技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体地，涉及一种鉴定溶藻弧菌数量的荧光探针及其应用。
背景技术
由于微生物在水生生态系统中的物质循环和能量转换中起着积极的作用，其种类组成及其数量变化等可以作为评价水质环境的指标之一。其中，细菌以其生长速度快，繁殖周期短，运转费用低等优点，已被广泛用于评价海洋环境质量的相关研究。
溶藻弧菌是引起弧菌病暴发的主要病原之一，是一种人、水生动物共感染菌，广泛存在于海水、近岸浮游生物和海洋动物中。因其感染宿主广泛，能引起多种海水养殖品种患病受到了国内外学者的广泛关注。已有研究表明溶藻弧菌数量不仅与水体理化因子成正相关，而且与弧菌病的暴发存在内在的联系，因此长期监测水体中溶藻弧菌数量进行其流行病学研究对预测和防控弧菌病有重要意义。目前有较多针对溶藻弧菌检测和鉴定方法，但这些方法均无法在鉴定溶藻弧菌的同时对了解水环境中该细菌具体数量。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种鉴定溶藻弧菌数量的荧光探针。
本发明的另一目的在于提供上述探针在鉴定水环境中溶藻弧菌数量的应用，该探针对溶藻弧菌的特异性及准确性高，并且可以准确鉴定出水环境中该菌的数量。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
一种鉴定溶藻弧菌数量的荧光探针，荧光物质标记于探针核苷酸序列的5’端，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述荧光物质为荧光素Cy3、荧光素Cy5。
本发明还提供上述荧光探针在鉴定水环境中溶藻弧菌数量的应用。
优选地，利用本发明的荧光探针鉴定水环境中溶藻弧菌数量时，荧光探针的加入浓度为80 ng/ml。
一种鉴定水环境中溶藻弧菌数量的方法，包括以下步骤：
S1. 水环境中溶藻弧菌的培养：取环境水样接种于琼脂平板上，置于28℃培养16h；
S2. RNA菌落印迹：将培养后平板上每个单菌落转移至尼龙膜上；
S3. 菌落印迹杂交：将印迹有菌落的尼龙膜转移至杂交液中于60℃预杂交30min；再将尼龙膜转移至含有权利要求1或2所述荧光探针的杂交液中后，60℃杂交16h；再将杂交后的尼龙膜放入洗涤液中洗去多余探针；
S4. 鉴定溶藻弧菌及计数：将洗涤后的尼龙膜在550nm波长下扫描照像，尼龙膜上的阳性克隆即为溶藻弧菌，阳性克隆的数量即为溶藻弧菌数量；
其中，S3所述的杂交液成分为0.9 M NaCl、pH 7.0的50 mM PBS、5 mM EDTA和0.5%SDS。
本发明利用RNA菌落印迹杂交技术，采用荧光标记Val探针与被鉴定细菌的RNA进行杂交，洗去多余的探针后在荧光扫描仪下观察探针与细菌的RNA杂交情况，从而得出被鉴定细菌中目标细菌的数量。
优选地，S1所述琼脂平板为2216E琼脂平板。
优选地，取环境水样，用无菌双蒸水分别稀释100、101、102和103后涂布接种于所述琼脂平板上。
优选地，S2所述RNA菌落印迹的方法为：将无菌尼龙膜充分接触所述平板上生长的菌落15min，再将其取出使尼龙膜接触平板的一面朝上，放置于10% SDS溶液完全浸润的无菌滤纸上10min；再保持接触平板的一面朝上，将尼龙膜转移至3×SSC溶液完全浸润的无菌滤纸上，65℃烘箱中放置15min；将尼龙膜取出后分别在37℃和70℃烘烤10min和15min。
优选地，所述S3在预杂交前将印迹有菌落的尼龙膜放入3×SSC–0.1% SDS溶液中振荡洗涤3次，每次10min；然后将尼龙膜再放入新鲜的3×SSC–0.1% SDS溶液中65℃水浴振荡2h ，然后再进行预杂交。
优选地，S2所述洗涤为于60℃的洗涤液中洗涤30min。
优选地，S1~S3所有溶液配制所用无菌双蒸水均加入0.1%DEPC。
优选地，S3所述预杂交的杂交液的加入量为每100cm2尼龙膜中加入10mL。
优选地，S3所述洗涤液成分为1% SDS和1×SSC。
与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：本发明利用RNA菌落印迹杂交技术，采用荧光Cy3标记Val探针探针与被鉴定细菌的RNA进行杂交，洗去多余的探针后在荧光扫描仪下观察探针与细菌的RNA杂交情况，从而得出被鉴定细菌中目标细菌的数量。该探针对溶藻弧菌的特异性及准确性高，不会与其他细菌产生假阳性，应用RNA菌落印迹杂交技术提供了一种简便快捷、准确率高的鉴定水环境中溶藻弧菌数量的方法，对弧菌流行病学的研究具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1鉴定水环境溶藻弧菌数量结果；A为阳性对照；B为稀释101海水水样；B为稀释100海水水样；D为阴性对照。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明下述实施例设计了一种荧光Cy3标记Val探针，荧光物质Cy3标记于探针核苷酸序列的5’端，探针的核苷酸序列为5’-TTT CCA CAT CGT CGT TCG TGA CAA GTT CG-3’。本发明所述探针设计完成后由上海生工生物工程有限公司合成。
实施例1
本实施例采用的环境样品：湛江麻斜海域环境海水。
检测方法：用无菌移液器取100μL海水水样，用无菌双蒸水分别稀释100、101、102和103后，取100μL涂布接种于2216E琼脂平板上，置于28℃的生化培养箱中培养16h（菌落直径不超过5mm）；将无菌尼龙膜剪成直径略小于琼脂平板的圆形后放入培养有异养弧菌的琼脂平板中，用无菌镊子使尼龙膜充分接触琼脂上生长的菌落15min，再将其取出放置于10% SDS溶液完全浸润的无菌滤纸上（接触平板的一面朝上）10min，然后将尼龙膜转移至3×SSC溶液完全浸润的无菌滤纸上（接触平板的一面朝上），65℃烘箱中放置15 min；将尼龙膜取出后分别在37℃ 和70℃烘烤10 min和15min；将印迹有菌落的尼龙膜放入3×SSC–0.1% SDS溶液中振荡洗涤3次，每次10min；然后将尼龙膜再放入新鲜的3×SSC–0.1% SDS溶液中65℃水浴振荡2h；将尼龙膜转移至杂交液中后置于60℃杂交炉中预杂交30min；再将尼龙膜转移至含有荧光Cy3标记Val探针的杂交液中后置于60℃杂交炉中杂交16h；将杂交后的尼龙膜放入洗涤液中后置于60℃杂交炉中洗涤30min；将洗涤后的尼龙膜放入Typhoon多功能激光扫描成像系统中，550nm波长下扫描照像，尼龙膜上的阳性克隆数量结果如表1所示。
在细菌菌落计数时选择适宜的检样稀释度是重要的，因为平板上菌落数过多时菌落相互重叠及产生拮抗的机会增加，而菌落数过少又具有偶然性，这两种情况都影响检验结果的正确性。按照现行通用做法，一般以一个平板上的菌落数在30～300作为菌落总数测定标准，因此本实施例中海水中溶藻弧菌数量的测定以海水稀释度为100的实验组结果为准，因此，湛江麻斜海域环境海水样品中溶藻弧菌数量为1.66×103 CFU/mL。
表1 不同梯度环境海水样本阳性克隆数量
准确度分析：将上述环境海水稀释100后涂布接种于2216E琼脂平板上培养16h后，随机挑选100个单菌落并标记位置及编号1~100，并进行以下两组实验：用无菌接种环挑取100个单菌落中的少量菌重新接种于一个新的2216E琼脂平板上继续培养16h后，用Biolog全自动微生物鉴定系统对编号的细菌种类进行鉴定，作为鉴定组，鉴定为溶藻弧菌的为阳性结果，其余为阴性结果；将上述培养了16h的2216E琼脂平板按照本实施例的方法进行RNA菌落印迹杂交，照相观察尼龙膜上编号的细菌，作为实验组，杂交成功的为阳性，其余为阴性结果。
鉴定组和实验组的比较结果如表2所示。表2显示，实验组阳性克隆的细菌编号与鉴定组鉴定出为溶藻弧菌的细菌编号完全一致，表明本实施例鉴定溶藻弧菌的准确率达100%，采用荧光Cy3标记Val探针与溶藻弧菌进行RNA印迹杂交不会与其它细菌产生假阳性。
表2 实施例1应用RNA菌落印迹杂交鉴定溶藻弧菌结果的准确度
实施例2
本实施采用的环境样品：正在暴发弧菌病期间取样的湛江麻斜斜带石斑鱼养殖网箱内海水。
检测方法：用无菌移液器取100μL海水水样，用无菌双蒸水分别稀释100、101、102和103后取100μL涂布接种于2216E琼脂平板上，置于28℃的生化培养箱中培养16h（菌落直径不超过5mm）；将无菌尼龙膜剪成直径略小于琼脂平板的圆形后放入培养有异养弧菌的琼脂平板中，用无菌镊子使尼龙膜充分接触琼脂上生长的菌落15min，再将其取出放置于10% SDS溶液完全浸润的无菌滤纸上（接触平板的一面朝上）10min，然后将尼龙膜转移至3×SSC溶液完全浸润的无菌滤纸上（接触平板的一面朝上），65℃烘箱中放置15 min；将尼龙膜取出后分别在37℃ 和70℃烘烤10 min和15min；将印迹有菌落的尼龙膜放入3×SSC–0.1% SDS溶液中振荡洗涤3次，每次10min；然后将尼龙膜再放入新鲜的3×SSC–0.1% SDS溶液中65℃水浴振荡2h；将尼龙膜转移至杂交液中后置于60℃杂交炉中预杂交30min；再将尼龙膜转移至含有荧光Cy3标记Val探针的杂交液中后置于60℃杂交炉中杂交16h；将杂交后的尼龙膜放入洗涤液中后置于60℃杂交炉中洗涤30min；将洗涤后的尼龙膜放入Typhoon多功能激光扫描成像系统中，550nm波长下扫描照像，尼龙膜上的阳性克隆数量结果如表3所示。按照现行通用做法，一般以一个平板上的菌落数在30～300作为菌落总数测定标准，因此本实施例中海水中溶藻弧菌数量的测定以海水稀释度为101的实验组结果为准，因此，湛江麻斜斜带石斑鱼养殖网箱内海水样品中溶藻弧菌数量为5.8×103CFU/mL。
表3 不同梯度养殖网箱内海水样本阳性克隆数量
注：N为无法计数。
准确度分析：将上述环境海水稀释101后涂布接种于2216E琼脂平板上培养16h后，随机挑选103个单菌落并标记位置及编号1~103，并进行以下两组实验：用无菌接种环挑取103个单菌落中的少量菌重新接种于一个新的2216E琼脂平板上继续培养16h后，用Biolog全自动微生物鉴定系统对编号的细菌种类进行鉴定，作为鉴定组，鉴定为溶藻弧菌的为阳性结果，其余为阴性结果；将上述培养了16h的2216E琼脂平板按照本实施例的方法进行RNA菌落印迹杂交，照相观察尼龙膜上编号的细菌，作为实验组，杂交成功的为阳性，其余为阴性结果。
鉴定组和实验组的比较结果如表4所示。表4显示，实验组阳性克隆的细菌编号与鉴定组鉴定出为溶藻弧菌的细菌编号完全一致，表明本实施例鉴定溶藻弧菌的准确率达100%，采用荧光Cy3标记Val探针与溶藻弧菌进行RNA印迹杂交不会与其它细菌产生假阳性。
表4 实施例2应用RNA菌落印迹杂交鉴定溶藻弧菌结果的准确度
对比例1
本对比例所用的环境样品与检测方法与实施例1基本相同，不同之处仅在于本对比例选用的探针为Cy3标记Ual探针（该探针与本发明探针Val均是溶藻弧菌附着定植因子acfA基因的某一段特异性区域），用Ual探针代替实施例1中的Val探针后用RNA菌落印迹杂交鉴定溶藻弧菌，同时随机挑选100个单菌落按照与实施例1相同的方法进行准确度分析，其检测结果如表5。结果表明基于Ual探针的RNA菌落印迹杂交不仅能检测溶藻弧菌，还会与副溶血弧菌（编号4、11、12、23、39、55、69、82、96）、哈氏弧菌（编号19、25、32、37、44、52、53、59、66、75、76、77、83、86、89）等出现假阳性结果，说明其鉴定溶藻弧菌数量的准确率低。
其中，上述含有荧光Cy3标记Ual探针核酸序列为5’- ACT GGG TTA CAG CCA GTT TGA CCT TGA TGA TAG-3’。
上述Ual探针与本发明Val探针均是按照选择溶藻弧菌附着定植因子acfA基因在种间差异大而在种内保守的对溶藻弧菌具有特异性的序列片段，然后应用引物设计软件设计进一步设计出的探针，即探针Ual和Val在设计中基于同样的原则。尽管探针的筛选和验证均可以采用常规的方法，然而具体选择哪个特异性区域的探针作为鉴定溶藻弧菌数量的探针且其效果又特别好的，还未有技术报道过。
表5 对比例1应用Ual探针RNA菌落印迹杂交鉴定溶藻弧菌结果的准确度
SEQUENCE LISTING
<110> 广东海洋大学
<120> 一种鉴定溶藻弧菌数量的荧光探针及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> Val探针
<400> 1
tttccacatc gtcgttcgtg acaagttcg 29