技术领域
本发明涉及一种生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一种用于致病性霍乱弧菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒。
背景技术
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是能引起一类以腹泻为主要症状的烈性传染病的一种致病菌，临床上以剧烈无痛性泻吐、米泔水样大便、严重脱水、肌肉痛性痉挛及周围循环衰竭等为特征，急性霍乱患者如不及时治疗，死亡率高达50％。霍乱弧菌的快速准确鉴定，对该病的预防和治疗有着重要作用。
目前，已发现霍乱弧菌有200多个血清群中，只有O1群和O139群霍乱弧菌能引起霍乱大面积流行，但是非O1群和非O139群霍乱弧菌毒力因子与O1群和O139群霍乱弧菌相似，在抗原漂移和毒力岛水平转移等作用下，非O1群和非O139群霍乱弧菌可获得O1群霍乱弧菌毒力基因,成为新的流行株。非01群霍乱弧菌足一群在形态和生化特性上与01群霍乱弧菌难以区分，但对01群血清不凝的弧菌，该菌分布广，我国目前自外环境和唆泻患者中至少已分离出70个非01群霍乱弧菌血清型。而且非O1群和非O139群霍乱弧菌引起的腹泻病例有超过沙门菌和志贺菌的报道，因此，霍乱弧菌菌种检测是控制霍乱疫情的关键。
霍乱的检测方法包括生化培养、血清学试验及噬菌体分型等，这些方法存在着检出率偏低，检查时间长的缺点，往往达不到疫情控制的需要。质粒DNA标准物质是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定量分析的标准曲线。目前质粒DNA分子作为基因检测的标准物质得到了越来越多的深入研究和应用。在实际霍乱弧菌检测中，现有的质粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性。因此本领域中仍然缺乏能够快速、准确的鉴定霍乱弧菌的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于霍乱弧菌实时荧光定量PCR检测的质粒标准分子及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸中包含霍乱弧菌的外膜蛋白ompW基因序列，以及任选地引物对，所述的引物对选自下组：
(1)SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示的序列构成的引物对；
(2)SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的序列构成的引物对；
(3)SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的序列构成的引物对。和
(4)SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的序列构成的引物对。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的探针序列：
SEQ ID NO.:11所示的探针序列。
本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含霍乱弧菌的外膜蛋白ompW基因序列。
在另一优选例中，所述霍乱弧菌的外膜蛋白ompW基因序列选自下组：
(a)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸序列；
(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸序列；
(c)序列与SEQ ID NO.:1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为100bp-675bp(较佳地150-660bp，更佳地200-500bp)的多核苷酸序列；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
本发明的第三方面，提供了一种分离的DNA构建物，所述DNA构建物中包含本发明第二方面所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动子序列和/或载体序列。
在另一优选例中，所述DNA构建物为线性DNA构建物或环状DNA构建物。
在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体。
在另一优选例中，所述的质粒或表达载体作为霍乱杆菌检测的标准分子(质粒标准分子)。
在另一优选例中，所述质粒或表达载体的骨架质粒选自下组：pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScript II SK和pGEM。
在另一优选例中，所述质粒的序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第二方面所述的多核苷酸或者本发明第三方面所述的DNA构建物。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物对，所述的引物对选自下组：
(1)SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示的序列构成的引物对；
(2)SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的序列构成的引物对；
(3)SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的序列构成的引物对。和
(4)SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的序列构成的引物对。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的探针序列：
SEQ ID NO.:11所示的探针序列。
本发明的第五方面，提供了如本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的DNA构建物、或本发明第四方面所述的试剂盒的用途，用于霍乱弧菌的检测。
在另一优选例中，所述检测为非诊断或治疗目的。
在另一优选例中，所述检测为荧光定量PCR检测。
本发明的第六方面，提供了一种霍乱弧菌实时荧光定量PCR检测方法，所采用的标准物质是如本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的DNA构建物。
本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸产品，所述产品包括：
(i)霍乱杆菌标准品，所述的标准品选自：本发明第二方面所述的多核苷酸或者本发明第三方面所述的DNA构建物；
(ii)特异性扩增霍乱杆菌序列的引物对，所述引物对为：
SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示的序列构成的引物对；
本发明的第八方面，提供了一种霍乱弧菌的质粒标准分子的制备方法，包括以下步骤：
①人工合成霍乱弧菌的外膜蛋白基因序列，所述外膜蛋白表达基因序列如SEQ ID NO.:1所示；
②将步骤①所得基因序列克隆至克隆载体上，得到霍乱弧菌的质粒标准分子。
在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScript II SK或pGEM。
在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为pUC19。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是本发明质粒标准分子PLW05的图谱。
图2是本发明所得质粒标准分子PLW05稳定性检测结果图。
图3是利用本发明质粒标准分子PLW05建立的实时荧光PCR标准曲线。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一段能够用于霍乱弧菌PCR检测的多核苷酸序列以及与之相配合的引物对，实验结果表明，采用合适的骨架质粒将所述多核苷酸序列制备为标准质粒分子，并配合本发明的引物对进行实时荧光PCR检测，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。
本发明中提供的多核苷酸序列以及与之相配合的引物对能够区分致病型的霍乱弧菌和非致病型的霍乱弧菌。
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的霍乱弧菌实时荧光PCR检测方法中缺乏阳性标准品和阳性标准品配置的问题，提供了一种适用于霍乱弧菌实时荧光PCR检测的质粒标准分子以及该质粒标准分子的构建方法、定量方法和应用。
实时荧光PCR检测霍乱弧菌的原理
OmpW是霍乱弧菌的主要外膜蛋白之一，由ompW基因编码，可能与对宿主黏附和侵袭过程有关，抗原表位序列高度保守，可作为霍乱弧菌种特异性抗原，用于霍乱弧菌快速检测靶标。
本发明的荧光定量PCR方法可以快速、灵敏地根据霍乱弧菌的特异基因序列的检出情况，在几小时内即可完成菌株的检出。
采用本发明的实时荧光PCR技术可特异性扩增霍乱弧菌基因组DNA中外膜蛋白表达基因ompW序列，设计针对以上靶基因的引物和两端标记荧光的探针，扩增测试样品DNA。实时荧光PCR可以通过检测荧光信号的增加来实时监测PCR产物。与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质(或阳性标准分子)。PCR方法中，阳性标准物质(或阳性标准分子)可以作为阳性对照；实时荧光PCR中，阳性标准物质(或阳性标准分子)可以构建稳定的标准曲线，根据标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量(拷贝数或浓度)。
标准物质
标准物质是具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准设备，评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。
质粒标准分子
本发明中涉及两种检测霍乱弧菌的特异性序列并在此基础上设计了两种质粒标准分子，一种霍乱弧菌的特异性序列是霍乱弧菌外膜蛋白表达基因ompW的一部分，长度为654bp；
本发明提供了一种霍乱弧菌的质粒标准分子，该质粒标准分子包含霍乱弧菌外膜蛋白表达基因ompW序列，所述霍乱弧菌外膜蛋白表达基因ompW基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示：
本发明的质粒标准分子，较佳地含有霍乱弧菌的PCR检测的靶基因霍乱弧菌外膜蛋白表达基因ompW基因序列。
本发明中所述的霍乱弧菌外膜蛋白表达基因ompW基因，在DNA、RNA和蛋白质的合成中起作用，它可作为霍乱弧菌检测的一种靶基因，所述霍乱弧菌外膜蛋白表达基因ompW的序列较佳的如SEQ ID NO：1所示。
在本发明的另一个较佳的实施方式中，本发明所述的质粒标准分子的序列如SEQ ID NO：2所示，其中第423位到第1076位为ompW基因序列：
本发明中如上所述霍乱弧菌的质粒标准分子的定量方法，其包括以下步骤：
①提取质粒标准分子；
②根据步骤①所得的质粒标准分子的碱基组成和序列长度，计算质粒标准分子中的磷元素的含量；
③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出高分辨电感耦合等离子体发射质谱的标准曲线；
④高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测质粒标准分子溶液，并根据步骤③所得的标准曲线得出质粒标准分子溶液的磷含量；
⑤根据步骤④所得的质粒标准分子溶液的磷含量和步骤②所得的质粒标准分子中的磷元素的含量，计算出质粒标准分子的浓度。
其中步骤所述③高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测的条件如下：冷却气流量较佳地为10L/min～25L/min，最佳地为16.86L/min，辅助气流量较佳地为0.5L/min～3.0L/min，最佳地为0.88L/min，雾化气流量为较佳地为0.5L/min～2.43L/min，更佳地为1.123L/min，功率较佳地为1200W～1400W，最佳地为1350W。
本发明所述质粒标准分子的定量方法较佳地包括紫外分光光度法和高分辨电感耦合等离子体质谱(HR-ICP-MS)。
具体实施说明：
本发明所述质粒标准分子的定量方法较佳地包括紫外分光光度法和高分辨电感耦合等离子体质谱(HR-ICP-MS)。
其中紫外分光光度法对质粒标准分子定量方法较佳地包括以下步骤：
①提取质粒标准分子；
②用TE缓冲液使紫外分光光度计校正为零点；
③取适量DNA(根据仪器的需要)至比色杯中(nanodrop直接点在检测区域)，记录仪器读数。
④若可直接读出DNA浓度则直接记录；若不可，则记录样品在260nm和280nm的光密度，DNA样品的浓度为OD260×核酸稀释倍数×50，浓度单位为ng/μL。
(2)HR-ICP-MS对质粒标准分子定量方法较佳地包括以下步骤：
①提取质粒标准分子；
②根据质粒标准分子的碱基组成和序列长度，分别计算各质粒标准分子的磷元素的含量；
③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出HR-ICP-MS的标准曲线。
④HR-ICP-MS检测质粒标准分子，并根据标准曲线得出质粒标准分子的磷含量。
⑤根据质粒标准分子的磷含量计算出质粒标准分子的浓度。
本发明还提供了一种霍乱弧菌实时荧光定量PCR检测方法，其所采用的标准物质是如上所述的质粒标准分子。
本发明还提供了一种如上所述的霍乱弧菌的质粒标准分子的制备方法，包括以下步骤：
①人工合成所述霍乱弧菌的特异性序列，所述序列如SEQ ID NO：1所示；
②将步骤①所得霍乱弧菌的序列克隆至克隆载体上，得到霍乱弧菌的质粒标准分子。
其中步骤①所述的人工合成的方法较佳地为：全基因合成或者PCR引物扩增的方法获得该序列。
本发明所述质粒标准分子构建方法较佳地包括以下步骤：
①NCBI(美国国立生物技术信息中心)的Genbank中查询霍乱弧菌的外膜蛋白ompW基因；
②对上述序列进行分析，选择合适的序列和合适的酶切位点，并将酶切位点加至所选择序列的5’端和3’端。
③将处理后的序列进行全基因人工合成服务，包括单链Oligo DNA的合成、DNA片段拼接等工作，并将全长基因克隆至质粒载体中，获得质粒标准分子。
所述的质粒载体可以是常规载体，较佳的是克隆载体，更佳的是能够在大肠杆菌中增殖的克隆载体，所述克隆载体较佳地为：pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScript II SK或pGEM系列载体，优选地为pUC19克隆载体。
④测序验证质粒标准分子的序列。
⑤质粒标准分子的实时荧光PCR检测方法验证。
所述的实时荧光PCR检测方法验证，是指检测质粒标准分子在进行实时荧光PCR分析时的特异性和构建标准曲线能力等特性，以鉴定该质粒标准分子作为实时荧光PCR方法检测霍乱弧菌的标准物质的能力。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的主要优点在于：
(1)包含本发明多核苷酸序列的质粒标准分子具有均匀性强，稳定性高的优点，同时本发明解决了霍乱弧菌实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题， 保证霍乱弧菌实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为霍乱弧菌实时荧光PCR方法检测提供质量控制；
(2)使用本发明的质粒标准分子配合本发明的引物对制备的产品，用于实时荧光PCR检测霍乱弧菌时，特异性强，灵敏度高，线性稳定。
(3)本发明提供的试剂盒中包含了检测霍乱弧菌的致质粒标准分子(携带外膜蛋白表达基因ompW的PLW05质粒标准分子)和对应的高效引物，使用便捷，性能稳定，重现性好。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1质粒标准分子的构建
实验试剂和实验仪器：
质粒大量提取试剂盒(OMEGA)，其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯生化试剂；实验仪器包括离心机、恒温水浴锅、恒温培养摇床、移液枪等。
实验方法包括以下步骤：
1、在GenBank中搜索霍乱弧菌的基因外膜蛋白表达基因ompW基因基因序列；
2、对上述序列进行分析，选择合适的序列和合适的酶切位点，基因外膜蛋白表达基因ompW基因基因序列长度为654bp，两端加上BamHI酶切位点；
3、将处理后的序列送至宝生物工程(大连)有限公司，由其负责进行全基因人工合成服务，包括单链Oligo DNA的合成、DNA片段拼接等工作，所得基因外膜蛋白表达基因ompW基因基因的序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，将所得全长基因克隆至质粒载体pUC19(购自TAKARA公司)中，构建获得包含OMPW基因序列的质粒标准分子PLW05(其序列如序列表中SEQ ID NO:4所示)，构建所得质粒标准分子PLW05的质粒图谱如图1所示。
4、大量培养含有包含所得质粒标准分子PLW05的重组大肠杆菌，利用质粒大量提取试剂盒(OMEGA)提取质粒，获得高纯度的质粒标准分子PLW05。经过紫外分光光度计以及电泳进行纯度分析，之后质粒DNA标准分子置于-20℃保存，抽提质粒的方法包括以下步骤：
a、将100～200mL过夜培养的细菌于室温5000×g离心10分钟，弃去上清；
b、加入12mL SolutionⅠ(含有RNase A)，振荡充分混匀；
c、加入12mL SolutionⅡ，上下颠倒温和混匀，室温放置2分钟以使菌体充分裂解；
d、加入16mL SolutionⅢ，立即上下充分颠倒混匀数次，直至形成均匀的白色沉淀；
e、≥12000×g，4℃离心10分钟；
f、吸取20mL上清小心地移至一个干净的HiBind Maxi吸附柱中(置于50mL收集管中)，5000×g室温离心5分钟；
g、弃去收集管中的液体，加入10mL Buffer HB清洗吸附柱，5000×g室温离心5分钟；
h、弃去收集管中的液体，加入15mL DNA Wash Buffer(无水乙醇稀释)清洗吸附柱；
i、重复上述清洗步骤；
j、6000×g离心15分钟以干燥吸附柱；
k、将吸附柱置于一个干净的50mL管中，加入2mL～3mLTE缓冲液，室温放置1～2分钟，8000×g离心2分钟以洗脱DNA，所得DNA溶液即为提取的质粒标准分子溶液，保存在-20℃。
5、测序验证质粒标准分子PLW05
将提取的质粒标准分子送至八家测序公司进行序列验证，八家测序公司分别为北京六合华大基因科技股份有限公司、上海博尚生物技术有限公司、英潍捷基(上海)贸易有限公司、上海杰李生物技术有限公司、上海美吉生物技术有限公司、上海生工生物技术有限公司、苏州金唯智生物科技有限公司、宝生物生物工程有限公司。对于质粒DNA标准物质来说，序列长度与定量有直接关系，8家不同的测序公司进行序列测定是标准物质研制中对于定值的要求。详见ISO导则35，标准物质定值部分的具体要求。
序列考察公式：序列正确率＝正确碱基数目/碱基总数
测序结果证明，所有参与序列验证的单位得到的序列正确率为100％，该质粒序列中的第423位到第1076位为基因外膜蛋白表达基因ompW基因基因。
实验结果为：经过序列选择步骤、全基因人工合成步骤以及质粒大量提取等步骤得到高纯度的质粒标准分子PLW05，经测序验证，该质粒标准分子插入片段序列与设计完全相符。
实施例2质粒标准分子PLW05的均匀性检验
均匀性是表征物质中一种或多种特性相关的结构或组成的一致性状态。通过测量取自不同包装单元(如瓶、包等)或取自同一包装单元不同位置的规定大小的样品，测量结果落在规定不确定度范围内，则可认为该标准物质对指定的特性量是均匀的。均匀性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质特性的空间分布特征。在标准物质的研制(生产)过程中必须进行均匀性评估，以证明其具有良好的均匀性。均匀性良好的质粒标准分子，其量值不会受到分装等因素的影响，各瓶间的量值差异不大，因此保证了检测结果的可靠性。
实验试剂TE缓冲液(pH7.5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。
实验方法：
1、按照《JJG 1006-1994一级标准物质技术规范》均匀性抽取样品要求，从各质粒DNA标准物质中随机抽取15瓶。
2、对所取每个样品取样3次，每次取样量为1μL。每个取样量用紫外分光光度重复测定3次，取平均值。
3、对测定结果用F检验法进行统计，判断均匀性检验结果。具体方法为：抽取m个样本，在相同条件下测得m组等精度测量数据，如果测定方差无显著性差异，则应满足下式的统计要求。
F = Q 1 v 1 Q 2 v 2 ≤ F α ( v 1 , v 2 ) ]]>
其中组间差方和计算公式为：
Q 1 = Σ i = 1 m n i ( x i ‾ - x = ) 2 ]]>
组内差方和计算见公式为：
Q 2 = Σ i = 1 m Σ j = 1 nj ( x ij - x ‾ i ) 2 ]]>
ν1＝m-1(组间自由度)
ν2＝N-m(组内自由度)。
实验结果：
1、质粒标准分子PLW05的均匀性检验结果分别如表1－2所示
表1质粒标准分子PLW05均匀性检验数据(单位：ng/μL)
样品 重复1 重复2 重复3 平均值 1 81.4 81.9 81.8 81.70 2 80.5 82.4 82.6 81.83 4 79.8 82 80.6 80.80 5 83.2 80.7 82.5 82.13 6 80.5 81.6 80.7 80.93 7 80.6 80.5 82.4 81.17 8 80.8 81.8 81.2 81.27 9 82.6 81.7 83.1 82.47 10 82.6 82 80.4 81.67 11 82.1 83.7 83.5 83.10 12 80.6 82.2 83.1 81.97 13 84.3 82.5 82.6 83.13 14 82.1 82.8 83.9 82.93 15 83.9 82.2 81.3 82.47
表2质粒标准分子PLW05的均匀性统计结果
质粒DNA标准物质 Q1 Q2 F值 F0.05(14，30) PLW05 25.99 29.14 1.91 2.04
PLW05的均匀性统计结果见表2，在95％置信水平下，F值小于F0.05(14，30)，证明该质粒标准分子PLW05是均匀的，符合《JJG1006-94一级标准物质技术规范》均匀检验合格要求。
实施例3质粒标准分子PLW05的稳定性考察
稳定性是指在特定的时间间隔和贮存条件下，标准物质的特性值保持在规定范围内的能力。稳定性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质的特性随时间变化的性质，即描述标准物质特性的时间分布特征。在标准物质的研制过程中必须进行稳定性评估。稳定性评估不但能评估与材料稳定性相关的测量不确定度，而且能明确合适的保存和运输条件。稳定性良好的质粒标准分子，其特性值在合适的保存和运输条件下不会随着时间的推移而改变，检测结果不会受其不稳定性的影响，保证了检测结果的可靠性。
实验试剂TE缓冲液(pH7.5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。
实验方法：
采用经典稳定性研究对质粒标准分子的稳定性进行考察，即同时制备的样品在相同条件下随着时间的推移进行测量。
1、在质粒标准分子制备完成后的第0个月、0.5个月、1个月、2个月、4个月、6个月、9个月、12个月对制备的质粒标准分子(-20℃保存)随机抽取3瓶，每个样品重复测定3次，取平均值，进行长期稳定性考察。本研究采用了紫外分光光度法对质粒标准分子进行了跟踪考察。
2、对稳定性检测数据进行评估，判断稳定性考察结果。具体考察方法如下：
直线斜率可用下式计算：
β 1 = Σ i = 1 n ( X i - X ‾ ) ( Y i - Y ‾ ) Σ i = 1 n ( X i - X ‾ ) 2 ]]>
式中：Xi——第i个时间点；Yi——第i个时间点的观测值；——所有时间点的平均值；——所有观测值的平均值。
截距可由下式计算：
β 0 = Y ‾ - β 1 X ‾ ]]>
直线上每点的标准偏差可用下式计算：
s 2 = Σ i = 1 n ( Y i - β 0 - β 1 X i ) 2 n - 2 ]]>
式中：Xi——第i个时间点；Yi——第i个时间点的观测值；β1，β0——回归系数；n——测量系数。
β1的标准偏差由下式给出：
s ( β 1 ) = s Σ i = 1 n ( X i - X ‾ ) 2 ]]>
基于β1的标准偏差，可用t-检测进行以下判断：即若|β1|＜t0.95,n-2·s(β1)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性。
实验结果：
1、质粒标准分子PLW05稳定性考察结果如表3和图2所示：
表3质粒标准分子PLW05的稳定性监测数据(单位：ng/μL)
时间(月) 重复1 重复2 重复3 平均值 SD 0 85.1 84.5 83.75 84.45 0.68 0.5 82.9 83.4 83.9 83.40 0.50 1 82.8 82.1 81.9 82.27 0.47 2 80.4 77.8 83.4 80.53 2.80 4 79 78.9 79 78.97 0.06 6 82.1 84.2 81.6 82.63 1.38 9 84.55 81.95 81.65 82.72 1.59 12 78.53 78.73 80.67 79.31 1.18
统计结果如表4所示。
表4质粒标准分子PLW05的稳定性统计结果
质粒DNA标准物质 β1 β0 s(β1) t0.95,n-2·s(β1) PLW05 0.22 82.71 0.16 0.39
由统计结果可知，质粒标准分子PLW05在-20度条件下保存12个月是稳定的。
实验例4用紫外分光光度法对质粒标准分子进行定量
实验试剂TE缓冲液(pH7.5)。实验仪器Nanodrops ND-2000。
实验方法包括以下步骤：
1、用TE缓冲液使紫外分光光度计校正为零点；
2、取实施例制备所得DNA溶液1μL，直接点在检测区域，记录仪器读数；
3、直接读出DNA浓度，浓度单位为ng/μL。
4、每个样品测试八次，取平均值。
实验结果：
1、经过紫外分光光度法定值，质粒标准分子PLW05的浓度如表5所示：
表5紫外分光光度法定值结果(单位：ng/μL)
质粒 重复1 2 3 4 5 6 7 8 平均值 SD PLW05 81.4 80.5 79.8 83.2 80.5 80.6 80.8 82.6 81.18 1.16
实施例5用HR-ICP-MS对质粒标准分子PLW05进行定量
实验试剂为P标准溶液(NIST，SRM3139a)。实验仪器为：电感耦合等离子体发射质谱仪(Thermofi sher element2)。
实验方法包括以下步骤：
1、根据质粒标准分子的碱基组成和序列长度，分别计算其中磷元素的含量；
2、HR-ICP-MS实验参数为：冷却气流量16.86L/min，雾化气流量为1.123L/min，辅助气流量为0.99L/min，功率1350W。
3、配制梯度浓度的磷标准溶液(0、1、2、3、4、5g/L)，并用此标准溶液作出HR-ICP-MS的标准曲线；
4、将质粒标准分子稀释3000倍，HR-ICP-MS检测稀释后的质粒标准分子，并根据标准曲线得出稀释后的质粒标准分子的磷含量；
5、根据测得的磷含量和稀释倍数计算出质粒标准分子的浓度；
6、每个样品测试八次，取平均值。
实验结果：
1、经计算，质粒标准分子PLW05的磷元素的含量为10.22％。经过HR-ICP-MS定值得到质粒标准分子磷元素含量数据如表6所示，稀释倍数为3000，换算得到质粒分子的质量浓度，如表7所示。
表6质粒标准分子PLW05的磷元素含量(单位：μg/L)
表7质粒标准分子PLW05的质量浓度结果(单位：ng/μL)
实施例6研制的质粒标准分子PLW05在实时荧光PCR检测中的应用
实验试剂：针对PLW05质粒标准分子，设计了数十对引物，将设计的引物和探针交由宝生物工程(大连)有限公司合成，Master Mix购自Life technology 公司。实验仪器包括：实时荧光定量PCR扩增仪(Life technology)离心机、恒温水浴锅、培养箱、天平等。
质粒标准分子PLW05在实时荧光PCR检测中的应用：
引物(分别使用表8中所示引物)、探针、PCR检测体系
PCR加样体系：
反应条件PCR程序：
95℃10分钟；
95℃15秒，60℃1分钟，40个循环。
将实施例1制备所得的质粒标准分子PLW05稀释为不同浓度的质粒标准分子(2.43×106copies/μL、2.43×105copies/μL、2.43×104copies/μL、2.43×103copies/μL、2.43×102copies/μL、2.43×101copies/μL、2.43×100copies/μL)将不同浓度的质粒标准分子分别作为模板，按照文献中的方法进行实时荧光PCR扩增。每个反应重复三次，根据不同浓度模板扩增的Ct值与浓度之间的关系，建立标准曲线。
实验结果
1、本实例中对数十对引物进行了测试，实验结果表明有4对引物能够针对霍乱弧菌的外膜蛋白的基因序列进行有效扩增。最终获得的能够成功扩增目标序列的引物和探针序详见表15。
表8实验中采用的引物和探针序列
针对霍乱弧菌的外膜蛋白的基因序列，引物对1的检测效果最好，特异性强，扩增后没有非特异性的条带出现，检测灵敏度最高，最低可检测2.43copies/μL的目标序列；引物对2和3的灵敏度较低，能够检测到2.43×102copies/μL的目标序列；引物对4能够检测到2.43×101copies/μL的目标序列，但是特异性较差，有非特异性条带出现。
2、质粒标准分子PLW05在实时荧光PCR检测中的应用
分别以不同浓度的质粒标准分子PLW05(如：2.43×106copies/μL、2.43×105copies/μL、2.43×104copies/μL、2.43×103copies/μL、2.43×102copies/μL、2.43×101copies/μL、2.43×100copies/μL)作为标准品采用引物对1建立实时荧光PCR的标准曲线。建立的标准曲线见图3，相关系数达到0.997，线性良好，表明质粒标准分子PLW05适合应用于实时荧光PCR检测，可作为实时荧光PCR扩增霍乱弧菌的阳性标准物质。
在实际霍乱弧菌检测时，可利用该线性良好引物对制作的标准曲线，通过实验荧光PCR方法检测出待测样品中霍乱弧菌特定基因的拷贝数，并可根据霍乱弧菌特定基因的拷贝数与细菌总数之间的线性关系，换算出霍乱弧菌的具体个数。
由于目前针对霍乱弧菌实时荧光PCR检测方法的标准物质的研发仍是空白，在实际霍乱弧菌实时PCR检测时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性、有效性和可靠性。因此，本质粒标准分子可以解决实时荧光PCR检测霍乱弧菌时缺乏标准物质的难题，适用于多种扩增霍乱弧菌ompW基因的实时荧光PCR方法，保证检测结果的可比性，为霍乱弧菌实时荧光PCR方法检测提供生物计量技术支持。
本发明获得的一段能够用于霍乱弧菌PCR检测的多核苷酸序列以及与之相配合的引物对，采用合适的骨架质粒将所述多核苷酸序列制备为标准质粒分子，并配合本发明的引物对进行实时荧光PCR检测，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。