结果图(一抗为CTLA4单克隆抗体UMAB249，1:300)；
图4示实施例3扁桃体组织免疫组织化学检测结果图(一抗为CTLA4单克隆抗体UMAB249，1:300)；
图5示实施例4 OriGene蛋白芯片鉴定结果图(一抗为CTLA4单抗UMAB249，1:100；二抗为Alexa 647-标记的驴抗鼠IgG，1:500)
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、CTLA4单克隆抗体的制备与筛选
用购买的CTLA4重组真核蛋白(以下简称CTLA4抗原)根据标准方法对B6/C57小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：
1、动物免疫：CTLA4抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。
2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％PEG(PH 8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中进行培养。
3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用CTLA4重组蛋白进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为UMAB249。
4、细胞上清单抗的制备与纯化：将细胞株UMAB249用含15％血清的DMEM培养基培养于10cm培养皿中培养，扩培至约4×107个时，800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×105个/ml。继续培养1～2周后，当细胞死亡率达到60％-70％时(此时细胞密度大概为1-2×106个/ml)，收取细胞悬液6000rpm高速离心20min，取上清，亲和层析法进行上清纯化，根据抗体压型选择相应柱料，单抗UMAB249亚型为IgG1，采用protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装(100uL/管，浓度为1mg/ml)、保存在4-8℃。
实施例2、CTLA4单克隆抗体UMAB249为一抗的蛋白印记(Western-Blot)检测
(1)、实验方法：
1、准备细胞：准备HEK293T细胞(293T，ATCC Catlog No.CRL-3216)，培养于含5％CO2的37℃细胞培养箱中。
2、转染：将人源全长CTLA4质粒pCMV6-CTLA4(RC210150，OriGene公司)和空载体pCMV6(PS100001，OriGene公司)转染293T细胞，36小时收获活细胞。
3、制备细胞裂解液：将上述细胞消化，水平离心机800-1000rpm/5min离心,PBS洗2次，细胞沉淀用PBS定容到400ul-EP管，加入细胞裂解液，冰浴裂解20分钟后，12000rpm离心10分钟，收集上清加入5X Loading Buffer稀释成1X作为细胞裂解液，-80℃存储备用。
4、SDS-PAGE电泳：恒压180V 50min溴酚兰至凝胶底部。
5、转膜：提前用转移缓冲液浸泡Nc膜与滤纸，三明治形式置于湿转转膜仪，顺序为：电极(-)-海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-电极(+)，一定要保证胶在下膜在上，即凝胶靠近负极。恒流600mA,45分钟。
6、染色：用立春红S染色2min，用蒸馏水清洗，至marker条带显出，用圆珠笔做好标记。蒸馏水冲洗膜。
7、封闭：用封闭液(含5％脱脂奶的TBST)浸没NC膜并置于37℃孵育1小时。
8、一抗孵育：将NC膜置于CTLA4鼠单抗UMAB249(以封闭液将抗体稀释2000倍)中，37℃温箱孵育1小时后，再用15mLTBST洗膜15min*3次。(根据容器大小可调整TBST用量)
9、二抗孵育：将NC膜置于HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(Jackson，Catlog No.115-035-146；1：5000)中，室温摇床孵育1小时后，TBST洗膜5次，15min/次。
10、底物曝光：鲁米诺和双氧水1：1混匀后加在NC膜上(1ml/膜),压上X射线胶片曝光，然后将胶片进行显影和定影(暗室中可根据胶片上的荧光估算艳片时间)。
11、根据阴性，阳性，空白对照来进行结果分析和判定，见图1。
(2)、实验结果：
由图1结果可见，CTLA4鼠单抗UMAB249(1:2000)能检测到转染pCMV6-CTLA4重组质粒的HEK293T细胞裂解液中CTLA4蛋白(R)，分子量大小24.7KDa与预期相符，而239T细胞中则没有相应大小的条带，表明UMAB249能检测到CTLA4蛋白的特异性表达。
实施例3、CTLA4单克隆抗体UMAB249为一抗的免疫组织化学检测
(1)、实验方法：
1、分别取石蜡包埋的乳腺癌、结肠癌和扁桃体组织蜡块，使用SAKURA组织切片机进行切片，组织厚度为4μm。
2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次。
3、加入抗原修复液(1mM EDTA,pH8.5的10mM Tris-HCL缓冲液)高压锅高压热修复2.5min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。
4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。
5、加上封闭液(PBS+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。
6、去除封闭液，勿冲洗，加入CTLA4单抗(UMAB249)，稀释比：1:500，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。PBST(0.1％Tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。PBST(0.02％Tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。
7、滴加聚合物HRP染色试剂盒中试剂PV6000(Catlog No.PV-6000)，37℃孵育15分钟。使用PBS洗涤3次，每次5min。
8、应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。
9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。
10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5min x 3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。
11、镜检，见图2、图3、图4。
(2)、实验结果：
由图2结果可见，CTLA4蛋白在乳腺癌组织中的浸润的T淋巴细胞中呈现特异性细胞质表达。
由图3结果可见，CTLA4蛋白在结肠癌组织中的浸润的T淋巴细胞中呈现特异性细胞质表达。
由图4结果可见，CTLA4蛋白在扁桃体组织中的活化的T淋巴细胞中呈现特异性细胞质表达。
结果表明本发明所述的单克隆抗体UMAB249能够特异性识别乳腺癌、结肠癌和扁桃体组织中的CTLA4蛋白。
实施例4、单克隆抗体UMAB249的特异性蛋白芯片检测
OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物(该芯片不含有CTLA4蛋白裂解液)，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。以下为使用OriGene蛋白(OriGene Cat PA100001)芯片进行UMAB249抗体鉴定实验的实验方法：
1、将一张蛋白芯片放在50mL离心管中，使用40mL去离子水浸润芯片，置于摇床上，室温混合30分钟。弃掉去离子水，使用10mLPBST平衡芯片。室温处理10分钟。
2、向50mL离心管中加入40mL5％脱脂牛奶(用PBST进行稀释)置于摇床上，室温封闭30分钟。
3、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释一抗UMAB249，稀释比列为1：100。
4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300μL一抗在封口膜上。
5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片NC膜的一面朝下，从芯片的一边接触抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片NC膜，直至整张NC膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4℃环境下，静置，一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。
6、第二天将芯片移至50mL离心管中，使用PBST漂洗芯片两次，去除多余的抗体。使用40mL PBST(0.1％Tween-20)洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤5min。
7、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释二抗Alexa 647-标记的驴抗鼠IgG，稀释比例为1：500。
8、按照上述步骤4，步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育1小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖，以防止发生信号漂白。
9、按照上述步骤6，使用PBST洗涤芯片。
10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。
11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。
12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。
13、根据BSA-Cy3以及BSA-Cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。
14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID，根据裂解液数据库信息，查找到对应蛋白名称，NCBI录入号(accession number)，蛋白ID，蛋白大小等信息。结果见图5。
图5结果显示，在蛋白芯片上所有蛋白均不与抗体UMAB249结合，表明本发明所述抗体UMAB249比较特异。