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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610037579.8 (22)申请日 2016.01.20 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105462935 A (43)申请公布日 2016.04.06 (83)生物保藏信息 CCTCC NO： C201174 2011.08.31 (73)专利权人 潘世扬 地址 210029 江苏省南京市广州路300号江 苏省人民医院医学检验科 (72)发明人 潘世扬徐建王芳黄珮珺 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 傅婷婷徐冬。
2、涛 (51)Int.Cl. C12N 5/20(2006.01) C07K 16/18(2006.01) G01N 33/577(2006.01) G01N 33/574(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 CN 1609203 A,2005.04.27, US 2007128202 A1,2007.06.07, 审查员 张丹丹 (54)发明名称 抗卵巢癌单克隆抗体及其应用 (57)摘要 本发明公开了抗卵巢癌单克隆抗体及其应 用。 一株分泌抗人卵巢癌单克隆抗体的杂交瘤细 胞株NM003-1， 2011年8月31日。
3、保藏于中国典型培 养物保藏中心， 保藏号为CCTCCNO： C201174。 杂 交瘤细胞株NM003-1分泌的抗人卵巢癌的单克隆 抗体NJ003-1。 本发明单抗NJ003-1特异性抗原在 卵巢癌组织中的表达高于卵巢良性疾病组织； 在 低分化患者该抗原的阳性表达率高于高分化患 者。 且单克隆抗体NJ003 1能够有效抑制卵巢癌 细胞SKOV3在软琼脂中的克隆形成， 单抗 NJ003 1在裸鼠体内能显著抑制人卵巢癌移植瘤 的生长。 可见该单抗有望成为治疗卵巢癌的药物 或制备成检测卵巢癌的诊断试剂。 权利要求书1页 说明书13页 附图2页 CN 105462935 B 2017.08.04 CN。
4、 105462935 B 1.一株分泌抗人卵巢癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM003-1， 于2011年8月31日保藏于 中国典型培养物保藏中心， 保藏号为CCTCC NO： C201174。 2.由权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO： C201174的杂交瘤细胞株NM003-1分泌的抗 人卵巢癌的单克隆抗体NJ003-1。 3.权利要求2所述的单克隆抗体NJ003-1在制备卵巢癌诊断试剂中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于权利要求2所述的单克隆抗体NJ003-1在制 备卵巢癌辅助诊断试剂中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于所述的辅助诊断试剂包括免疫组织。
5、化学检 测试剂。 6.权利要求2所述的单克隆抗体NJ003-1在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105462935 B 2 抗卵巢癌单克隆抗体及其应用 技术领域 0001 本发明属于医学诊断领域， 涉及抗卵巢癌单克隆抗体及其应用。 背景技术 0002 卵巢癌是妇女生殖器官最常见的恶性肿瘤之一， 发病率仅次于宫颈癌和宫体癌列 居第三位， 而病死率却高居首位， 且近年来其发病率呈上升趋势， 已成为严重威胁妇女生命 的恶性疾病。 由于卵巢解剖位置深处盆腔,发病隐匿， 早期临床症状和体征不典型， 就诊时 约70的患者已经是晚期， 且多已出现转移， 致使多数患者失去根治。
6、性手术的机会， 导致卵 巢癌五年存活率较低， 不足30。 0003 糖链抗原125(CA125)是从上皮性卵巢癌抗原检测出可被单克隆抗体OC125结合的 一种糖蛋白。 自1981年首次发现就备受关注， 是至今发现最早研究最广泛透彻的卵巢癌肿 瘤标志物， 目前是临床上最常用的指标。 CA125具有不错的灵敏性， Goonewardene等报道可 高达80。 但是其特异性不太高， 因为CA125与胸膜等组织有共同抗原相关， CA125在其他恶 性肿瘤(如子宫内膜癌、 宫颈癌， 肺癌等)及一些良性疾病中(如肝炎、 盆腔炎， 胰腺炎等)会 有所升高。 此外CA125在卵巢良性疾病甚至在正常卵巢组织中也。
7、会升高， 同时卵巢癌的临床 病理类型不同， CA125在卵巢癌组织中的表达水平也有不同； 在卵巢浆液性囊腺癌中CA125 具有较高表达， 在非浆液性卵巢癌例如卵巢粘液性囊腺癌中较低表达。 因此其特异性不高 给临床工作者带来不少困惑， 对于卵巢癌的诊断还需要发现特异性更高的肿瘤标志物。 发明内容 0004 本发明的目的是针对现有技术的上述不足， 提供一株分泌抗人卵巢癌单克隆抗体 的杂交瘤细胞株。 0005 本发明的另一目的是提供抗人卵巢癌单克隆抗体。 0006 本发明的又一目的是提供该单克隆抗体的应用。 0007 本发明的目的可通过如下技术方案实现： 0008 一株分泌抗人卵巢癌单克隆抗体的杂交。
8、瘤细胞株NM003-1， 于2011年8月31日保藏 于中国典型培养物保藏中心， 保藏号为CCTCC NO： C201174。 0009 由所述的保藏号为CCTCC NO： C201174的杂交瘤细胞株NM003-1分泌的抗人卵巢癌 的 单克隆抗体NJ003-1。 0010 所述的单克隆抗体NJ003-1在制备卵巢癌诊断试剂中的应用； 优选在制备卵巢癌 辅助诊断试剂中的应用。 0011 所述的辅助诊断试剂优选免疫组织化学检测试剂。 0012 单克隆抗体NJ003-1的特异性抗原作为检测靶标在制备卵巢癌诊断试剂中的应 用。 0013 单克隆抗体NJ003-1在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。 00。
9、14 单克隆抗体NJ003-1的特异性抗原作为靶点在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。 说明书 1/13 页 3 CN 105462935 B 3 0015 有益效果： 0016 本发明以人卵巢癌SK OV 3为免疫原， 用杂交瘤技术， 筛选到一株能够稳定分泌抗 人卵巢癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM003-1(CCTCC NO： C201174)。 该杂交瘤(CCTCC NO： C201174)所分泌的单抗NJ003-1产量多、 效价高， 对卵巢癌细胞系有特异性反应， 与正常卵 巢细胞、 健康人PBMC及其他一些常见的肿瘤细胞系(肺癌、 肝癌、 乳腺癌及结肠癌)无反应或 低反应性。 0017 免疫。
10、组织化学结果显示， NJ003-1特异性抗原在卵巢癌组织中的表达高于卵巢良 性疾病组织(85.4vs.3.3， p0.001)。 进一步分析发现： 在低分化患者该抗原的阳性表 达率高于中高分化患者(93.3vs.67.5， p0.05)； 且该抗原的阳性表达率随TNM分期的 升高而升高， 期卵巢癌患者组织中的阳性率高于 期组(97.1vs.81.2， p 0.05)； 有淋巴结转移的患者其阳性率高于无淋巴结转移者(96.7vs.81.0， p0.05)， 差 异均有统计学意义。 NJ003-1特异性抗原的表达与卵巢癌患者的年龄、 肿瘤的大小， 组织学 类型无显著关系。 可见， NJ003-1的。
11、特异性抗原有望成为诊断卵巢癌和预测患者预后的新的 肿瘤标志物， 其单克隆抗体NJ003-1在卵巢癌诊断制剂中应用。 0018 此外， 单克隆抗体NJ003-1能够有效抑制卵巢癌细胞SK OV 3在软琼脂中的克隆形 成， 并且其抑制程度与抗体的作用浓度呈正相关。 单抗NJ003-1在裸鼠体内能显著抑制人卵 巢癌移植瘤的生长， 并且其抑制程度与抗体的作用浓度呈正相关。 表明单克隆抗体NJ003-1 有望成为治疗卵巢癌的药物。 附图说明 0019 图1单抗NJ003-1抑制SK-OV-3移植瘤的生长 0020 图A肿瘤生长曲线， 图B平均肿瘤重量， 图C各组切除肿瘤。 0021 生物材料保藏信息 0。
12、022 杂交瘤细胞株NM003-1于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏地 址为中国武汉， 武汉大学， 保藏号为CCTCC NO： C201174。 具体实施方式 0023 实施例1杂交瘤的制备 0024 1.1动物免疫 取68周雌性BALB/c小鼠， 每只用卵巢癌细胞12106SK-OV-3细 胞/次腹腔注射免疫4次， 每次间隔3周。 每次免疫前均进行小鼠内眦采血， 间接细胞ELISA法 检测小鼠血清抗体效价， 待免疫小鼠血清抗体滴度达到最大并不再升高时取鼠脾细胞进行 融合， 融合前3d加强免疫1次。 0025 1.2间接细胞ELISA试验 于96孔板上接种2105/孔的。
13、SK-OV-3细胞(上海拜力生 物科技有限公司)， 至细胞生长融合达80， 95乙醇固定， PBS洗3次， 0.2Triton-X-100 通透20min， 再用50g/L BSA 37封闭2h， 依次加入不同稀释度的免疫小鼠血清100 L， 37 温育1h， 再经PBS洗3次后， 加入1： 1000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG 100 L， 37温育45min， 经PBS洗涤后， 加入TMB显色液， 37温育10min后终止反应， 用酶标仪测定450nm时吸光度 (A)值， 以未免疫小鼠血清(1:1000)作为阴性对照。 0026 1.3细胞融合 取免疫小鼠脾脏研磨制成细胞悬液， 与处于对。
14、数生长期的骨髓瘤细 说明书 2/13 页 4 CN 105462935 B 4 胞SP2/0进行融合(姚晓玲,柳晓燕,吴强,等.人肺癌相关单克隆抗体的制备及其抗原的纯 化J .中国免疫学杂志,2006,22(12):1140-1145.)， 首次融合960孔， 融合1周后出现细胞 克隆， 有800孔生长杂交瘤细胞， 融合率约为83。 按照1.2中的方法进行间接细胞ELISA试 验筛选阳性杂交瘤细胞(将1.2间接细胞ELISA试验中的免疫小鼠血清替换为杂交瘤细胞培 养上清)， 进行转种和4次有限稀释法亚克隆， 获得稳定分泌抗SK-OV-3单抗且阳性最强的2 株杂交瘤细胞株NM003-1及NM00。
15、3-2。 0027 实施例2单抗腹水的制备及纯化 0028 取810周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL石蜡油， 10d后分别腹腔注射生长良 好的杂交瘤细胞NM003-1及NM003-2约1106/只， 12周后抽吸腹水， 371h后， 4过夜， 次日分别将腹水离心， 经Protein G亲和层析柱纯化， 得到纯化的单克隆抗体NJ003-1及 NJ003-2。 0029 实施例3单抗的鉴定 0030 3.1单抗Ig亚类的鉴定： 纯化单抗用PBS 1:10000稀释， 按照测定试剂盒说明书操 作。 单抗NJ003-1及NJ003-2的亚类均为IgG， 轻链为 链。 0031 3.2单抗效价。
16、的测定： 分别将纯化的单抗NJ003-1及NJ003-2用PBS倍比稀释， 分别 取100 L加入包被有SK-OV-3细胞的96孔板中， 用间接细胞ELISA法测定A450值， 能与包被细 胞发生免疫反应的单抗最大稀释度即为其效价。 单克隆抗体NJ003-1效价为8105， 单克隆 抗体NJ003-2效价为4105。 将杂交瘤细胞株NM003-1于2011年8月31日保藏于中国典型培 养物保藏中心， 保藏地址为武汉， 武汉大学， 保藏号为CCTCC NO： C201174。 0032 3.3染色体鉴定： 将对数生长的杂交瘤细胞NM003-1秋水仙碱处理8h,再收集细胞， 经离心甩片在玻片上,用。
17、0.075mol/L KCl低渗处理,用甲醇冰醋酸固定液固定,经10 Giemsa染色10min,镜下检测染色体。 杂交瘤细胞的染色体数目范围为100106条， 因为小 鼠细胞的染色体数目为40条， 而SP2/0细胞染色体数目平均为6268条， 证明杂交瘤细胞中 的染色体来自免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0， 均属杂交瘤细胞染色体核型。 0033 3.4单抗特异性的鉴定： 用纯化的单抗NJ003-1与6种细胞系及健康人PBMC分别做 间接细胞ELISA分析， 观察有无阳性反应。 结果显示， 单抗NJ003-1仅对卵巢癌细胞抗原具有 较强反应， 对其他肿瘤细胞(SPCA-1、 HepG。
18、2、 Colo 205、 ZR-75-30)抗原、 人正常卵巢细胞抗 原及健康人PBMC均无反应。 0034 实施例4 0035 1.标本来源 0036 实验标本的组织来源于南京市第一医院和江苏省中医院2013-2015年行卵巢切除 手术的患者(130例卵巢癌， 30例卵巢良性疾病)。 所有患者经病理检查确诊且术前均未经放 疗、 化疗或其他治疗。 查找相应的肿瘤组织石蜡标本， 所有标本均经10福尔马林固定和普 通石蜡包埋， 由南京市第一医院和江苏省中医院病理科存档并提供。 30例卵巢良性疾病包 含15例卵巢良性肿瘤， 15例卵巢良性囊肿； 在130例卵巢癌患者中， 年龄从29岁到80岁， 囊括。
19、 91例卵巢浆液性囊腺癌、 16例卵巢子宫内膜样癌、 17例卵巢癌粘液性囊腺癌， 6例卵巢透明 细胞癌。 按照2004年WHO卵巢癌分类标准对所收集的卵巢癌标本进行分化程度评估， 40例中 高分化癌， 90例低分化癌。 按照2014版AJCC癌症分期手册的标准进行TNM分期， 早期( 期 期)96例， 晚期(期期)34例； 100例无淋巴结转移者， 30例有淋巴结转移者,所有纳 说明书 3/13 页 5 CN 105462935 B 5 入研究的的卵巢癌病人的详细资料见表1。 0037 表1 卵巢癌病人基本资料 0038 0039 2.免疫组织化学染色 0040 免疫组织化学染色具体流程参考韩。
20、月,王芳,徐婷,吴蕾等.NJ001-1特异性抗原在 肺腺癌中的表达及临床意义J.中华检验医学杂志.2013,36(10):895-898。 一抗为单克隆 抗体NJ003-1， 以1的PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照， 确诊卵巢癌切片作为阳性对照。 快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物购自福州迈新生物技术开发公司； DAB显色试剂盒购自北 京中杉金桥生物技术有限公司。 0041 结果判定： 根据肿瘤细胞内棕黄色阳性反应百分率和染色程度进行综合判定分 析。 阳性百分率为在高倍视野下， 每200个肿瘤细胞中阳性细胞所占百分比， 随机做5次。 阳 性率计分标准： 0分(阳性百分率0)， 1分(133)， 。
21、2分(34-66)， 3分(67100)。 染色 程度记分标准： 无染色， 浅黄色， 棕黄色， 棕褐色分别计为0， 1， 2， 3分。 两种方法得分的乘积 为0， 1， 2， 3， 4， 6， 9。 将得分结果分为-(0)， +(1， 2)， +(3， 4)， +(6， 9)四个等级， 0042 其中+， +判定为阳性表达。 0043 3.统计学方法 0044 采用 2检验进行数据的比较， 设定p0.05为差异有统计学意义。 所有数据应用 SPSS18.0统计软件进行分析。 0045 4.结果 0046 4.1 NJ003-1特异性抗原在卵巢癌及卵巢良性疾病组织中的表达 说明书 4/13 页 。
22、6 CN 105462935 B 6 0047 本实验组织标本包括130例卵巢癌及30例卵巢良性疾病组织， 所有免疫组化检测 结果见表2-表3。 0048 表2 卵巢癌患者石蜡组织切片NJ003 1特异性抗原免疫组化结果一览表 0049 说明书 5/13 页 7 CN 105462935 B 7 0050 说明书 6/13 页 8 CN 105462935 B 8 0051 说明书 7/13 页 9 CN 105462935 B 9 0052 说明书 8/13 页 10 CN 105462935 B 10 0053 0054 表3 卵巢良性疾病患者石蜡组织切片中NJ003 1特异性抗原免疫组化。
23、结果一览表 说明书 9/13 页 11 CN 105462935 B 11 0055 0056 NJ003-1特异性抗原的表达以细胞浆为主， 与之前的研究结果一致。 在绝大部分卵 巢良性疾病组织中未见该抗原表达， 少量组织呈微弱表达； 卵巢癌组织中可见大部分出现 较多棕黄色或棕褐色颗粒， 显示该抗原的表达明显增强。 0057 NJ003-1特异性抗原在130例卵巢癌及30例卵巢良性疾病中的阳性率分别为 85.4和3.3， 差异有统计学意义(P0.001， 表4)。 0058 表4： NJ003-1特异性抗原在良恶性卵巢组织中的表达 0059 0060 4.2 NJ003-1特异性抗原的表达与卵。
24、巢癌临床病理特征的关系 0061 如表5所示， 低分化卵巢癌患者组织中NJ003-1特异性抗原的阳性表达率显著高于 说明书 10/13 页 12 CN 105462935 B 12 中高分化组(93.3vs.67.5， p0.05)， 且该抗原的阳性表达率随TNM分期的升高而升高， 期卵巢癌患者组织中的阳性率高于 期组(97.1vs.81.2， p0.05)； 有淋巴 结转移的患者其阳性率高于无淋巴结转移者(96.7vs.81.0， p0.05)， 差异均有统计学 意义。 NJ003-1特异性抗原的表达与卵巢癌患者的年龄、 肿瘤的大小， 组织学类型无显著关 系。 0062 表5 NJ003-1。
25、特异性抗原的表达与卵巢癌患者临床病理特征之间的关系 0063 0064 上述实验结果表明： NJ003-1特异性抗原在大部分卵巢癌组织中表达水平较高， 且 特异性很高， 而在卵巢良性疾病组织中表达较弱， 提示该抗原可能会影响卵巢癌的进展。 进 一步的分析证实， NJ003-1特异性抗原的表达与卵巢癌的分化程度、 临床分期及淋巴转移有 着密切的关系。 可见， 该抗原的高表达可能提示肿瘤侵袭性与转移能力较强。 因此， 该抗原 可以作为卵巢癌实验诊断的分子靶标， 特别是用于良恶性卵巢肿瘤的鉴别诊断。 0065 实施例5软琼脂克隆形成实验 0066 1、 方法 0067 生理盐水制备3琼脂糖溶液， 高。
26、压蒸汽灭菌。 在6孔细胞培养板中制备双层凝胶 琼脂。 底层为支持层， 将含10FBS的MCcoy 5A培养基与3琼脂糖按5： 1比例混合， 配制成 含0.5琼脂糖的培养基， 2ml/孔， 加入6孔板中， 室温冷却凝固。 收集处于对数生长期的SK- OV-3细胞， 用培养基制成单细胞悬液， 37保温， 取适量的单细胞悬液与3琼脂糖溶液、 不 同浓度单克隆抗体NJ003-1溶液充分混合， 2ml/孔， 铺板制成含0.3琼脂糖的上层琼脂， 每 说明书 11/13 页 13 CN 105462935 B 13 孔含有2104个细胞， 抗体终浓度分别为0、 200 g/ml、 400 g/ml、 800。
27、 g/ml、 1600 g/ml和 2000 g/ml， 每剂量设3个平行孔。 常温下待琼脂凝固后， 将培养板移入37、 5CO2培养箱 中培养2周。 倒置显微镜下计数， 将50个细胞的集落判定为一个克隆， 计算克隆形成率、 抑 制率。 克隆形成率(克隆数/接种细胞数)100； 抑制率(1-实验组克隆形成率/对照 组克隆形成率)100。 0068 2、 结果 0069 在双层琼脂培养基中， 对照组SK-OV-3细胞生长旺盛， 一般7-10天可形成细胞集 落， 2周后观察， 集落数量多且明显增大。 单抗NJ003-1作用后的细胞形成集落显著减少， 且 集落远小于对照组， 部分细胞不能在软琼脂中生。
28、长形成集落， 呈单个散在的细胞。 0070 软琼脂克隆形成实验表明： 单克隆抗体NJ003-1能够有效抑制卵巢癌细胞SK-OV-3 在软琼脂中的克隆形成， 并且其抑制程度与抗体的作用浓度呈正相关。 200 g/ml单抗作用2 周后克隆抑制率为29.79， 400 g/ml单抗组抑制率达65.96， 而800 g/ml或更高浓度的 单抗组几乎无克隆生长(表6)。 统计分析发现： 200 g/ml和400 g/ml单抗组克隆数与对照组 相比显著减少(P0.001， P0.001)， 200 g/ml单抗组和400 g/ml单抗组克隆数相比也有显 著差异(P0.001)。 0071 表6 单抗NJ0。
29、03 1对SK OV 3软琼脂克隆形成的影响(n3) 0072 0073 0074 注： a.克隆形成率(克隆数/接种细胞数)100 0075 b.克隆抑制率(1 实验组克隆形成率/对照组克隆形成率)100 0076 *P0.001， 与对照组比； P0.001， 与200 g/ml单抗组比 0077 实施例6裸鼠移植瘤模型实验 0078 1、 方法： 0079 25只裸鼠随机分为5组， 设为生理盐水组、 单抗组(200 g、 400 g、 800 g 3组)和单 抗对照组， 每组5只。 生理盐水组和单抗组裸鼠经右侧腋部皮下接种SK-OV-3细胞悬液， 2 106个细胞/只。 单抗组接种当天开。
30、始腹腔注射200 l不同浓度的单抗溶液， 分别含200 g、 400 g、 800 g单抗， 前5天每天注射1次， 之后每隔3天注射1次， 连续2周(累计注射9次)。 生理 说明书 12/13 页 14 CN 105462935 B 14 盐水组以等体积的生理盐水代替单抗溶液， 注射时间和途径相同。 单抗对照组5只裸鼠仅在 腹腔注射200 l单抗溶液， 800 g单抗/只， 抗体的注射时间同单抗组。 每日观察小鼠活动、 精 神状况、 进食情况及肿块出现时间等并记录。 自皮下结节出现起， 游标卡尺测量移植瘤长径 (a)及短径(b)， 移植瘤体积Vab2/2。 自接种肿瘤细胞3周后， 裸鼠颈椎脱臼。
31、处死， 解剖分离 肿瘤并称取瘤重、 计算抑瘤率。 抑瘤率(1单抗组平均瘤重/生理盐水组平均瘤重) 100。 0080 2、 结果： 0081 接种细胞后第9天， 生理盐水组种植区最先出现肉眼可见的小结节， 之后2天单抗 组出现小结节， 成瘤率达100。 从第13天起测量肿瘤体积， 观察至第21天。 各组小鼠平均肿 瘤体积表现为： 随着时间延长而增长， 第17天起400 g、 800 g单抗组与生理盐水组相比， 肿 瘤体积的增长速度即有明显延缓， 至观察结束时， 差异持续存在(P0.001， P0.001， 图1A)。 接种细胞3周后处死小鼠， 分离肿瘤并称量肿瘤重量。 生理盐水组、 200 g。
32、、 400 g、 800 g单抗 组平均瘤重分别为(1.980.32)g， (1.610.28)g， (1.190.21)g和(1.110.19)g。 单因 素方差分析进行组间比较， 四组小鼠肿瘤重量具有统计学差异(F12.46,P0.001)； 两两 比较发现400 g、 800 g单抗组平均瘤重显著低于生理盐水组(P0.002,P0.001)； 200 g单 抗组与800 g单抗组间也存在显著差异(P0.011)。 200 g、 400 g、 800 g单抗组抑瘤率 由 低至高分别为18.69、 39.90和43.94(图1B、 C)。 800 g单抗对照组小鼠观察至实验结 束， 全部存活， 生活状态正常， 食欲旺盛， 行动自如， 始终未见异常改变。 0082 结果表明： 单抗NJ003 1在体内能显著抑制人卵巢癌移植瘤的生长。 说明书 13/13 页 15 CN 105462935 B 15 说明书附图 1/2 页 16 CN 105462935 B 16 图1 说明书附图 2/2 页 17 CN 105462935 B 17 。