技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术(Lateral Flow Assay)检测牛传染 性鼻气管炎病毒所用的引物和探针组合及其试剂盒。
背景技术
牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引起的牛传染性鼻 气管炎，是牛的一种急性、热性、接触性传染病，临床上呈多种表现类型，特别是该病能引 起免疫抑制，继发性的细菌感染能导致更严重的呼吸道疾病。目前此病在世界范围内广泛流 行，且该病严重影响着国际牛业生产贸易，已被世界动物卫生组织(OIE)列为B类传播性 疾病。我国于20世纪70年代末从新西兰进口的奶牛中检测到IBRV，由于没有很好的免疫防 护措施，随后我国多数省份的牛群中均有此病毒感染，对牛群的肥育、产奶和繁殖影响极大， 给牛场造成巨大的经济损失。目前对该病的诊断方法主要有病原分离、PCR方法、ELISA试 验和血清中和试验等，由于这些方法需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，难以满足非实验 室环境下现场检测的要求。因而亟需建立一套快速、准确、简便的诊断方法，为临床现场检 测及疫情监测等提供新一代的检测技术与手段。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，是一种不同于PCR的 核酸检测技术，主要有结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶三种 酶参与。其原理是利用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同 源序列。在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对形成复 制所需的3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，形成新的DNA互补链，对模 板上的目标区域进行指数式扩增。引物序列的设计与选择对RPA的结果至关重要。在RPA扩 增体系中加入一个生物素标记的反向引物和5’荧光标记的探针，探针标记的荧光基团30个碱 基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点是DNA修复酶作用的底物，可被核酶nfo识别切割， 产生新的3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，从而使双标信号与扩增产物 的累积同步，检测结果可在抗FAM金标结合和抗生物素捕获抗体的侧流层析试纸条上显示。
目前对于RPA技术的研究尚处于起步阶段，国内外还没有将RPA技术应用于IBRV检测的 报道。本发明系首次采用RPA技术建立快速检测IBRV的方法，并通过特异性和灵敏度评价， 可用于临床现场检测，为IBRV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。
发明内容
针对RPA技术应用于IBRV检测领域的空白，本发明提供了一种准确、快速、简便检测 IBRV的RPA检测方法。仅需通过对临床样品进行病毒DNA粗提取并进行RPA等温扩增，结 果可在侧流层析试纸条上清晰显示，不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩增，具有灵 敏度高、特异性强、反应程序简单、检测时间短等优点，适用于非实验室环境下临床现场检 测，具有广泛的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种用于通过RPA技术检测IBRV的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所 示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。
正向引物：5’-TTCCGACCAGCGCCGAATCTTGGATGCAGTACT-3’；(SEQ ID No.1)
反向引物：5’-GGCCAAAACCGCTTTCAGAAGCAGAGCAAGGTGA-3’(5’-端用Biotin 标记)；(SEQ ID No.2)
探针序列：5’-CCGCAAAGTGCCGAGGGATGTCCTTGTAGT【dSpacer】CAGGTCCA CCTTCCGCT-3’(探针5’-端用FAM标记，距离5’-端30个碱基左右的位置处用dSpacer 替代一个碱基，3’端用C3-spacer阻断)。
需要说明的是：与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针 序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加 也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技 术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计 原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优 化、筛选才能得到。
本发明还提供了一种检测IBRV的试剂盒，该试剂盒中包含有用于通过RPA技术检测 IBRV的引物和探针组合。
进一步的，该试剂盒中还包括有：IBRV阳性对照模板、RPA扩增试剂、去离子水和侧 流层析检测试剂。IBRV阳性对照模板、RPA扩增试剂、去离子水与引物和探针组合一起构 成扩增体系。
所述RPA扩增试剂包括Rehydration缓冲液、大肠杆菌来源的recA重组酶、链置换 DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白(SSB)、280mM醋酸镁(MgAc)溶液。
所述RPA侧流层析检测试剂包括侧流层析试纸条，杂交检测缓冲液(1×PBS+0.1％ Tween20)。
所述IBRV阳性对照模板的制备方法为：分别在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物 对的上游和下游设计引物：
上游引物:5’-GCCAAGCGCAGCAGGCAGGTGAAT-3’(SEQ ID No.4)；
下游引物:5’-CGACTGGGCGTACATCTCGGAGAA-3’(SEQ ID No.5)；
以IBRV的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL：10×LA PCR Buffer II(Mg2+ Plus)5μL、2.5mM dNTP Mixture 8μL、LA Taq 0.5μL(5U/μL)、模板2μL，10μmol/L的上 下游引物各2μL，灭菌超纯水加至50μL。反应程序为94℃预变性3min，然后进入94℃30s， 55℃30s，72℃40s，共进行31个循环；72℃延伸10min，最后停止于4℃。PCR产物经1％ 琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载体，(为常规的载体，商业化购买到) 蓝白斑筛选重组质粒，送华大基因进行测序，将测序结果进行比对，正确的重组质粒为IBRV 阳性对照模板。
具体的，一种检测IBRV的试剂盒，每50μL扩增体系中含有正向引物、反向引物各2.1 μL(10μmol/L)，探针0.6μL(10μmol/L)，IBRV阳性对照模板2μL，Rehydration缓冲液29. 5μL，去离子水11.2μL和醋酸镁溶液(280mM)2.5μL。
本发明还提供一种应用RPA技术并结合侧流层析技术检测IBRV的方法，步骤如下：
(1)应用快速提取病毒基因组DNA试剂盒提取细胞培养病毒上清液的IBRV DNA；
(2)根据IBRV保守区域设计RPA特异性引物和探针，向RPA扩增试剂盒推荐反应的 50μL扩增体系中加入正向引物、反向引物各2.1μL(10μmol/L)，探针0.6μL(10μmol/L)，模 板DNA 2μL，29.5μLRehydration缓冲液，11.2μL去离子水和2.5μL醋酸镁溶液(280mM)， 于含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp nfo反应管中，恒温水浴锅内38℃反应25分钟；
(3)取1μL扩增产物，应用侧流层析试纸条进行检测，若侧流层析试纸条上显现出检测 带和对照带，则检测结果为阳性，若试纸条仅显示对照带，则结果为阴性。
应用上述方法可以筛选出一套可快速有效检测出IBRV成分的引物及探针组合。
以已知病毒滴度为8.0×107TCID50/mL的IBRV用去离子水进行10倍系列稀释后，提取 DNA后进行同步检测，结果显示可以检测到0.8TCID50的靶标分子，证明该方法具有较高的 灵敏度。
以8.0×103TCID50IBRV样品的DNA作为模板，利用上述优化的引物和探针进行RPA等 温扩增，扩增产物在侧流层析试纸条上显现出检测带和对照带，而以其它病毒的cDNA为模 板扩增均仅显示对照带，证明该方法具有较好的特异性。
以提取的0.8TCID50IBRV样品的DNA作为模板，按照上述所述的引物和探针进行RPA 等温扩增，对该模板进行3次重复，扩增产物分别在侧流层析试纸条进行检测。结果证实相 同量模板的扩增产物在侧流层析试纸条反应区显现出亮度相同的检测带和对照带，具有较好 的重复性。
本发明的有益效果：
(1)采用本发明的引物和探针组合，通过RPA技术对IBRV进行检测的方法，具有较高 的灵敏度、特异性和重复性。
(2)本发明的RPA技术并结合侧流层析技术检测IBRV的方法，既可用于临床血液、 奶样、组织等临床常规样本的检测，也可对病毒气溶胶等微量样本进行检测。本发明只需对 临床样本进行病毒基因组粗提取，且恒温扩增过程，扩增阶段不需要特殊的仪器，结果可通 过视觉直观检测，不需要检测仪，且反应速度快，敏感性高，可在非实验室环境下短时间内 即可完成IBRV的临床现场检测。
附图说明
图1IBRV诊断方法的建立，其中，1：RPA试剂盒提供引物、探针及模板阳性对照；2： IBRV阴性对照，模板为H2O；3：IBRV基因组DNA。
图2灵敏度检测，从1到10模板依次为病毒滴度为8.0×107-8.0×10-2TCID50IBRV样品的 DNA。
图3IBRV的特异性检测，其中，1：牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)；2：牛呼吸道合胞 体病毒(BRSV)；3：牛病毒性腹泻病毒(BVDV)；4：牛副流感3型病毒(BPIV-3)；5：牛 肠道病毒(BEV)；6：牛冠状病毒(BcoV)；7：牛轮状病毒(BRV)；8：牛流行热病毒(BEFV)。
图4IBRV的重复性检测，模板为0.8TCID50IBRV样品的DNA。
图5临床样本检测，其中，1：阳性对照；2：阴性对照；3-16：IBRV阳性样本；17-22： IBRV阴性样本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发 明，并不对其内容进行限定。
下面实施例中所用一些材料和试剂如下：分子生物学试剂，TwistAmp nfo Kits购自 TwistDX公司；Genline Hybridetect-1lateral flow strips购自Milenia GmbH(Germany)；LA Taq DNA Polymerase，病毒DNA/RNA提取试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit(目录号：K1622)购自Fermentas公司；pEASY-T3 Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司；其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物和探 针由上海生工生物技术有限公司合成。
仪器包括：恒温水浴锅、离心机、涡旋仪、分光光度计和纯水仪等。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的《分子 克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述条件， 或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。
实施例1：引物和探针的设计与筛选
引物和探针的有效设计是决定实验成功的最关键环节。然而，RPA技术正处于起步研究 阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。目 前实验中需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化，筛选，该技术引物设计要求极其严格， 个别碱基的替换或增减都会对实验结果产生重要影响。设计时通常需要考虑以下几个因素： (1)引物长度要求为30-35bp，探针长度要求为46-52bp，GC含量在40％-60％，避免引物内 部出现二级结构且避免引物出现重复序列。(2)检测扩增片段小于500bp。(3)避免引物和 探针之间形成二聚体，影响结果的准确性。
本实验中依据GenBank中发表的IBRV(登录号AJ004801.1)的保守序列设计了4条探 针，在每条探针的两侧分别设计了3条上游引物和3条下游引物。以病毒DNA快速提取试 剂盒提取细胞培养病毒的基因组DNA为模板，对设计的不同引物、探针组合进行RPA扩增 筛选，同时以去离子水为模板对设计的引物、探针扩增作阴性对照，以RPA扩增试剂盒提供 的模板、引物和探针组合做阳性对照，最终选出一对扩增产物能在侧流层析试纸条中显示清 晰的检测条带和对照条带(见图1)，筛选出的引物和探针序列见SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2 和SEQ ID NO.3(见表1)。
表1筛选得到的引物和探针序列
注：探针5’-端用FAM标记，距离5’端30个碱基左右的位置处用dSpacer替代一个碱 基，3’端用C3-spacer阻断。
Biotin：生物素；FAM：发光基团；dSpacer：脱碱基位点；C3-spacer：聚合酶延伸阻断 基团。
实施例2：实验室IBRV RPA扩增检测方法的建立与考察
1.实验室IBRV RPA扩增检测方法的建立
1.1 IBRV基因组DNA的提取
取200μL细胞培养病毒上清液，应用快速提取病毒基因组DNA试剂盒提取IBRV DNA， 最后溶解在50μL去离子水中。
1.2 RPA扩增
本实施例中应用PRA方法扩增IBRV特异序列，具体步骤为：
(1)向离心管中加入实施例1设计的上下游引物各2.1μL(10μmol/L)，LF探针0.6μL (10μmol/L)，Rehydration缓冲液29.5μL，模板DNA 2μL，用ddH2O补足到体积47.5μL(表 2)，漩涡混匀后短暂离心；
表2RPA扩增体系
(2)将47.5μL上述混合液转移到含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp nfo反应管中，用移 液器反复吹打直到整个颗粒溶解；
(3)向每个反应管中加入2.5μL(280mmol/L)的醋酸镁溶液，用力上下颠倒漩涡混匀 8-10次，反应立即发生；
(4)将反应管放入38℃的恒温水浴锅中，处理4min；
(5)反应4min后，取出反应管，用力上下颠倒漩涡混匀8-10次，短暂离心后放入38℃ 的恒温水浴锅中继续反应21min，得RPA反应产物。
1.3侧流层析试纸条进行扩增产物检测
取一定数量的侧流层析试纸条(dipstick，Milennia GenLine HybriDetect MGHD1)，针对 不同检测样本号进行标记。每一个检测样本取99μL杂交检测缓冲液(HybriDetect Assay Buffer)，加入反应管中。取1μL杂交反应产物(RPA反应产物)在离心管中混匀，杂交反应 液和杂交检测缓冲液共100μL。将试纸条的样品反应区加入反应液，孵育5分钟，孵育结束 后，从反应液中取出试纸条，立即观察。如果试纸条反应区显示两条可见条带，则检测样本 为阳性；如果试纸条反应区对照线显示清晰，检测线未见条带，则检测样本为阴性。
2.IBRV RPA扩增检测方法的考察
2.1 IBRV RPA扩增检测方法的敏感性考察
将已知病毒滴度为8.0×107TCID50/mL的IBRV病毒液用去离子水进行10倍系列稀释后， 应用病毒基因组DNA快速提取试剂盒提取病毒的DNA，分别吸取2μL IBRV DNA为模板， 按“1.2引物扩增”操作方法进行扩增，取1μL杂交反应产物(RPA反应产物)在侧流层析 试纸条上显示，结果表明，可以检测到0.8TCID50的靶标分子(图2)，说明用本发明设计的 引物检测IBRV具有较高的灵敏度和准确性，且操作简便。
2.2 IBRV RPA扩增检测方法的特异性考察
取200μL牛病毒性腹泻病毒(BVDV)滴度为2.0×106.0TCID50/mL、牛副流感3型病毒 (BPIV-3)滴度为6.23×105.6TCID50/mL、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)滴度为 8.9×106.8TCID50/mL、牛肠道病毒(BEV)滴度为4.1×107.8TCID50/mL、牛冠状病毒(BcoV) 滴度为5.8×106.5TCID50/mL、牛轮状病毒(BRV)滴度为2.3×107.0TCID50/mL和牛流行热病毒 (BEFV)滴度为3.2×105.5TCID50/mL的细胞培养毒，参照病毒RNA提取试剂盒说明书，提 取RNA，溶解在50μL RNAase-free水中。按照Fermentas RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行RT-PCR反应，获得上述病毒的cDNA模板。
以8.0×103TCID50IBRV样品的DNA作为阳性对照模板，利用实施例1优化筛选的引物 和探针对BVDV、BPIV-3、BRSV、BEV、BcoV、BRV和BEFV的cDNA进行RPA等温扩 增，扩增产物在侧流层析试纸条进行检测。IBRV扩增产物在侧流层析试纸条反应区显现出检 测带和对照带，而以其它病毒检测样本试纸条反应区仅对照线显示清晰，检测线未见条带， 均为阴性(图3)。说明本发明的IBRV RPA扩增检测方法具有较好的特异性。
2.3 IBRV RPA扩增检测方法的重复性考察
以提取的0.8TCID50IBRV样品的DNA作为模板，按照上述所述的引物和探针进行RPA 等温扩增，对该模板进行3次重复，扩增产物分别在侧流层析试纸条进行检测。结果证实相 同量模板的扩增产物在侧流层析试纸条反应区显现出亮度相同的检测带和对照带，具有较好 的重复性(图4)。
实施例3：临床样本IBRV检测
1.IBRV基因组DNA的粗提取
分别取本实验室已建立的BVDV荧光定量RT-PCR鉴定为IBRV阳性和阴性牛的鼻拭子 共计20份，加入50μLTES(10mmolTris-HCl，pH8.0，5mmol/LEDTA，0.5％SDS)和150μg/mL 蛋白酶K，65℃，作用15min，取上清，用于RPA模板扩增。
2.临床样本侧流层析RPA检测
以制备的临床样本的基因组DNA分别作为模板，按照实施例2中步骤1中所述的RPA 检测方法进行扩增。经RPA扩增，杂交产物在侧流层析试纸条显示，14份样本试纸条反应区 显示对照条带和检测条带，表明14份临床样本中含有IBRV，结果与本实验其它方法检测的 符合率为100％，结果如图5所示。
实施例4：用于IBRV检测的试剂盒
1.IBRV阳性对照模板制备
分别在实施例1筛选获得的引物对的上游和下游设计引物(SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)，以实施例2步骤1得到的IBRV的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL： 10×LA PCR Buffer II(Mg2+Plus)5μL、2.5mM dNTP Mixture 8μL、LA Taq 0.5μL(5U/μL)、 模板2μL，10μmol/L的上下游引物各2μL，灭菌超纯水加至50μL。反应程序为94℃预变性 3min，然后进入94℃30s，55℃30s，72℃40s，共进行31个循环；72℃延伸10min，最 后停止于4℃。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载体，蓝 白斑筛选重组质粒，送华大基因进行测序，将测序结果进行比对，正确的重组质粒为IBRV 阳性对照模板。
2.试剂盒的组成：实施例1筛选的引物和探针组合，IBRV阳性对照模板，RPA扩增Re hydration缓冲液，冻干酶颗粒，醋酸镁(280mM)、去离子水和侧流层析试纸条。
3.扩增体系：扩增体系为50μL，向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp Exo反应管中加入 正向引物、反向引物各2.1μL(10μmol/L)，探针0.6μL(10μmol/L)，IBRV阳性对照模板2μ L，29.5μLRehydration缓冲液，11.2μL去离子水和2.5μL醋酸镁溶液(280mM)。
4.检测步骤：
4.1病毒DNA的提取
按照实施例3中步骤1的方法提取临床处理样本的IBRV DNA。
4.2 RPA扩增
按照实施例2中“1.2 IBRV RPA扩增”的方法进行RPA扩增，38℃恒温水浴锅内共反 应25min。
4.3侧流层析试纸条进行检测
取1μL扩增产物，应用实施例2中“1.3侧流层析试纸条进行扩增产物检测”的方法进 行检测，若侧流层析试纸条上显现出检测带和对照带，则检测结果为阳性，若试纸条仅显示 对照带，则结果为阴性。