Α低聚半乳糖的制造方法.pdf

本发明的目的是提供一种简便且低成本地制造不含α-低聚半乳糖以外的杂质低聚糖的α-低聚半乳糖的方法。根据本发明，提供一种α-低聚半乳糖的制造方法，其是以含有半乳糖的糖类为原料制造α-低聚半乳糖的方法，其特征在于，该制造方法利用属于嗜热脂肪地芽孢杆菌的微生物作为催化剂。

1、  一种α-低聚半乳糖的制造方法，其是以含有半乳糖的糖类为原料制造α-低聚半乳糖的方法，其特征在于，该制造方法利用属于嗜热脂肪地芽孢杆菌的微生物作为催化剂。

2、  如权利要求1所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述制造方法以蔗糖和半乳糖为原料。

3、  如权利要求1或2所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述α-低聚半乳糖含有棉子糖和/或车前糖。

4、  如权利要求1～3中任一项所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，用作催化剂的微生物是通过将培养时的培养液pH降低到6.5以下而得到的。

5、  如权利要求2～4中任一项所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为35％以上。

6、  如权利要求2～5中任一项所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为80％以上。

7、  如权利要求1所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述制造方法以半乳糖和葡萄糖为原料。

8、  如权利要求1或7所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述α-低聚半乳糖是蜜二糖。

9、  如权利要求7或8任一项所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的蜜二糖含有率为50％以上。

10、  如权利要求7～9中任一项所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的蜜二糖含有率为70％以上。

11、  如权利要求1～10中任一项所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，微生物催化剂来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-001株(受理编号FERM ABP-10937)、AKC-002株(受理编号FERM ABP-10938)、AKC-010(受理编号FERM ABP-10939)、DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株、DSM457株；和以AKC-001株(受理编号FERM ABP-10937)、AKC-002株(受理编号FERM ABP-10938)、AKC-010(受理编号FERM ABP-10939)、DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株、DSM457株为母株的变异株。

α-低聚半乳糖的制造方法
技术领域
本发明涉及以含有半乳糖的糖类为原料制造α-低聚半乳糖的方法，更详细地说，本发明涉及在不经过对来源于属于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的微生物的α-半乳糖苷酶进行酶提纯的复杂工序的情况下而直接利用培养得到的微生物进行α-低聚半乳糖的制造的方法。
背景技术
近年来，随着饮食生活、社会生活多样化的发展，出于健康意识的提高，消费者对食品、食品材料等的关心程度也有所提高。其中，发现蜜二糖、棉子糖、车前糖、水苏糖、毛蕊花糖等在末端具有α-半乳糖键的低聚糖即α-低聚半乳糖具有改善肠内菌群等功能，因此作为食品、药品、香料等或者其原料而倍受关注。最近，有报告指出一些α-低聚半乳糖不仅具有免疫赋活作用、对特应性皮肤炎有用，而且具有抑癌效果和自然杀伤细胞活化作用，因此这些α-低聚半乳糖被看作是非常有用的低聚糖。
这些α-低聚半乳糖广泛地分布在自然界中，例如分布在豆类、油菜籽、芝麻、棉籽等植物的种子；黄瓜、甜瓜等葫芦科植物；以及甘蔗、蜂蜜、卷心菜、马铃薯、葡萄、麦类、玉米等中，现在市售的α-低聚半乳糖大多是从上述植物中提取的。例如，棉子糖是作为制造甜菜糖时的副产物回收的，而甜菜中的棉子糖含量不过是0.1％左右，生产量与主生产物砂糖的生产量有关，所以棉子糖的增产有限。
另外，棉子糖以外的α-低聚半乳糖在自然界的植物中存在比率也较低，大豆的成熟种子中所含有的约5～15％左右的碳水化合物之中，水苏糖约为4％；黑芝麻中存在有车前糖，但其含量非常低，约为0.23％。蜜二糖也是同样，在大豆低聚糖中仅存在极少量。因此，为了稳定地以低成本向市场供给具有这样的有用特性的α-低聚半乳糖，不仅需要来自天然的提取品，还需要来自低成本原料的合成品。
作为迄今报道的α-低聚半乳糖的合成方法，可以举出例如使用β-果糖苷酶、酸、离子交换树脂等对棉子糖进行水解而得到蜜二糖的方法(例如专利文献1、专利文献2、非专利文献1)；通过使来源于朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)的α-半乳糖苷酶作用于棉子糖来合成水苏糖、毛蕊花糖、筋骨草糖等α-低聚半乳糖的方法(例如参见非专利文献2)；利用来源于朱红密孔菌或吉利蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的α-半乳糖苷酶的糖转移作用，将蔗糖用作半乳糖受体，将蜜二糖或棉子糖用作半乳糖供体，得到棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖等α-低聚半乳糖的方法(例如参见专利文献3、非专利文献3、非专利文献4)。
另外，作为利用α-半乳糖苷酶的糖转移作用的其他方法，例如已报道了利用对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷作为半乳糖供体的方法(例如，参见非专利文献5)；利用肌醇半乳糖苷作为半乳糖供体的方法(例如，参见专利文献4)；利用UDP-半乳糖作为半乳糖供体的方法(例如，参见专利文献5)；利用半乳二糖作为半乳糖供体的方法(例如，参见专利文献6)等。
这种水解α-低聚半乳糖本身的方法、利用α-半乳糖苷酶的糖转移作用的方法中，反应容易进行，能够期待高的α-低聚半乳糖产率。但是，这些方法需要使用α-低聚半乳糖本身或高价的衍生物原料，所以在考虑到工业生产的情况下，难以稳定地以低成本制造并供给目的物。
另一方面，利用脱水缩合反应的情况下，虽然反应是热力学上不利的反应，但由于能够利用成本低于糖转移反应的底物，所以在工业上是有利的，例如已报道了使用来源于葡酒色被孢霉(Mortierella vinacea)的α-半乳糖苷酶制造α-低聚半乳糖的方法(例如，非专利文献6)。但是，为了有效进行脱水缩合反应，优选在高温进行反应，所以要求酶具有耐热性，但是来源于葡酒色被孢霉的α-半乳糖苷酶没有耐热性，在高温反应中，预见到酶的失活需要在反应体系中添加大量的酶，因此需要大量培养微生物以得到大量的酶。另外，为了抑制酶活性的降低而在低温进行反应时，脱水缩合反应不易进行，所以从反应时间方面出发，为了提高反应速度，仍需要添加大量的酶，进而需要用于大量培养微生物的大型设备。
作为具有耐热性的α-半乳糖苷酶，例如已知嗜热脂肪地芽孢杆菌具有耐热性，但至今对于来源于属于嗜热脂肪地芽孢杆菌属的微生物的α-半乳糖苷酶的几篇报道全部是关于α-低聚半乳糖的半乳糖键分解的(例如，专利文献7)，迄今尚没有关于蜜二糖、棉子糖、车前糖等α-低聚半乳糖的制造的报道。
另外，迄今报道的α-低聚半乳糖的制造方法是利用“提纯酶”的例子，需要对酶进行提纯的工序，其不仅工序复杂，而且需要生成酶的设备。为了解决工序复杂这一问题而利用未提纯的酶时，由于微生物内的杂酶的影响，会在生成物中生成目的α-低聚半乳糖以外的杂质低聚糖，并且难以从最终产品中分离出杂质低聚糖，不仅如此，还产生了杂酶造成原料浪费的问题。因此，现有技术中，不经过酶的提纯或者从回收后的生成物中仅提取出目的物的复杂处理工序，就不可能选择性地仅合成α-低聚半乳糖。
专利文献1：日本特开平6-228180
专利文献2：CS239597
专利文献3：日本特许第2688854号
专利文献4：日本特开平10-84973
专利文献5：日本特开2001-321179
专利文献6：日本特公平8-24592
专利文献7：日本特开平5-23175
非专利文献1：Oligosaccharidy str.120，Praha 1962
非专利文献2：Bull.Fac.Agr.，saga Univ.，69，55-61(1990)
非专利文献3：Agric.Biol.Chem.，52(9)，2305-2311，1988
非专利文献4：Biosci.Biotech.Biochem.，59(4)，619-623，1995
非专利文献5：Phytochemistry，18，35-38，1979
非专利文献6：Carbohydr.Res.，185，139-146，1989
发明内容
基于这种情况，本发明的目的在于提供一种制造α-低聚半乳糖的方法，其中无需昂贵的原料，利用属于嗜热脂肪地芽孢杆菌的且产生具有耐热性α-半乳糖苷酶的微生物作为催化剂，并且使用微生物本身作为催化剂，就能以无需复杂的酶提纯的制造方法制造α-低聚半乳糖。另外，本发明的目的还在于提供一种α-低聚半乳糖制造方法，尽管该方法利用微生物本身作为催化剂，也能够选择性地合成α-低聚半乳糖。
为了解决这些课题，本发明的发明人反复进行了深入研究，结果发现了一种α-低聚半乳糖制造方法，其中，使用能够选择性合成α-低聚半乳糖的耐热性α-半乳糖苷酶，不经过酶的提纯工序，利用微生物本身作为催化剂，就抑制了目的α-低聚半乳糖以外的杂质低聚糖的生成，基于上述发现完成了本发明。
即，本发明是下述(1)～(11)所示的α-低聚半乳糖的制造方法。
(1)一种α-低聚半乳糖的制造方法，其是以含有半乳糖的糖类为原料制造α-低聚半乳糖的方法，其特征在于，该制造方法利用属于嗜热脂肪地芽孢杆菌的微生物作为催化剂。
(2)如(1)所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述制造方法以蔗糖和半乳糖为原料。
(3)如(1)或(2)所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述α-低聚半乳糖含有棉子糖和/或车前糖。
(4)如(1)～(3)中任一项所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，用作催化剂的微生物是通过将培养时的培养液pH降低到6.5以下而得到的。
(5)如(2)～(4)中任一项所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为35％以上。
(6)如(2)～(5)中任一项所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为80％以上。
(7)如(1)所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述制造方法以半乳糖和葡萄糖为原料。
(8)如(1)或(7)所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，所述α-低聚半乳糖是蜜二糖。
(9)如(7)或(8)所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的蜜二糖含有率为50％以上。
(10)如(7)～(9)中任一项所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其中，生成物低聚糖中的蜜二糖含有率为70％以上。
(11)如(1)～(10)中任一项所述的α-低聚半乳糖的制造方法，其特征在于，微生物催化剂来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-001株(受理编号FERM ABP-10937)、AKC-002株(受理编号FERM ABP-10938)、AKC-010(受理编号FERM ABP-10939)、DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株、DSM457株；和以AKC-001株(受理编号FERM ABP-10937)、AKC-002株(受理编号FERM ABP-10938)、AKC-010(受理编号FERM ABP-10939)、DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株、DSM457株为母株的变异株。
通过采用本发明，能够以低成本的底物为原料，制造不含α-低聚半乳糖以外的杂质低聚糖的α-低聚半乳糖，并且不经过酶提纯这一复杂的工序。另外，在日本，本发明使用的来源于微生物嗜热脂肪地芽孢杆菌的α-半乳糖苷酶作为食品添加物的安全性已经得到确认，是允许使用的，所以从技术、安全这两方面出发，也能在实际的工业生产中利用本发明。
附图说明
图1给出了对使用嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-001株的糖合成反应(实施例1)的反应液进行HPLC分析(Hypercarb柱)时保留时间为0～20分钟的结果。
图2给出了对使用嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-010株的糖合成反应(实施例13)的反应液进行离子色谱分析时保留时间为0～20分钟的结果。
图3给出了对使用嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-010株的糖合成反应(实施例13)的反应液进行HPLC(Sugar柱)分析时保留时间为0～45分钟的结果。
图4给出了对使用嗜热脱氮土壤芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)DSM 13147株的糖合成反应(比较例1)的反应液进行HPLC分析(Hypercarb柱)时保留时间为0～20分钟的结果。
具体实施方式
下面对本发明进行具体说明。
本发明涉及α-低聚半乳糖的制造方法，其中包括使属于嗜热脂肪地芽孢杆菌的微生物作为催化剂作用于含有半乳糖的糖类的步骤。
作为本发明中的含有半乳糖的糖类，可以举出由半乳糖和半乳糖以外的糖类组成的混合物，作为半乳糖以外的糖类，可以含有选自例如葡萄糖、果糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、蜜二糖、乳糖、海藻糖、纤维素二糖、黑曲霉二糖等二糖；棉子糖、麦芽三糖、异麦芽三糖、潘糖、异潘糖、蔗果三糖、车前糖、乳果糖、松三糖、吡喃葡糖基蔗糖(エルロ一ス)等三糖；或分子量为三糖以上的低聚糖的至少一种物质，作为单糖，优选葡萄糖，作为二糖，优选蔗糖。
另外，本发明中的α-低聚半乳糖是指分子内具有α-半乳糖基的低聚糖，例如可以举出蜜二糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖、筋骨草糖、车前糖等，利用本发明的情况下，能够特别地选择性制造蜜二糖、棉子糖、车前糖。
另外，原料利用半乳糖和蔗糖的情况下，能够将生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率提高到35％以上，在更优选的条件下，能够提高到80％以上。原料利用半乳糖和葡萄糖的情况下，能够将生成低聚糖中的蜜二糖含有率提高到50％以上，在更优选的条件下，能够提高到70％以上，在进一步优选的条件下，能够提高到90％以上。生成物低聚糖中的α-低聚半乳糖含有率低的情况下，由生成物提纯α-低聚半乳糖是非常困难的，不仅如此，作为底物的半乳糖或者其他单糖、二糖等无谓的浪费也是重要的问题。本发明使用的半乳糖既可以利用半乳糖本身，也可以利用UDP-半乳糖、由其他具有半乳糖基的化合物等制造的半乳糖。
另外，本发明中的杂质低聚糖是指分子内不具有α-半乳糖基的低聚糖，例如可以举出麦芽糖、异麦芽糖、纤维素二糖、麦芽三糖、异麦芽三糖、松三糖、潘糖、异潘糖、纤维三糖、龙胆三糖、蔗果三糖、吡喃葡糖基蔗糖、乳糖基蔗糖等。
用于制造α-低聚半乳糖的微生物催化剂可以利用通过通常进行的培养方法得到的微生物本身，而无需从微生物提纯α-低聚半乳糖的合成酶。另外，有时也可以利用微生物培养液、微生物培养上清液。另一方面，也可以根据需要在用水或缓冲液等对经培养法得到的微生物进行清洗后加以利用。例如，可以使用经培养的微生物的培养液、或通过离心分离、缓冲液的清洗等而得到的微生物悬浮液、悬浮或溶解有微生物或微生物的处理物(例如微生物的破碎物等)的水溶液、通过包埋法、交联法或者载体结合法而固定的微生物或微生物处理物。作为进行固定化时的固定化载体的例子，可以举出玻璃珠、硅胶、聚氨酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、角叉菜胶、藻酸等，但并不限于这些。
作为用于本发明的微生物，可以使用属于嗜热脂肪地芽孢杆菌的任意的微生物，并且可以使用具有选择性合成α-低聚半乳糖的活性的任意的微生物。优选举出来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-001株(受理编号FERM ABP-10937)、AKC-002株(受理编号FERM ABP-10938)、AKC-010(受理编号FERM ABP-10939)、DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株、DSM457株；和以AKC-001株(受理编号FERM ABP-10937)、AKC-002株(受理编号FERM ABP-10938)、AKC-010(受理编号FERM ABP-10939)、DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株、DSM457株为母株得到的变异株的微生物。
嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-001株和AKC-002株在2006年11月14日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东一丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566))，AKC-010株在2007年3月14日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东一丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566))，其保藏编号如下。
AKC-001株(FERM P-21089)
AKC-002株(FERM P-21090)
AKC-010株(FERM P-21252)
上述的AKC-001株(FERM P-21089)、AKC-002株(FERM P-21090)以及AKC-010株(FERM P-21252)于2007年11月30日移交给国际保藏。国际保藏的受理编号如下。
AKC-001株(FERM ABP-10937)
AKC-002株(FERM ABP-10938)
AKC-010株(FERM ABP-10939)
AKC-001株、AKC-002株、AKC-010株分别是本发明人将DSM2358株、DSM6790株、DSM2313株重新保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心的菌株。
另外，上述记载的DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株、DSM457株可由菌株保藏机构德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen Und Zellkulturen(DSMZ)，http://www.dsmz.de/microorganisms/bacteria#catalogue.php)获得。下面给出DSM2358株、DSM2027株、DSM2313株、DSM22株、DSM6790株的其他馆藏编号。
DSM 2358株：NCIB 10280
DSM 2027株：ATCC 7954，NCIB 8924
DSM2313株：NCIB 10278
DSM22株：ATCC 12980，CCM 2062，CCUG 26241，lAM 11062，IFO12550，NBRC 12550，NCIB 8923，NCTC 10339，VKM B-2231
DSM 6790株：ATCC 10149
作为用于本发明的微生物的培养方法，采用通常的通气搅拌培养或者固体培养，并可以应用通常进行的微生物的培养方法。作为培养基，可以举出合成培养基或天然培养基，其中含有使该微生物繁殖良好且顺畅地生成微生物中的α-低聚半乳糖合成酶所必须的碳源、氮源、无机盐、必须的营养源等。例如，作为碳源，可以使用葡萄糖、甘油、蔗糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖、水苏糖、纤维素二糖、吡喃葡糖基蔗糖、有机酸、大豆粕、淀粉、橄榄油、大豆油等。作为氮源，例如可以举出硫铵、硝铵、脲、氨基酸、胺类、氨、各种无机酸或有机酸的铵盐、其他含氮化合物、蛋白胨、胰化蛋白胨、聚胨、肉汤、酵母提取液、棉籽粕、玉米浆和大豆粕等。另外，作为无机盐类，可以举出磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸锰、硫酸铜、硫酸铁、碳酸钙等。培养温度优选为25～80℃，更优选为40～65℃，进一步优选为50～60℃。培养温度小于25℃或者高于80℃的情况下，繁殖性差而不优选。另外，培养基的初期pH优选为3～9，更优选为4.5～7.5。另外，培养中的pH可在较宽范围进行调整，可以在pH3～9进行培养。培养基的pH小于3或者大于9的情况下，繁殖性差而不优选。无论培养中的pH是多少，与普通的微生物的α-低聚半乳糖含有率(约30％以下)相比，属于嗜热脂肪地芽孢杆菌的微生物表现出非常高的α-低聚半乳糖含有率(约35～100％)，特别是制造三糖以上的α-低聚半乳糖的情况下，为了得到更高的α-低聚半乳糖含有率，优选使培养中的pH小于7，更优选为6.5以下、进一步优选为6.0以下、特别优选为5.5以下。作为降低培养中的pH的方法，可以举出利用培养中从微生物生成的酸性物质；添加盐酸、磷酸、硫酸、硝酸、乙酸等酸性物质的方法。
从脱水缩合反应的性质方面出发，本发明中制造α-低聚半乳糖时，优选原料浓度高，但半乳糖浓度过高时，半乳糖的分子内缩合会抑制半乳糖与半乳糖以外的糖类之间的脱水缩合反应，所以不优选。半乳糖浓度优选设定在2％(w/v)～45％(w/v)，更优选设定在5％(w/v)～35％(w/v)。利用葡萄糖作为底物的情况下，葡萄糖浓度优选设定在30％(w/v)～90％(w/v)。另外，利用蔗糖作为底物的情况下，蔗糖浓度优选设定在30％(w/v)～80％(w/v)，更优选设定在45％(w/v)～70％(w/v)。
反应温度优选为20～90℃，更优选为40～80℃，进一步优选为50～70℃。反应温度小于20℃的情况下，反应速度极低，反应温度大于90℃的温度区域，酶活性的失活变快，需要大量的微生物催化剂，所以不优选。反应pH可在较宽范围进行调整，优选pH3～10，更优选pH4.5～8.5，进一步优选pH5.0～6.0。反应pH小于3或者大于10的情况下，催化剂的失活明显变快，所以不优选。反应时间会因微生物催化剂的用量而有所不同，考虑到工业利用的情况下，通常优选反应时间为20分钟～200小时，更优选为6小时～80小时。但是，本发明并不限于上述的反应条件和反应形态，可以适当进行选择。
通过下述的方法对本发明中得到的α-低聚半乳糖进行测定。
[生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率的测定方法]
反应完成后，将反应液稀释25倍，在99℃保持10分钟，由此停止反应。反应停止后，通过离心分离除去微生物，用高速液相色谱法(HPLC)对所得到的反应溶液进行分析。HPLC分析(Hypercarb柱)使用Hypercarb柱(THERMO ELECTRON社制造)，在柱温度60℃、流量0.5ml/min的条件下使用RI检测器实施分析。洗脱液使用由蒸馏水/乙腈/甲酸＝950/50/5的组成构成的混合液。
生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率(％)是根据在HPLC分析谱图中检测到的各个峰的面积比通过(三糖以上的α-低聚半乳糖的峰面积)/(生成物低聚糖的峰面积)×100计算出的。
[生成物低聚糖中的蜜二糖含有率的测定方法]
以葡萄糖和半乳糖为原料的α-低聚半乳糖合成反应完成后，将反应液稀释25倍，在99℃保持10分钟，由此停止反应。反应停止后，进一步将糖合成液稀释20倍，通过离子色谱分析，计算出蜜二糖累积浓度％(w/v)。另外，将反应停止后的糖合成液稀释2倍，进行HPLC分析(Sugar柱)，计算出全部二糖的累积浓度。离子色谱分析中，使用Carbpac PA1柱(DIONEX社制造)，在柱温度35℃、流量1mL/min的条件下进行分析。检测器使用脉冲安培检测器。洗脱液使用水、100mM氢氧化钠水溶液、500mM乙酸钠水溶液，在水、100mM氢氧化钠水溶液、500mM乙酸钠水溶液在0-20分钟、20-40分钟、40-45分钟的各阶段的比例为49/50/1、30/50/20、0/100/0的梯度条件下进行分析。HPLC分析(Sugar柱)中，将Shodex Sugar SCLG保护柱(昭和电工社制造)、Shodex Sugar SC1011柱(昭和电工社制造)、Shodex Sugar SP0810柱(昭和电工社制造)连起来使用，在柱温度80℃、流量0.6mL/min的条件下用RI检测器进行分析。洗脱液使用蒸馏水。生成物低聚糖中的蜜二糖含有率(％)通过蜜二糖累积浓度/全部二糖的累积浓度×100来计算。
[α-半乳糖苷酶活性的测定方法]
对于测定α-半乳糖苷酶活性的方法，例如在含有2.67mM对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷的450μL乙酸钠缓冲液(100mM，pH5.0)中混合经适当调整的150μL酶液，在40℃进行10分钟左右的反应后，将反应液添加到1mL碳酸钠水溶液(1M)中，使酶失活，停止反应。测定所得到的溶液在波长420nm的吸收(所得到的溶液的着色度)，使用以各浓度的对硝基苯酚制作的校准曲线计算出浓度。另外，评价酶活性时，以在上述条件下，1分钟游离出1μmol对硝基苯酚的酶量为1U。
另外，评价α-半乳糖苷酶的热稳定性时，可以通过在各温度条件下曝露一定时间后测定α-半乳糖苷酶活性来进行评价。
通过本发明的方法制造的α-低聚半乳糖可根据需要利用一般采用的方法来进行提纯、分离等处理。即，例如可通过离心分离、利用MF(微滤)膜或UF(超滤)膜等的膜处理、压滤机等除去微生物催化剂；通过阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法等色谱处理或透析等脱盐处理来除去由缓冲液、培养基等带入的盐类等；以及通过阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、高速液相色谱法、活性炭色谱法等色谱处理或利用溶解度差等的结晶化处理、其他常规方法进行α-低聚半乳糖的分离、提纯。色谱处理可以单独使用这些方法，也可以组合使用这些方法，并可以适当利用移动床方式、模拟移动床方式、多成分分离模拟移动床方式、多成分分离循环方式等。利用这些分离、提纯方法的情况下，不仅能将α-低聚半乳糖与其他杂质低聚糖成分分离开，还能分离各种结合形态或者具有不同的分子量的2种以上的α-低聚半乳糖类。这些α-低聚半乳糖的提纯、分离处理方法可以批量式进行，也可利用柱等连续进行。
下面通过实施例具体进行说明，但本发明并不受这些实施例的任何限制。
实施例
实施例1
将嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-001株(受理编号FERM ABP-10937；保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础，Tryptose Blood Agar Base)培养板(Difco)在55℃培养1天，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL缓冲能低于培养基-B(pH7.2)(参见表3)的培养基-A(pH7.2)(参见表2)中，在55℃以150rpm培养2天。开始该培养2天后，培养液的pH从初期的7.2向酸性侧移动到4.9。
该培养2天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含62.5％蔗糖、12.5％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始47小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，进行HPLC分析(Hypercarb柱)，其结果见图1。分离提取对应图1中的峰-1和峰-2的组分，用13C-NMR进行解析，结果证明了峰-1对应车前糖、峰-2对应棉子糖。回收菌体时的pH为4.9，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为100％。该结果见表1。
实施例2
将嗜热脂肪地芽孢杆菌DSM 2027株(保藏机构：Deutsche SammlungVon Mikroorganismen Und Zellkulturen)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养1天，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL缓冲能低于培养基-B(参见表3)的培养基-A(pH7.2)(参见表2)中，在55℃以150rpm培养2天。开始该培养2天后，培养液的pH从初期的7.2向酸性侧移动到5.0。
该培养2天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含62.5％蔗糖、12.5％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始39小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，进行HPLC分析(Hypercarb柱)，计算出生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率。回收菌体时的pH为5.0，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为98％。该结果见表1。
实施例3
将嗜热脂肪地芽孢杆菌DSM22株(保藏机构：Deutsche SammlungVon Mikroorganismen Und Zellkulturen)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养1天，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL缓冲能低于培养基-B(参见表3)的培养基-A(pH7.2)(参见表2)中，在55℃以150rpm培养2天。开始该培养2天后，培养液的pH从初期的7.2向酸性侧移动到5.0。
该培养2天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含62.5％蔗糖、12.5％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始39小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，进行HPLC分析(Hypercarb柱)，计算出生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率。回收菌体时的pH为5.0，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为93％。该结果见表1。
实施例4
将嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-002株(受理编号FERM ABP-10938；保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养1天，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL缓冲能低于培养基-B(参见表3)的培养基-A(pH7.2)(参见表2)中，在55℃以150rpm培养2天。开始该培养2天后，培养液的pH从初期的7.2向酸性侧移动到4.9。
该培养2天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含62.5％蔗糖、12.5％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始39小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，进行HPLC分析(Hypercarb柱)，计算出生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率。回收菌体时的pH为4.9，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为99％。该结果见表1。
实施例5
将嗜热脂肪地芽孢杆菌DSM457株(保藏机构：Deutsche SammlungVon Mikroorganismen Und Zellkulturen)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养1天，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL缓冲能低于培养基-B(参见表3)的培养基-A(pH7.2)(参见表2)中，在55℃以150rpm培养2天。开始该培养2天后，培养液的pH从初期的7.2向酸性侧移动到5.0。
该培养2天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含62.5％蔗糖、12.5％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始39小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，进行HPLC分析(Hypercarb柱)，计算出生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率。回收菌体时的pH为5.0，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为94％。该结果见表1。
实施例6
将嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-010株(受理编号FERM ABP-10939；保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养1天，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL缓冲能低于培养基-B(pH7.2)(参见表3)的培养基-A(pH7.2)(参见表2)中，在55℃以150rpm培养2天。开始该培养2天后，培养液的pH从初期的7.2向酸性侧移动到5.0。
该培养2天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含62.5％蔗糖、12.5％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始47小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，进行HPLC分析(Hypercarb柱)，计算出生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率。回收菌体时的pH为5.0，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为100％。该结果见表1。
实施例7
将嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-001株(受理编号FERM ABP-10937；保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养1天，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL培养基-B(参见表3)中，在55℃以150rpm培养1天。开始该培养1天后，培养液的pH为6.7，与培养初期的pH相比基本没有变化。
该培养1天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含62.5％蔗糖、12.5％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始47小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，进行HPLC分析(Hypercarb柱)，计算出生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率。回收菌体时的pH为6.7，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为49％。该结果见表1。
实施例8
将嗜热脂肪地芽孢杆菌DSM 2027株(保藏机构：Deutsche SammlungVon Mikroorganismen Und Zellkulturen)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养1天，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL培养基-B(参见表3)中，在55℃以150rpm培养1天。开始该培养1天后，培养液的pH为6.7，与培养初期的pH相比基本没有变化。
该培养1天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含62.5％蔗糖、12.5％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始47小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，进行HPLC分析(Hypercarb柱)，计算出生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率。回收菌体时的pH为6.7，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为51％。该结果见表1。
实施例9
将嗜热脂肪地芽孢杆菌DSM22株(保藏机构：Deutsche SammlungVon Mikroorganismen Und Zellkulturen)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养1天，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL培养基-B(参见表3)中，在55℃以150rpm培养1天。开始该培养1天后，培养液的pH为6.7，与培养初期的pH相比基本没有变化。
该培养1天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含62.5％蔗糖、12.5％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始47小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，进行HPLC分析(Hypercarb柱)，计算出生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率。回收菌体时的pH为6.7，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为42％。该结果见表1。
实施例10
将嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-002株(受理编号FERM ABP-10938；保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养1天，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL培养基-B(参见表3)中，在55℃以150rpm培养1天。开始该培养1天后，培养液的pH为6.8，与培养初期的pH相比基本没有变化。
该培养1天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含62.5％蔗糖、12.5％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始47小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，进行HPLC分析(Hypercarb柱)，计算出生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率。回收菌体时的pH为6.8，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为53％。该结果见表1。
实施例11
将嗜热脂肪地芽孢杆菌DSM 457株(保藏机构：Deutsche SammlungVon Mikroorganismen Und Zellkulturen)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养1天，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL培养基-B(参见表3)中，在55℃以150rpm培养1天。开始该培养1天后，培养液的pH为6.6，与培养初期的pH相比基本没有变化。
该培养1天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含62.5％蔗糖、12.5％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始47小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，进行HPLC分析(Hypercarb柱)，计算出生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率。回收菌体时的pH为6.6，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为50％。该结果见表1。
实施例12
将嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-010株(受理编号FERM ABP-10939；保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养1天，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL培养基-B(参见表3)中，在55℃以150rpm培养1天。开始该培养1天后，培养液的pH为6.7，与培养初期的pH相比基本没有变化。
该培养1天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含62.5％蔗糖、12.5％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始47小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，进行HPLC分析(Hypercarb柱)，计算出生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率。回收菌体时的pH为6.7，生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为49％。该结果见表1。
实施例13
将嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-010株(受理编号FERM ABP-10939；保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养24小时，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在500mL三角烧瓶中的100mL培养基-C(参见表7)中，在55℃以150rpm培养28小时。
该培养28小时后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10,000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含80.0％葡萄糖、10％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5.0))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始285小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将稀释糖液的温度降到常温后，进行离子色谱分析，其结果见图2，HPLC分析(Sugar柱)的结果见图3。蜜二糖糖累积浓度为1.6％(w/v)，生成物低聚糖中的蜜二糖含有率为84.4％。
实施例14
将嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-010株(受理编号FERM ABP-10939；保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养24小时，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在500mL三角烧瓶中的100mL培养基-C(参见表7)中，在55℃以150rpm培养28小时。
该培养28小时后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10,000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含50.0％葡萄糖、10％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5.0))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始17.5小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，进行离子色谱分析，计算出生成物低聚糖中的蜜二糖含有率。蜜二糖糖累积浓度为0.93％(w/v)，生成物低聚糖中的蜜二糖含有率为88.9％。
实施例15
将嗜热脂肪地芽孢杆菌AKC-001株(受理编号FERM ABP-10937；保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养24小时，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在500mL三角烧瓶中的100mL培养基-B(参见表2)中，在55℃以150rpm培养28小时。
将上述得到的菌体悬浮在100mM乙酸钠缓冲液(pH5)中，分别在4℃和50℃进行2小时培养，进行α-半乳糖苷酶活性测定。活性测定中，在溶解有2.67mM对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷的450μL乙酸钠缓冲液(100mM，pH5)中混合150μL在各温度培养的菌液，在40℃反应10分钟。反应后，通过对游离的对硝基苯酚进行定量来测定活性，计算出在4℃和50℃培养的菌液的活性。以在4℃培养的菌体活性为100时，在50℃培养的菌体的活性是高达80的值。
比较例1
将嗜热脱氮土壤芽孢杆菌DSM 13147株(保藏机构：DeutscheSammlung Von Mikroorganismen Und Zellkulturen)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养1天，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL表2所示的培养基-A(参见表2)中，在55℃以150rpm培养2天。
该培养2天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含62.5％蔗糖、12.5％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始39小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，进行HPLC分析(Hypercarb柱)，其结果见图4。图4中的峰-1和峰-2是α-低聚半乳糖的峰，峰-3、峰-4和峰-5是杂质低聚糖的峰，根据各峰面积，计算出生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率，结果嗜热脱氮土壤芽孢杆菌DSM 13147株的生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率为27(％)。
比较例2
将嗜热脱氮土壤芽孢杆菌DSM 13147株(保藏机构：DeutscheSammlung Von Mikroorganismen Und Zellkulturen)用TBAB(胰蛋白胨血琼脂基础)培养板(Difco)在55℃培养1天，形成菌落。将1接种环该培养物接种到分装在150mL三角烧瓶中的30mL培养基-B(参见表2)中，在55℃以150rpm培养2天。
该培养2天后，将10mL量的培养菌体回收到15mL管中。将回收有培养液的15mL管以10000rpm离心后，除去上清液。接着，添加1mL的100mM乙酸钠缓冲液(pH5)，再次悬浮后，将悬浮液移入2mL的聚丙烯制管中。再次对管进行离心，除去上清液后，添加300μL糖液(含62.5％蔗糖、12.5％半乳糖的100mM乙酸钠缓冲液(pH5))，用涡流搅拌器使菌体充分悬浮，开始糖合成反应。该糖合成反应在反应温度60℃、转速1200rpm的条件下进行。糖合成反应开始47小时后，回收40μL反应液，将其与960μL蒸馏水充分混合，在99℃对酶进行10分钟的热失活。将该稀释糖液的温度降到常温后，进行HPLC分析(Hypercarb柱)，计算出生成物低聚糖中的三糖以上的α-低聚半乳糖含有率，结果为21(％)。
比较例3
使用来源于生咖啡豆(Green coffee beans)的α-半乳糖苷酶(SIGMA-ALDRICH制造)，利用实施例13所述的方法进行热稳定性试验。与实施例15同样地设在4℃培养的α-半乳糖苷酶的活性为100时，则在50℃培养的α-半乳糖苷酶的活性为50。
[表1]