技术领域
本发明涉及一种与α-鹅膏毒肽特异结合的核酸适配体及应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
核酸适配体是一类能与靶分子特异性、高亲和力结合的寡核苷酸分子（DNA或RNA），可通过SELEX技术，从特定的寡核苷酸库中筛选得到。由于其具有靶分子范围广、分子质量小、免疫原性低、易于化学合成、改造和标记等优点，核酸适配体在临床诊断鉴定和疾病治疗等领域中具有重要的应用价值。
鹅膏菌毒素（amanitin）是从毒蘑菇中分离出来的一种多肽类物质，其中以α-鹅膏毒肽的毒性最强（α-amanitin）。人若误食含有α-鹅膏毒肽的鹅膏菌(Amanita)后，轻者可产生腹泻、腹痛、呕吐，重者可出现幻觉、昏迷等多种症状，致死率较高。α-鹅膏毒肽是从鹅膏菌中分离出来的一种八肽化合物，它是RNA聚合酶II 的专一性抑制剂，能抑制真核细胞RNA 聚合酶II 的活性，从而阻碍mRNA 转录和蛋白质的合成，这也是引起鹅膏毒素中毒，导致死亡的主要因素。因此，利用SELEX技术筛选α-鹅膏毒肽的特异性核酸适配体，进而及时、快速检测出食用野生菌中是否含有鹅膏毒素，对于降低误食蘑菇中毒及诊断治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；该核酸适配体为单链DNA，由84个核苷酸组成，拓扑学结构为直链状；预测的二级结构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-14.901。
本发明另一目的是将与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体应用在识别α-鹅膏毒肽或在制备检测α-鹅膏毒肽的试剂盒中。
本发明的技术方案如下：
1、α-鹅膏毒肽特异性核酸适配体（E06）的筛选、克隆、分离和测序
采用SELEX技术筛选出能够与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体群体，设计引物进行PCR扩增、克隆、分离和测序。利用酶联寡核苷酸吸附试验（ELONA）进行验证，得到适配体E06，它能够高亲和力高特异性的结合α-鹅膏毒肽。配体接头引物序列为：Aptamer Fw: GACATATTCAGTCTGACAGC；反向互补序列：CGCTGTCAGACTGAATATGTC；Aptamer Rv: GCTAGACGATATTCGTCCATC，反向互补序列：GATGGACGAATATCGTCTAGC。所获阳性单克隆进行核苷酸序列测定，测序结果表明与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体(E06)由84个核苷酸组成，其序列（5’端至3’端）为：
tgacatattc agtctgacag cgtactgtcg actattgggc ggtatgggga caacattgcg ttgatggacg aatatcgtct agca ；
2、核酸适配体（E06）单链DNA二级结构表征
使用MFOLD软件（http://mfold.rna.albany.edu/q=mfold/DNA-Folding-Form）对与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体E06单链DNA分子进行二级结构预测，结果表明，其二级结构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-14.901，显示该结构具有较高的稳定性；其二级结构如下：
。
核酸适配体（E06）的特异性和对α-鹅膏毒肽的敏感性
根据核酸适配体E06的序列，用体外转录方法合成生物素标记的核酸适配体，建立了一种新型的酶联寡核苷酸检测方法，通过此方法对E06的特异性和其对α-鹅膏毒肽的敏感性进行检测；结果显示，E06具有很高的特异性，其能检测到蘑菇毒素α-鹅膏毒肽的最低浓度为20 μg/mL。
本发明的意义在于:
利用SELEX技术筛选出的配体E06能够高亲和力高特异性的识别并结合α-鹅膏毒肽；核酸适配体E06的鉴别对于食用野生菌中α-鹅膏毒肽的检测，进而降低α-鹅膏毒肽对人体的侵害具有重要意义。
附图说明
图1为本发明中核酸适配体E06的特异性分析，图中：空白对照为α-鹅膏毒肽+脱脂奶；阴性对照：α-鹅膏毒肽+不含配体的生物素；非靶标蛋白：生长抑素八肽+标记有生物素的配体E06；α-鹅膏毒肽40 μg/mL：α-鹅膏毒肽+标记有生物素的配体E06；
图2为本发明中核酸适配体E06的灵敏度分析，图中：空白对照：α-鹅膏毒肽+脱脂奶；阴性对照：α-鹅膏毒肽+不含配体的生物素；配体 E06：α-鹅膏毒肽+标记有生物素的配体E06。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来进一步说明本发明的实质性内容，实施例仅为了更好理解本发明但不局限与本发明范围，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：α-鹅膏毒肽核酸适配体（E06）的筛选
一、 配基（α-鹅膏毒肽）与基质（琼脂糖凝胶6B）的偶联
1、在3 mL蒸馏水中悬浮1 g的冻干粉末琼脂糖凝胶6B（1 g冻干的粉末能够产生出大约3.0 mL的最终的基质体积）；
2、立即在烧结玻璃滤器中（多空度G3）用大约每克粉末200 mL的蒸馏水冲洗1小时；
3、用6 mL的偶联缓冲溶液（0.05 M，pH 9.6的碳酸盐缓冲液）溶解6 g的配基，使其最终浓度为1 mg/mL，或者用脱盐柱将溶解的配基转移到偶联缓冲溶液中，调整水相的pH值；
4、将基质与上述步骤3中的浓度为1 mg/mL溶解好配基的缓冲溶液的比例调整为体积比1:2，在25℃到40℃的水浴条件下，混合16 h，并且37℃摇床过夜；
5、在40℃到50℃的条件下，用1M的氨基乙醇封闭过剩的基团，至少4 h或者过夜；
6、用偶联缓冲液洗过剩的配基，4000 rpm离心2 min，吸取上清；用超纯水（每次7-8 mL）清洗3次；紧接着用0.1 M NaHCO3，0.5 M NaCl，pH 8.0的溶液清洗3-4次；然后用0.1 M NaCl，0.1 M醋酸盐，pH 4.0的溶液清洗3-4次；最后用质量百分比浓度为20%乙醇6 mL保存，放置于4℃冰箱，封口膜封口，竖直放置。
二、核酸适配体文库（ssDNA）的PCR
采用TaKaRa公司合成的ssDNA适配体文库；
1、94℃预热PCR仪；
2、将3 μL ssDNA、30.6 μL 去离子水、5 μL 10×Buffer、3 μL MgCl2、4 μL dNTP混合物（各2.5μM）、2μL 正向扩增引物、2μL 反向扩增引物以及0.4 μL Taq酶离心管进行反应。正向扩增引物序列为5’–GACATATTCAGTCTGACAGC-3’，反向扩增引物序列为5’-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3’。
3、在PCR仪中按以下程序扩增
(1) 预变性
94℃ 5分钟；
(2) 40个循环
94℃ 45 秒钟
58℃ 45秒钟
72℃ 30秒钟；
(3) 后扩增
72℃ 7分钟。
三、配体库的纯化、上样及洗脱
1、配体库的纯化
(1)核酸适配体文库PCR产物直接与胶回收试剂盒里的溶液按体积比1:1比例混合，进行DNA片段回收；
(2)DNA片段回收后，95℃水浴10min，冰浴10min；经过此变性处理，使双链DNA变成单链DNA。
2、亲和层析
(1)用偶联缓冲液洗脱偶联过的基质：先吸取上层酒精，加偶联缓冲液至6 mL，混匀，离心，弃去上清液，此步骤重复3次；
(2)将上述第1步中的单链DNA加入到偶联过的基质中，于37℃温育并40 rpm轻柔转动2 h；
(3)加入前述样品到层析柱中，用2-3柱体积的超纯水冲洗柱子；
(4)然后用3-4柱体积的洗脱缓冲液（0.1 M NaCl，0.1 M醋酸盐，pH 4.0）进行线性梯度洗脱，收集洗脱组分；
(5)洗脱组分与胶溶液等体积混合，回收后用TE溶液溶解，得到selex溶液。
四、PCR优化和大量扩增核酸适配体
以上述selex溶液作为模板，按如下步骤操作：
1、94℃预热PCR仪；
2、将5 μL 模板、28.6 μL 去离子水、5 μL 10×Buffer、3 μL MgCl2、4 μL dNTP混合物（各2.5uM）、2 μL 正向扩增引物、2 μL 反向扩增引物、0.4 μL Taq酶，于PCR离心管中进行反应。正向扩增引物序列为5’–GACATATTCAGTCTGACAGC-3’，反向扩增引物序列为5’-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3’。
3、在PCR仪中按以下程序扩增：
(1) 预变性
94℃ 5分钟；
(2) 37个循环：
94℃ 45 秒钟
58℃ 45秒钟
72℃ 30秒钟；
(3) 后扩增
72℃ 7分钟；
4、循环结束后，将PCR 产物用TIANGEN 公司的DNA产物纯化试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
(1) 将PCR产物与等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合，12000 rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液；
(2) 加入700 μL的漂洗液（含乙醇）于离心纯化柱中，12000 rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液；
(3) 重复步骤（2）；
(4) 12000 rpm 离心3分钟；
(5) 将离心纯化柱置于新的离心管中；
(6) 加入30 μL超纯水，在室温下静置5分钟；
(7) 12000 rpm离心1分钟，管底溶液即为纯化过的核酸适配体的PCR产物。
实施例2：核酸适配体的克隆和测序以及单链DNA二级结构的预测
一、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
1、挑取单个DH5α菌落，接种于3 mL不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50 mL 液体LB培养基中，37℃振荡2小时；当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物；
2、将细菌培养物转移到一个50 mL预冷的无菌聚丙烯管中，冰上放置10 min，使培养物冷却；
3、于4℃下4000 rpm离心10 min，弃去培养液，并将管倒置l min以使残留的培养液流尽；
4、各加150 μL冰预冷的0.1 mM CaCl2溶液，合并两管，冰浴10 min；
5、于4℃下4000 rpm离心10 min，弃去上清液，并将管倒置l min以使残留的液体流尽；
6、先加入800 μL冰预冷的0.1 M CaCl2溶液重悬细胞，再加入25 μL预冷的75%的甘油，之后于-80℃贮存备用。
二、连接及连接产物的转化
1、在微量离心管中加入0.5 μL Takara pMD19-T simple载体、4.5 μL核酸适配体PCR产物及5 μL的连接酶缓冲混合物；
2、16℃反应3 小时；
3、全量（10 μL）加入至100 μL DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟；
4、42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟；
5、加入37℃温浴过的LB培养基890 μL，37℃缓慢振荡培养60分钟；
6、取200 μL涂布于含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养16小时以形成单菌落。
三、核酸适配体的克隆筛选和测序以及单链DNA二级结构预测
挑取上述白色的单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃缓慢振荡培养4小时，进行PCR扩增；扩增引物及扩增条件同前述核酸适配体的扩增条件。将经PCR确证的阳性克隆进行质粒提取后，以美国Applied Biosystems 3730A全自动核苷酸序列测定仪进行核苷酸序列的测定；结构表明，与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体（命名为E06）其序列自5’端至3’端为:
tgacatattc agtctgacag cgtactgtcg actattgggc ggtatgggga caacattgcg ttgatggacg aatatcgtct agca
与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体E06的序列长度：84个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：ssDNA。
通过MFOLD软件设置温度为26℃、Na+浓度为150 mM，Mg2+浓度为1 mM （http://mfold.rna.albany.edu/q=mfold/DNA-Folding-Form）和QGRS映射（http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/analyze.php）对与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体E06单链DNA分子进行二级结构预测。结果表明，适配体含有突出的环和茎，存在G-四链体结构，其吉布斯自由能DG=-14.901，该结构具有较高的稳定性。
实施例3：核酸适配体（E06）的特异性和对α-鹅膏毒肽的敏感性
一、 核酸适配体E06特异性检测
1、ELONA方法
在传统的ELISA方法的基础上加以改进，用筛选出来的适配体来代替抗体，采用生物素-亲和素放大系统用以检测待测样品的一种方法。
(1)适配体-生物素的包被
筛选出来的特异性识别α-鹅膏毒肽的核酸适配体送到TaKaRa公司合成，得到用生物素标记的适配体。使用时先短暂离心，使生物素标记的适配体聚集在试管底部。根据说明书，用灭菌水或TE buffer(pH7.5-8.0)充分溶解成存储溶液，一般浓度为10-4或10-5M，置于-20℃保存。为避免反复冻融，可分装成小份。将生物素标记的适配体用1×PBS稀释到工作浓度，每个孔加100 μL，用不干胶或封口膜密封，于37℃、150 rpm振荡器上孵育1-2 h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 min，每次都要在干净的吸水纸上拍干。
(2)加α-鹅膏毒肽孵育
按核酸适配体结合缓冲液与α-鹅膏毒肽体积比1:1的比例加入到包被有生物素标记的适配体的酶标板中，每个孔加100 μL，用不干胶密封，于37℃、150 rpm振荡器上孵育1-2 h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 min，同样的每次都要在于净的吸水纸上拍干。（对照组则将α-鹅膏毒肽换成生长抑素八肽，方法同上）。
(3)加酶结合物孵育
往每孔中加入100 μL辣根过氧化物酶结合物，用不干胶密封，于37℃、150 rpm振荡器上孵育1 h，洗涤3次，每次2 min。
(4)显色
每孔加入TMB100 μL，于37℃避光显色l0 min，拍照保存。
(5)终止
加25 μL终止液（2 M硫酸），并在反应终止10 min以内用酶标仪测各孔450 nm处吸光度值OD450。
结果显示，适配体E06能够与α-鹅膏毒肽特异性的结合（结果见图1）。
二、核酸适配体E06对α-鹅膏毒肽的灵敏度的检测
1、将生物素标记的适配体用1×PBS稀释到工作浓度，每个孔加100 μL，用不干胶或封口膜密封，于37℃、150 rpm振荡器上孵育1-2 h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 min，每次都要在干净的吸水纸上拍干；
2、按适配体结合缓冲液与不同浓度的α-鹅膏毒肽溶液体积比1:1比例加入到包被有生物素标记的适配体的酶标板中，每个孔加100 μL，用不干胶密封，于37℃、150 rpm振荡器上孵育1-2 h，孵育完后弃去孔内液体，每孔加洗涤液200 μL，于水平摇床上振荡洗涤3次，每次2 min，同样的每次都要在于净的吸水纸上拍干；
3、往每孔中加入100 μL辣根过氧化物酶结合物，用不干胶密封，于37℃、150 rpm振荡器上孵育1 h，洗涤3次，每次2 min；
4、每孔加入TMB100 μL，于37℃避光显色l0 min；
5、加25 μL终止液（2 M硫酸），并在反应终止10 min以内用酶标仪测各孔450 nm处吸光度值OD450；
6、结果表明，适配体E06能检测到蘑菇毒素α-鹅膏毒肽的最低浓度为20 μg/mL（结果见图2）。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种与α-鹅膏毒肽特异结合的核酸适配体及应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgacatattc agtctgacag cgtactgtcg actattgggc ggtatgggga caacattgcg 60
ttgatggacg aatatcgtct agca 84
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gacatattca gtctgacagc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctagacgat attcgtccat c 21