技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别气溶胶中布鲁氏菌S2疫苗株的引物、探 针以及试剂盒。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌属细菌(牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌等) 引起的人畜共患传染病，也是我国法定检疫和净化的重要病原。近年来发病率呈现逐年上 升趋势，尤其是对奶畜危害极大，流产率高达50％-80％，乳、肉产量减少10％-20％。据《兽 医公报》统计，2013年全国共发生布鲁氏菌病3620次，42720头牛羊发病。因此，布鲁氏 菌病给社会经济发展与稳定、国家公共卫生安全等构成严重威胁。
布鲁氏菌病的传染源主要是患病动物及带菌者，它们通过分泌物、乳汁和体液等将布 鲁氏菌排出体外，污染环境，同时布鲁氏菌粘附在空气中的灰尘悬浮粒子上，形成气溶胶 进而传播，感染其他动物和人。养殖场环境中的布鲁氏菌气溶胶的分布可造成布病的传染 与流行，给畜牧业生产和人类健康带来严重危害，尤其是当前集约化、高密度养殖环境下 更容易形成布鲁氏菌气溶胶性的流行。因此，通过监测养殖场环境中布鲁氏菌气溶胶，可 以有效地预警预报布病的暴发与流行。
我国动物布病防控的主要策略是检疫与净化。目前我国牛、羊免疫常用的猪种布鲁氏 菌S2弱毒疫苗株在抗原与抗体的诊断上会对布病病毒感染造成干扰。这是因为我国目前使 用的布鲁氏菌病诊断方法不能对自然感染和人工疫苗免疫进行鉴别诊断，必然导致一些自 然感染的病畜逃避检疫，使患病动物长期存在，对牛羊和人类的安全长期构成威胁，因此， 我国很难实行布病的检疫、扑杀、净化的防控规程。
以布鲁氏菌S2疫苗株与其他布鲁氏菌基因组差异DNA序列为鉴别靶序列，应用 RPA-LFD技术，可以实现布鲁氏菌S2疫苗株与其他布鲁氏菌毒株现场快速鉴别诊断。RPA 技术通过三种酶的混合物，即能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合 蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，在常温下也有活性，最佳反应温度在38℃左右，整个 过程一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。RPA检测的灵敏度很高，能够将痕 量级(trace levels)的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子 得到大约1012扩增产物，更适合低浓度的临床检测模板。而且RPA还用不着复杂的样品处 理，适用于无法提取核酸的实地检测。目前，RPA反应可以通过琼脂糖凝胶电泳，荧光扩 增曲线和LFD试纸条三种不同方式检测结果，这三种方式的引物与探针的反应原理是 不同的。凝胶电泳和荧光扩增曲线法仍然依赖实验室和特殊仪器设备，而LFD是一种 无需特殊仪器可用于现场的方法。
RPA-nfo反应的引物与探针的设计目前没有具体的规则，只能经过RPA反应后应用侧 流层析试纸条(LFD)检测，才能筛选获得可用于临床检测的引物与探针组合。在RPA-nfo 正反向引物的扩增靶序列中设计一条带FAM标记的特异探针，同时反向引物用生物素标记， 生物素标记的RPA产物与FAM标记的特异探针杂交、FAM标记的特异探针与抗FAM抗 体的金标物结合后，将该免疫复合物滴加到试纸条上，免疫复合物通过层析膜扩散，扩散 到检测线时，生物素标记的扩增产物被生物素配体捕获，形成具有颜色的检测线，即检测 条带。不被捕获的免疫复合物继续扩散到质控线被特异性抗体所捕获，形成具有颜色的质 控线，即对照条带。这样RPA技术与侧流层析技术结合，即RPA-LFD技术，可以通过侧 流层析试纸条(LFD)读取结果，本方法既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理， 仅仅使用普通的加热装置如水浴锅和侧流层析试纸条就可以通过肉眼观察结果。因此， RPA-LFD技术在布鲁氏菌气溶胶等临床样本的现场诊断以及疫苗株S2的鉴别方面具有广 阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速鉴别气溶胶样本中布鲁氏菌S2疫苗株的引物、探针以及 试剂盒。
为实现以上目的，本发明的技术方案为：
一种鉴别气溶胶中布鲁氏菌S2疫苗株的引物和探针，其中，Brucella-RPA-LFD正向引 物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所 示；S2-RPA-LFD正向引物序列如SEQIDNo.4所示，反向引物序列如SEQIDNo.5所示，探 针序列如SEQIDNo.6所示。
一种鉴别气溶胶中布鲁氏菌S2疫苗株的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物和探针。
优选的，所述试剂盒还包括大肠杆菌来源的recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链 DNA结合蛋白(SSB)、rehydration缓冲液、280mM醋酸镁(MgAc)溶液、侧流层析试 纸条(特异性检测生物素与FAM标记基因扩增产物)、PBST试纸条检测缓冲液(1×PBS+0.1％ 吐温20)、灭菌去离子双蒸水(ddH2O)，TE缓冲液、10％(w/v)SDS、2％(w/v)蛋白酶K 和布鲁氏菌S2疫苗株标准阳性模板。
一种鉴别气溶胶中布鲁氏菌S2疫苗株的方法，包括如下步骤：
(1)提取检测样本中的DNA；
(2)以步骤(1)中得到的DNA为模板，进行RPA扩增；
(3)检测RPA扩增的产物，判定样本中是否含有布鲁氏菌S2疫苗株。
优选的，步骤(1)中，提取检测样本中的DNA是通过对检测样本进行裂解处理得到 的。
优选的，步骤(2)中，所述RPA扩增体系的体积为50μL，包括10μM的上游引物2.1μL、 10μM的下游引物2.1μL、10μM的探针0.6μL、rehydration缓冲液29.5μL、待测样本DNA 或粗裂解产物和ddH2O 13.2μL以及280mM醋酸镁溶液2.5μL。
进一步优选的，步骤(2)中，所述醋酸镁溶液是在其他各个组分在TwistAmp nfo反应 管中混合均匀以后加入的。
优选的，步骤(2)中，RPA扩增的温度为38℃，扩增时间为20min。
优选的，步骤(3)中，RPA扩增产物的检测方法为：
将2μL RPA扩增产物与98μL LFD试纸用的缓冲液的混合溶液，浸泡LFD试纸5min 后，观察结果。
进一步优选的，步骤(3)中，样本中是否含有布鲁氏菌S2疫苗株的判定方法为：
若Brucella-RPA-LFD与S2-RPA-LFD两个检测组合同时出现检测条带和对照条带，则 该样本中布鲁氏菌S2疫苗株感染阳性；
Brucella-RPA-LFD检测组出现检测条带和对照条带，而S2-RPA-LFD检测组仅出现对 照条带，则说明该样本中含有布鲁氏菌S2疫苗株以外的其他布鲁氏菌；
Brucella-RPA-LFD与S2-RPA-LFD两个检测组均未出现检测条带而出现对照条带，则 说明检测样本中不含有布鲁氏菌属细菌；
出现其他情况则说明RPA-LFD布鲁氏菌S2鉴别检测不成立。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供的布鲁氏菌属细菌与S2疫苗株鉴别诊断的RPA-LFD引物与探针组合 或试剂盒灵敏性高、特异性强，最低均可以检测到2.5×100cfu的布鲁氏菌属细菌或布鲁氏 菌S2疫苗株细菌。
(2)Brucella-RPA-LFD检测组与大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌O:9、沙门 氏菌以及金黄色葡萄球菌等均无交叉反应；S2-RPA-LFD检测组与其他布鲁氏菌株以及大肠 杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌O:9、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌等均无交叉反应。
(3)本发明提供的布鲁氏菌S2疫苗株鉴别诊断RPA-LFD引物与探针组合或试剂盒不 仅仅可用于布鲁氏菌S2疫苗株菌株与气溶胶样本的检测，还可用于其他临床样本如血液和 奶样等的检测。
(4)本发明提供的布鲁氏菌S2疫苗株鉴别诊断RPA-LFD检测方法使用方便，无需特 殊仪器设备，仅仅在38℃下，20min就能对待测样本的粗裂解物进行布鲁氏菌S2疫苗株的 灵敏、特异、简易地鉴别检测，适合现场或基层布病S2疫苗株与野毒株的鉴别诊断工作， 也可用于布鲁氏菌属细菌的检测。
附图说明
图1为布鲁氏菌S2疫苗株鉴别诊断RPA-LFD检测组合的引物与探针的筛选结果，其 中，Control Primer/Probe Mix扩增组为TwistAmp nfo kit提供的引物、探针与模板的RPA扩 增结果；Brucella-RPA-LFD组为本发明筛选出的特异性检测布鲁氏菌属细菌的引物与探针 的扩增结果；S2-RPA-LFD组为本发明筛选出的特异性检测布鲁氏菌S2疫苗株的引物与探 针的扩增结果；NC是以ddH2O代替模板的阴性对照。
图2布鲁氏菌S2疫苗株鉴别诊断RPA-LFD灵敏性检测结果，其中，模板分别为2.5 ×106cfu–2.5×10-1cfu猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组DNA，NC是以ddH2O代替模板的 阴性对照组。
图3布鲁氏菌S2疫苗株鉴别诊断RPA-LFD特异性检测结果，其中，B.suis S2、B.abortus A19、B.melitensis M5-90、B.ovis、B.canis、E.coli O157:H7、Y.enterocolitica O:9、Salmonella、 S.aureus的模板分别为猪种布鲁氏菌疫苗株S2株、牛种布鲁氏菌疫苗株A19株、羊种布鲁 氏菌疫苗株M5-90株、绵羊种布鲁氏菌63/290株、犬布鲁氏菌RM6/66株、大肠杆菌 O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌O:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌基因组DNA；NC是以ddH2O 代替模板的阴性对照组。
图4气溶胶等临床样本的布鲁氏菌S2疫苗株RPA-LFD鉴别诊断结果，其中，+：模 板为猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组DNA，NC：以ddH2O代替模板的阴性对照组，1-10： 布鲁氏菌核酸阳性气溶胶样本，其中1号和5号样本为S2疫苗株核酸阳性气溶胶样本， 11-12：布鲁氏菌核酸阳性血液样本，其中11号样本为S2疫苗株核酸阳性血液样本，13-14： 布鲁氏菌核酸阳性奶样样本，其中13号样本为S2疫苗株核酸阳性奶样样本，15-17：分别 为布鲁氏菌阴性气溶胶、血液和奶样临床样本。
具体实施方式
下述实施例用于进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例均按照常规试验条件与方法进行，或者按照制造厂商所建议的试验条件。 1.试验材料
猪种布鲁氏菌疫苗株S2株(B.suis S2)，牛种布鲁氏菌疫苗株A19株(B.abortus A19)， 羊种布鲁氏菌疫苗株M5株(B.melitensis M5)，绵羊种布鲁氏菌63/290株(B.ovis 63/290)， 犬布鲁氏菌RM6/66株(B.canis RM6/66)，大肠杆菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌O:9、 沙门氏菌、金黄色葡萄球菌(CMCC26003)、临床上确诊为布鲁氏菌阳性的气溶胶、血液 和奶样DNA样本等均由山东省农业科学院奶牛研究中心疾病研究室保存。
引物与探针由上海生工生物有限公司合成。TwistAmp DNA Amplification nfo Kits购自 TwistDX公司，侧流层析试纸条(HybriDetect Dipsticks)购自Milenia公司，其他生化试剂 均为进口分装或国产分析纯。
2.实验仪器
恒温水浴锅，离心机，掌上离心机，涡旋仪，MS-I型多功能微生物采样器(青岛众瑞 智能仪器有限公司)等。
实施例一引物与探针的设计和筛选
目前，RPA-LFD引物与探针的设计没有具体的操作规则，必须经过RPA反应后应用侧 流层析试纸条(LFD)检测，才能筛选获得可用于临床检测的引物与探针。RPA引物的长 度一般为30-35nt，引物过短会严重影响重组酶的活性。长引物并不一定能提高扩增性能， 反而还会增加形成二级结构的可能性。LF探针长度一般在46-52nt，nfo核酶距离探针5’端 30个碱基左右，距离3’端16-22个碱基左右。
实验中需要从靶标序列两端设计多对引物与探针进行优化和筛选，个别碱基的替换或 增减都会对实验结果产生重要影响。因此，以下内容需要注意：
(1)5’端的3-5个核苷酸应当避免聚鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，这样能促引物与扩 增靶基因的结合。对于3’末端的3个核苷酸来说，鸟嘌呤和胞嘧啶有助于聚合酶的稳定结 合，可以提升引物的扩增性能。
(2)引物中最好不要出现特殊序列，比如长串的聚嘌呤或聚嘧啶。GC含量过高(>70％) 或过低(<30％)都不利于RPA扩增。
(3)此外，引物与探针设计时应当尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、引物 -探针互作、发夹结构的序列，减少二聚体的形成。
本发明根据布鲁氏菌属细菌保守的Bcsp31基因(GengBank No.AM773653)设计了2 条特异性探针，在探针的两侧设计了2条正向引物和2条反向引物。同时以猪种布鲁氏菌 S2疫苗株基因组序列上246684-246987位点的305nt个核苷酸序列为靶序列，设计了2条 特异性探针，同时在探针的上游与下游分别设计了4条正向引物和4条反向引物。其中反 向引物定位在S2疫苗株的基因组246967位点处，与其他布鲁氏菌属细菌基因组相比，S2 疫苗株在该位点处缺失25nt个核苷酸序列(TCCCTCATAAATGGCTTTCTTCATA)。RPA-nfo 反向引物定位于此可以将S2疫苗株与其他布鲁氏菌属细菌进行鉴别诊断。以猪种布鲁氏菌 S2疫苗株DNA为模板，对上述布鲁氏菌属引物与探针以及S2鉴别引物与探针的不同组合 进行筛选，最终分别选出一组扩增效率高，特异性强的引物与探针组合，用于布鲁氏菌S2 疫苗株RPA-LFD鉴别检测，引物和探针的序列分别如表1所示，其中，Brucella-RPA-LFD 正向引物序列为SEQIDNo.1，反向引物序列为SEQIDNo.2，探针序列为SEQIDNo.3； S2-RPA-LFD正向引物序列为SEQIDNo.4，反向引物序列为SEQIDNo.5，探针序列为 SEQIDNo.6。
表1
注：Biotin：生物素标记；FAM：羧基荧光素标记；dSpacer：核苷酸碱基类似物，是 nfo核酸酶切割位点；C3-Spacer：聚合酶延伸阻断物。
实施例二布鲁氏菌S2疫苗株鉴别诊断RPA-LFD检测方法的建立
1.实验步骤
(1)细菌基因组DNA的提取
取1ml菌液，按照天根生化科技(北京)有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒说明书 进行细菌总DNA的提取。
(2)布鲁氏菌S2疫苗株鉴别诊断RPA-LFD反应体系的建立
RPA反应体系为50μL：
待测样本DNA或粗裂解产物和ddH2O 13.2μL
将上述混合物加入TwistAmp nfo反应管，充分混匀、溶解。然后加入2.5μL醋酸镁溶 液，将反应管置于38℃，处理20min。反应结束后取2μL与98μL LFD检测缓冲液混合， 将LFD浸入上述混合缓冲液，5min之内观察结果，若Brucella-RPA-LFD与S2-RPA-LFD 两个检测组合同时出现检测条带和对照条带，则该样品中布鲁氏菌S2疫苗株感染阳性； Brucella-RPA-LFD检测组出现检测条带和对照条带，而S2-RPA-LFD检测组仅出现对照条 带，则说明该样品中含有布鲁氏菌S2疫苗株以外的其他布鲁氏菌；Brucella-RPA-LFD与 S2-RPA-LFD两个检测组均未出现检测条带而出现对照条带，则说明检测样本中不含有布鲁 氏菌属细菌。出现其他情况则说明RPA-LFD布鲁氏菌S2鉴别检测不成立。
(3)布鲁氏菌S2疫苗株鉴别诊断RPA-FLD灵敏性检测
利用平板计数法计算猪种布鲁氏菌菌液浓度，分别以10倍倍比稀释成2.5×106– 2.5×10-1cfu/mL菌液，取相应稀释倍数的菌液各1mL，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提 取各稀释倍数的菌液基因组DNA，用100μL TE溶解，取2μL基因组DNA为模板，按照 上述步骤(2)进行RPA扩增，同时以ddH2O为阴性对照，检验本方法的敏感性。
(4)布鲁氏菌S2疫苗株鉴别诊断RPA-FLD特异性检测
以本发明的RPA-FLD试剂盒对猪种布鲁氏菌S2疫苗株、牛种布鲁氏菌A19疫苗株、 羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株、绵羊种布鲁氏菌、犬种布鲁氏菌、大肠杆菌O157:H7、小肠 结肠炎耶尔森菌O:9、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌基因组DNA进行扩增，同时以ddH2O 为阴性对照，验证本方法的特异性。
2.试验结果
对两组RPA-LFD引物与探针组合分别进行RPA-LFD检测筛选，优化出2种最优的引 物和探针组合，结果如图1所示。以10倍倍比稀释的8个梯度的猪种布鲁氏菌S2疫苗株 基因组DNA为模板进行检测，结果如图2所示，50μL体系的两组RPA-LFD检测限均为 2.5×100cfu。对5株不同种属的布鲁氏菌和4株其他细菌作为对照菌株，分别进行两种 RPA-LFD检测，结果如图3所示，5株布鲁氏菌Brucella-RPA-LFD反应管在侧流层析试纸 条的检测线处均出现条带，均为阳性结果；而其他4株细菌菌株和ddH2O对照均未出现检 测条带，均出现对照条带。S2-RPA-LFD扩增组只有猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组出现检 测条带，其他扩增管均未出现检测条带，均为阴性。说明两组RPA-LFD引物与探针组合分 别能特异性检测布鲁氏菌属细菌和布鲁氏菌S2疫苗株。
实施例三气溶胶等临床样本布鲁氏菌S2疫苗株的鉴别诊断
1.实验步骤
(1)气溶胶样本的采集
采用国际标准的全玻璃液体冲击式采样器(all-glass-impinger，简称AGI)，以10mL pH 值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集 养殖场环境中的气溶胶样本。在室温下12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀用于直接 裂解处理。
(2)气溶胶等临床样本的现场制备
将气溶胶等临床样本用200μL TE缓冲液(1.0M Tris-HCl(pH8.0)10mL，0.5M Na2EDTA·2H2O(pH8.0)2mL，加蒸馈水至l000mL)重悬，液体样本直接取200μL， 然后加入30μL 10％(w/v)SDS和3μL 2％(w/v)蛋白酶K，混合后37℃温育1h。
(3)气溶胶等临床样本布鲁氏菌S2疫苗株的鉴别检测
按照步骤(2)中临床样本现场裂解处理的方法，分别对本实验室保存的已经用PCR 扩增后测序正确的2份布鲁氏菌阳性气溶胶样本，其中一份布鲁氏菌S2疫苗株阳性，1份 奶样和1份血液布鲁氏菌阳性样本，以及1份奶样和1份血液布鲁氏菌阴性样本进行处理， 同时以猪种布鲁氏菌S2疫苗株DNA和ddH2O分别为阳性、阴性对照，分别进行两组 RPA-LFD扩增检测。
2.试验结果
对本实验室确诊的11份气溶胶样本、3份血液样本和3份奶样样本，分别进行了 Brucella-RPA-LFD和S2-RPA-LFD检测，其中布鲁氏菌阴性气溶胶、血液和奶样样本各1 份，结果如图4和表2所示。以上结果充分说明用本发明提供的两组RPA-LFD引物、探针 组合以及试剂盒可用于鉴别诊断布鲁氏菌属细菌和S2疫苗株，该方法具有较高的灵敏度和 特异性，最重要的是可以对临床气溶胶等样本直接进行现场快速的诊断。
表2气溶胶等临床样本布鲁氏菌S2疫苗株的鉴别检测结果
上述虽然结合具体实施方式对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保 护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术 人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。