技术领域
本发明涉及用于从含有各血细胞成分的体液选择性地回收白细胞 或单核细胞的分离材、分离方法。
背景技术
近年来，伴随着血液学、科学技术的迅速进步，如下治疗方式得到 广泛普及，即，通过从以全血、骨髓、脐带血、组织提取物为代表的体 液仅分离需要的血液组分并供患者使用来提高治疗效果，进而，通过不 给予治疗所不需要的部分来抑制副作用。
例如，血液输血也是其中之一。红细胞制剂是在出血和红细胞不足 的情况下、或在由于红细胞的功能降低而导致氧缺乏的情况下得到使用 的血液制剂。红细胞制剂中不需要会诱导异常的免疫反应、移植物抗宿 主病（GVHD）等副作用的白细胞，需要用过滤器除去白细胞。根据情 况，有时除白细胞之外，也要除去血小板。
另一方面，血小板制剂是由存在血液凝固因子的缺乏而导致的出血 或有出血趋势的患者所使用的血液制剂。为了制造血小板制剂，通过离 心分离来除去血小板以外的不需要的细胞、成分，仅采集需要的血小板 成分。
而且，近年来，开始积极进行面向白血病、实体癌治疗的造血干细 胞移植，可采取将治疗所需要的含有造血干细胞的白细胞群分离并给予 的方法。作为该造血干细胞的来源，从供体的负担少、增殖能力优异等 优点出发，除骨髓、外周血之外，脐带血也备受关注。另外，近年来， 启示了在月经血中也存在丰富的干细胞，存在此前被废弃的月经血也可 作为珍贵的干细胞来源而被利用的可能性。
对于骨髓、外周血，期望除去不需要的细胞，将白细胞分离、纯化 后给予，另一方面，对于脐带血，用于血缘者的血液银行开始盛行，需 要冷冻保存至使用时，所以出于防止由冷冻保存而导致的红细胞溶血的 目的，也要将白细胞分离、纯化。
作为白细胞的分离方法，提出了利用使用了聚蔗糖（Ficoll）的比重 液进行的离心分离法、使用了作为红细胞沉降剂的羟乙基淀粉的离心分 离法，但存在无法进行封闭体系内的处理而混入异物、菌，处理需要长 时间等问题。
作为不使用离心分离法的细胞分离方法，最近还报告了使用不捕集 红细胞和血小板而仅捕集白细胞的过滤材料来回收白细胞的方法（专利 文献1、专利文献2）。然而，以往，报告了为了将白细胞捕集到过滤器， 纤维直径需要小于3μm（非专利文献1），在各文献的报告中使用的分 离材的纤维直径也小于2.5μm（专利文献1、专利文献2、专利文献3）。 这是由于以往的白细胞除去过滤器以最大限度地除去白细胞为目的，白 细胞的捕集率高，另一方面，存在进行体液处理时容易堵塞，回收操作 时引起压力上升而诱发细胞回收率的降低、工艺问题等问题。
因此，作为用于回收白细胞的过滤器，即使转用以往的白细胞除去 过滤器，也无法实现充分的功能。
专利文献1：日本特表2001-518792号公报
专利文献2：国际公开第98/32840号公报
专利文献3：日本特开平10-313855号公报
非专利文献1：纤维学会志Vol.61,No.8p.P215-216（2005）
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于从含有各血细胞成分的体液在避 免压力上升的同时，以高效率回收白细胞或单核细胞的分离材，以及使 用了该分离材的细胞分离方法。
本发明人等对能够有效率地从体液分离白细胞或单核细胞且不易 引起压力上升的分离材、细胞分离方法进行了深入研究。其结果发现通 过使用特定的分离材，能够有效率地分离白细胞或单核细胞，从而完成 了本发明。
即，本发明涉及一种用于从体液分离白细胞或单核细胞的分离材， 其特征在于，由平均纤维直径为2.0μm～6.0μm且透气性系数M为6.2～35 的无纺布构成。无纺布优选由选自聚烯烃、聚酰胺以及聚酯中的至少1 种构成。体液优选为选自外周血、脐带血、骨髓、月经血以及组织提取 物中的至少1种。
另外，本发明涉及一种细胞分离用容器，其是由将上述分离材填充 于具有体液的入口和体液的出口的容器而得到的。在细胞分离用容器 中，优选将分离材在体液的流动方向上填充有1片分离材或者以层叠的 方式填充有多片分离材，并优选在体液的流动方向上以被压缩的状态进 行填充。细胞分离用容器优选为柱型。
另外，本发明涉及一种细胞分离方法，其包括使体液与上述分离材 接触而分离白细胞或单核细胞的工序。
另外，本发明涉及白细胞或单核细胞的细胞分离方法，其包括使体 液与上述细胞分离用容器接触而将白细胞或单核细胞捕集到分离材的 第一工序；和使用剥离溶液从分离材回收白细胞或单核细胞的第二工 序。在该细胞分离方法中，优选第一工序为从上述细胞分离用容器的入 口导入体液并从出口排出的工序，优选第二工序为从细胞分离用容器的 出口导入剥离溶液并从入口回收白细胞或单核细胞的工序。进一步优选 在第一工序之后并在第二工序之前，包括通过从入口导入生理盐水或缓 冲液来除去细胞分离用容器内的夹杂成分的工序。进一步优选在第一工 序之前，包括使分离材与生理盐水或缓冲液接触的工序。进一步优选在 第一工序之前，包括将细胞分离容器的体液的入口固定在低于细胞分离 容器的体液的出口的高度的工序。优选白细胞和血小板实质上被分离材 捕集而红细胞实质上不被捕集。优选被分离的白细胞或单核细胞包含造 血干细胞和/或间充质干细胞。
另外，本发明涉及一种冷冻保存方法，其特征在于，将利用上述细 胞分离方法得到的细胞置于液氮环境下。液氮环境下优选为-196℃～-30 ℃。在该冷冻保存方法中，优选使用选自二甲基亚砜、右旋糖酐、白蛋 白以及羟乙基淀粉中的至少1种冷冻保护剂。优选冷冻保存过的干细胞 的成活率为80%以上。
另外，本发明涉及白细胞、单核细胞或干细胞，它们是利用上述细 胞分离方法得到的。干细胞优选包含选自CD34阳性细胞、CD133阳性 细胞、CD34阴性且CD133阳性细胞、CD34阳性且CD133阳性细胞、 CD34阳性且CD133阴性细胞、CD45阴性且CD44阳性且CD73阳性 且CD90阳性细胞、CD45阴性且CD235a阴性且CD33阴性且CD7阴 性细胞、CD45阳性且CD133阳性且CD117阳性细胞、CD45阳性且 CD133阴性且CD117阳性细胞、CD45阳性且CD133阳性且CD164阳 性细胞、CD45阳性且CD133阴性且CD164阳性细胞、以及CD45阴 性且CD309阳性细胞中的任一细胞。白细胞优选包含CD45阳性且 CD164阳性细胞、或CD45阳性且CD117阳性细胞。
根据本发明，能够从以全血、骨髓、脐带血、月经血、组织提取物 为代表的体液，简便且迅速地在不易引起堵塞、压力上升的情况下有效 率地分离白细胞或单核细胞。
如果使用本发明的分离材和细胞分离方法，则与以往报告的方案相 比，具有不易引起堵塞，而且白细胞、单核细胞的回收率高的多方面的 优点。进而，该技术也可以在形成白细胞层（buffy coat）等前处理后 使用，但在基本上不进行这样的前处理的情况下也能够从外周血、脐带 血、骨髓、月经血、组织提取物分离白细胞或单核细胞。
将本发明的分离材填充于容器而得到的过滤器也能够在用无菌封 闭体系进行的处理中使用。被回收的含白细胞的液体或含单核细胞的液 体是含有丰富的造血干细胞、间充质干细胞的细胞群，能够作为用于白 血病治疗、心肌再生、血管再生等再生医疗的治疗细胞制备用过滤器而 提供。
就使用本发明的分离材而得到的白细胞而言，红细胞的混入率极 低，即使冷冻保存至使用时，由溶血等引起的影响也非常少。另外，白 细胞被无菌分离，所以也能够直接扩增来制备细胞。因此，本发明的分 离材除输血用制剂制备用途之外，作为用于制备再生医疗用的细胞来源 的过滤器也非常有用。通过使用本发明的分离材，能够制备副作用少、 安全性高的治疗用细胞。
附图说明
图1是新鲜牛外周血的白细胞回收率的结果。
图2是新鲜人外周血的白细胞回收率的结果。
图3是新鲜猪骨髓的白细胞回收率的结果。
图4是新鲜牛外周血的白细胞回收率的结果。
图5是新鲜人外周血的白细胞回收率的结果。
图6是新鲜猪骨髓的白细胞回收率的结果。
图7是柱的示意图。
图8是由造血系干细胞构成的集落照片。
图9是血细胞成分分离系统的一个例子。
图10是血细胞成分分离系统的一个例子（入口比出口低的情况）。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明，但本发明不限于以下的说明。
本发明涉及一种用于从体液分离白细胞或单核细胞的分离材，其特 征在于，由平均纤维直径为2.0μm～6.0μm且透气性系数M为6.2～35以 下的无纺布构成。
从材料与体液的接触时间的观点出发，分离材由为纤维状且容易制 作、得到的无纺布构成。作为无纺布的制造方法，大体分为湿式和干式， 进一步可举出树脂结合、热结合、水刺、针刺、缝编、纺粘、熔喷等， 但不限于这些制法。对于具有10μm以下的纤维直径的无纺布而言，优 选熔喷法、水刺法。也可以对无纺布实施压延加工、等离子体处理。
作为无纺布纤维，也可以优选使用将复合单丝分割为多个的所谓分 割纤维。这是因为纤维复杂地相互缠绕而使血细胞分离效率良好。
分离材可以不放入容器中而使用，也可以将分离材放入具备体液的 入口和出口的容器中而使用。其中，如果考虑实用性，则优选放入容器 中而使用的后者的方式。
构成无纺布的纤维的平均纤维直径优选为2.0μm～6.0μm，更优选为 2.5μm～5.7μm，进一步优选为3.5μm～5.0μm。如果平均纤维直径小于 2.0μm，则容易引起堵塞，回收率有降低的趋势。如果平均纤维直径大 于6.0μm，则将白细胞捕集到分离材的能力有降低的趋势。
应予说明，平均纤维直径是指相对于纤维轴呈直角方向的纤维的宽 度。就纤维直径的测定而言，用扫描式电子显微镜拍摄由无纺布构成的 分离材，将由照片中记载的比例求出的纤维直径的计算值进行平均，从 而求出。换言之，是指测定的纤维直径的平均值，为50个以上的平均 值，优选为100个以上的平均值。但是，多个纤维重叠时、因其它纤维 妨碍而无法测定其宽度时、或者直径显著不同的纤维混杂等时，排除该 数据而算出纤维直径。
分离材的透气性系数M优选为6.2～35，更优选为7.0～14.2，进一步 优选为9.2～10.0。如果透气性系数小于6.2，则细胞被分离材密集地捕 集，所以回收性能有降低的趋势。如果透气性系数大于35，则有细胞难 以被分离材捕集的趋势。
应予说明，透气性系数M是由分离材的透气性（cc/cm2·sec）与厚 度（mm）之积定义的值，是消除了分离材的厚度的影响的本质的参数。 即，透气性是取决于分离材的孔径大小的参数，但即使是相同的透气性， 分离材的厚度越小，本质的透气性也越小，如果换算成相当于相同的厚 度，则透气性变小。因此，通过将透气性乘以厚度，从而成为表示分离 材的本质的孔径的参数。
透气性例如按照JIS L1096-1999所记载的一般织物试验方法（弗雷 泽型法）、或以其为基准能够容易地测定。另外，对于厚度，也可以利 用以数显卡尺为代表的各种设备测定。但是，透气性的测定方法并不限 于这些测定方法。
如果分离材的平均纤维直径为2.0μm～6.0μm，并且，分离材的透气 性系数M为6.2～35，则能够效率良好地分离白细胞或单核细胞。
作为分离材所使用的材料，从灭菌耐性、对细胞的安全性的观点出 发，优选聚烯烃、聚酰胺、聚酯等。作为聚烯烃，可举出聚丙烯、聚乙 烯、高密度聚乙烯、低密度聚乙烯等，作为聚酰胺，可举出尼龙等，作 为聚酯，可举出聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯等。进 而，也可使用聚乙烯醇、偏二氯乙烯、人造丝、维尼纶、丙烯酸类（聚 甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸、聚丙烯 酸酯）、尼龙、聚酰亚胺、芳族聚酰胺（芳香族聚酰胺）、聚酰胺、铜氨 纤维、炭黑、酚类、聚酯、纸浆、麻、聚氨酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯等 合成高分子，琼脂糖、纤维素、乙酸纤维素、壳聚糖、甲壳质等天然高 分子，玻璃等无机材料，金属等，但其中优选聚对苯二甲酸乙二醇酯、 聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚丙烯、丙烯酸类、尼龙、聚氨酯、玻璃。另 外，这些材料不限于单独1种，也可以根据需要将材料复合、混合、融 合而使用。进而，如果需要，则也可以将蛋白质、肽、氨基酸、糖类等 对特定的细胞具有亲和性的分子固定于材料。
体液是指全血、外周血、骨髓、脐带血、月经血、组织提取物以及 它们的组合，也可以是经粗分离的体液。另外，作为成为体液的采集源 的动物种类，例如可举出人、牛、小鼠、大鼠、猪、猿、狗、猫等哺乳 动物。
体液可以预先用抗凝剂处理。作为抗凝剂，可举出ACD （acid-citrate-dextrose）液、CPD（citrate-phosphate-dextrose）液、 CPDA（citrate-phosphate-dextrose-adenine）液等柠檬酸抗凝剂，肝素、 低分子肝素、FUTHAN（甲磺酸萘莫司他）、EDTA等抗凝剂。只要不 对各组分的使用目的造成影响，体液的保存条件就没有特别限制。
作为能够利用上述分离材分离的白细胞或单核细胞，具体而言，可 举出淋巴细胞、单核细胞、CD3阳性细胞、CD14阳性细胞、CD19阳 性细胞、造血干细胞、间充质干细胞。
本发明还涉及将上述的分离材填充于具有体液的入口和出口的容 器而得的细胞分离用容器。
填充分离材的容器的形态、大小、材质没有特别限定。容器的形态 可以是球、箱、盒、袋、管、柱等任意形态。作为优选的具体例，例如 可举出容量约0.1mL～400mL左右、直径约0.1cm～15cm左右的半透明 的筒状容器。另外，可举出一边的长度0.1cm～20cm左右的长方形或正 方形且厚度为0.1cm～5cm左右的四棱柱容器等，但不限于这些。
作为容器的类型，可举出横流型、柱型等。横流型或柱型均可使用， 容器的类型没有特别限定，但从能够均匀地导入回收液这样的观点出 发，更优选柱型。在以往的捕集有核细胞的细胞分离容器中，从能够效 率良好地回收细胞这样的观点出发，可使用横流型，但存在只能使用高 粘度的剥离溶液这样的限制。但是，如果将本发明的分离材与柱型的容 器组合，则即使用低粘度的剥离溶液，细胞回收率也不降低，可得到高 的分离性能。
柱型是指例如相对于过滤器表面，在面的中心附近带有液体的入口 和出口的容器、或入口部和出口部垂直地位于过滤器表面的容器、或以 液体在与过滤器表面垂直的方向上流动为特征的容器、或以液体与分离 材的压缩方向平行地流动为特征的容器。图7表示柱型的一个例子。
另一方面，横流型是指如由白细胞除去过滤器（Asahi Kasei Medical 株式会社制“SEPACELL”、Poul公司制“PURECELL RC”）代表的 那样，相对于过滤器表面，液的入口和出口的位置偏离于表面的中心， 入口部和出口部相对于过滤器表面平行地设置的容器。此处，入口部和 出口部垂直地位于过滤器表面是指入口和出口与表面所成的角度（锐 角）为45度以上且小于90度，入口部和出口部相对于过滤器表面平行 地设置是指入口与出口与表面所成的角度（锐角）为0度以上且小于45 度。
容器可以使用任意的结构材料制作。作为结构材料，具体而言，可 举出非反应性聚合物、生物亲和性金属、合金、玻璃等。作为非反应性 聚合物，可举出丙烯腈丁二烯苯乙烯三元共聚物等丙烯腈聚合物；聚四 氟乙烯、聚氯三氟乙烯、四氟乙烯与六氟丙烯的共聚物、聚氯乙烯等卤 化聚合物；聚酰胺、聚酰亚胺、聚砜、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚 氯乙烯丙烯酸共聚物、聚碳酸酯丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚苯乙烯、聚甲 基戊烯等。对于作为容器的材料而有用的金属材料（生物亲和性金属、 合金），可举出不锈钢、钛、铂、钽、金、及它们的合金、以及镀金合 金铁、镀铂合金铁、钴铬合金、氮化钛被覆不锈钢等。
其中，优选具有灭菌耐性的结构材料，具体而言，可举出聚丙烯、 聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰亚胺、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基戊烯等。
就分离材而言，优选将由无纺布构成的分离材切割成适当的大小， 沿体液的流动方向1片或多片层叠至厚度1mm～200mm左右而使用。 从各组分的分离效率的角度出发，层叠的厚度更优选为1.5mm～150mm， 进一步优选为2mm～100mm。
将分离材填充于容器时，可以在沿体液的流动方向1片或多片层叠 的状态下使用，厚度优选为1mm～50mm左右。从各部分的分离效率的 角度出发，更优选为1.5mm～40mm，进一步优选为2mm～35mm。
另外，也可以将分离材卷成辊状而填充于容器。以辊状使用时，可 以通过从该辊的内侧朝向外侧处理体液来分离血细胞，或者也可以与其 相反地从该辊的外侧朝向内侧处理体液。
将分离材填充于容器时，可以沿体液的流动方向压缩地填充于容 器，也可以不压缩地进行容器填充。压缩的有无可根据分离材的材质等 适当地选择。
在细胞分离容器中，可以将分离材以切割成适当大小的平板状来填 充，也可以以卷成辊状的形状来填充。进而，可以并用2种以上，也可 以并用上述分离材以外的分离材，只要能够构成实质上捕集并回收白细 胞这样的分离系统即可。实质上捕集白细胞是指，在与分离材接触的体 液所含有的白细胞中，60%以上被分离材捕集。进而，在被细胞分离用 容器整体捕集的白细胞中，本发明的分离材捕集的白细胞优选占60%以 上的比例。
细胞分离容器具有实质上不捕集红细胞而实质上捕集白细胞的特 征。此处不捕集红细胞是指，具有在与分离材接触的体液所含有的红细 胞中，60%以上通过分离材的性质。进而，本发明的分离材也可以是实 质上捕集血小板的材料，但不限于此。实质上捕集血小板是指，在与分 离材接触的体液所含有的血小板中，50%以上被分离材捕集。更优选 60%以上被分离材捕集。
另外，本发明涉及一种细胞分离方法，其包括使体液与上述分离材 接触而分离白细胞或单核细胞的工序。进而，本发明涉及一种细胞分离 方法，其包括使体液与上述细胞分离容器接触而在分离材捕集白细胞或 单核细胞的第一工序；和使用剥离溶液，从分离材回收捕集的白细胞或 单核细胞的第二工序。
具体而言，作为第一工序，从入口侧向填充有分离材的容器注入体 液，捕集白细胞或单核细胞而使红细胞通过。接着，作为第二工序，通 过从容器的出口方向，即，与体液、清洗液的通入方向相反的方向流过 剥离溶液，从而能够以高收率分离回收被分离材捕集的白细胞或单核细 胞。另外，虽然不是必要的，但在使体液与分离材接触而在分离材上捕 集白细胞的工序之后，通过从相同方向通入清洗液，从而能够有效率地 回收、分离滞留于容器内的红细胞。
在具有体液的入口和出口的细胞分离容器中流过体液时，可以以比 体液的出口高的方式设置体液的入口，沿与重力相同的方向流过体液， 也可以以比体液的出口低的方式设置体液的入口，沿与重力相反的方向 流过体液。通过沿与重力相反的方向流过体液，从而体液在容器内均匀 地流动，所以能够进一步提高分离效率。
可以使用上述细胞分离容器来构成血细胞成分分离系统。就血细胞 成分分离系统而言，除了细胞分离容器之外，同时具备清洗溶液、剥离 溶液的入口、出口，红细胞回收袋、白细胞回收袋等时，是实用的而优 选的。此时，细胞分离容器具有体液流入的入口和流出的出口，进而与 体液的入口、体液的入口独立地具有冲洗滞留于容器内的红细胞的清洗 溶液的流入部，进而与体液的出口、体液的出口独立地具有清洗液的流 出部，而且，优选除了上述体液和清洗液的流出部或者流出部以外，还 独立地具备用于导入剥离溶液的入口。附属于容器的清洗液的入口、出 口可以作为体液的入口、出口发挥功能，也可以在入口侧的线路中介由 三路活塞等而连接血液袋和清洗溶液袋。分离溶液的导入口也可以作为 体液的出口发挥功能。另外，剥离溶液的回收侧也可以作为体液的入口 发挥功能，同样地也可以介由三路活塞连接各袋、注射器等。图9、图 10表示血细胞成分分离系统的一个例子。
在血细胞成分分离系统中优选进一步配备体液的保存袋、用于回收 被分离白细胞的剥离溶液回收袋、红细胞回收袋等。通过将这些袋与上 述记载的各溶液的入口、出口连接，从而能够在无菌的封闭体系内分离 体液。另外，优选各袋可以在使用后分开使用，可以形成像通常使用的 血液袋这样的形状，也可以是平板状的盒方式等。作为各袋的方式，也 可以根据需要，选择能够进行细胞培养的袋、具有冷冻保存耐性的袋等。
对本发明的分离方法进行具体说明。
1）体液送液工序
从填充有分离材的容器的体液入口侧通入体液时，可以从装有体液 的容器通过送液线路以自由下落进行送液，也可以利用泵进行送液。另 外，将装有体液的注射器直接连接于容器，并用手推注射器。利用泵进 行通液时，如果送液速度过快，则分离效率降低，如果过慢，则有花费 处理时间的趋势。作为送液速度，例如可举出0.1mL/min～100mL/min 的速度，但并不限于此。
另外，作为体液送液工序的前处理，可以实施用生理盐水、缓冲液 浸渍分离材的工序。该操作不是必要的，但考虑到分离材在上述溶液中 的浸渍会影响分离效率的提高和血液流路的确保，所以可以根据情况来 实施。该前处理溶液不必与以下的清洗工序中使用的溶液相同，但如果 相同，则可以共用溶液袋，所以从线路系统的简单化和操作性的观点出 发，优选为相同。作为前处理的液体量，是填充有分离材的容器的1倍 ～100倍左右时，是实用而优选的。作为可以使用的缓冲液，没有特别限 定，但优选林格液、细胞培养所使用的培养液、磷酸缓冲液等通常的缓 冲液。
2）清洗工序
本工序不是必要的，但可以在提高夹杂物的除去效率的情况下实 施。作为能够利用该工序除去的夹杂物，可举出红细胞、血浆等非血细 胞成分。将清洗液从清洗液的流入侧沿与体液送液工序相同方向通入 时，清洗液可以通过线路以自由下落进行送液，也可以利用泵进行送液。 利用泵进行送液时的流速为与体液送液工序相同程度，可举出 0.1mL/min～100mL/min的速度，但并不限于此。清洗量根据容器的容 量而异，如果清洗量过少，则容器中残留的红细胞成分变多，如果清洗 量过多，则分离效率降低，并且需要大量的时间，所以优选以容器的0.5 倍～100倍左右的液量进行清洗。
作为可以使用的清洗液，只要能够只冲洗红细胞并抑制被回收的白 细胞中的其它血细胞的混入，能够保持血细胞的捕集状态，无论使用何 种溶液均可，但优选生理盐水、林格液、细胞培养所使用的培养液、磷 酸缓冲液等通常的缓冲液。
3）白细胞或单核细胞的剥离
从与体液的通入相反的方向（体液流出侧）向填充有分离材的容器 注入剥离溶液，使白细胞剥离。注入剥离溶液时，可以通过预先将剥离 溶液加入注射器等中，并使用手、设备用力挤压注射器的柱塞来实行。 回收液量、流速根据容器的容量、处理量而异，优选容器的1倍～100 倍左右的液量、流速0.5mL/sec～20mL/sec的流速，但并不限于此。
剥离溶液只要是低渗溶液就没有特别限定，可举出生理盐水、林格 液、右旋糖酐葡萄糖注射液（デキストラン糖注）、羟乙基淀粉等作为注 射用剂而具有实际使用效果的溶液、缓冲液、细胞培养用培养液等。
另外，为了提高被捕集的细胞的回收率，可以提高回收液的粘稠度。 因此，可以在上述分离溶液中添加白蛋白、纤维蛋白原、球蛋白、右旋 糖酐、羟乙基淀粉、羟乙基纤维素、胶原蛋白、透明质酸、明胶等，但 并不限于这些。剥离溶液的粘度没有特别限定，但如果粘度过高，则有 难以进行回收操作的趋势，所以更优选为20mPa·s以下。如果是柱型 的容器，则即使使用低粘度的剥离溶液分离性能也不降低，所以即使在 10mPa·s以下也可以使用。进而，即使是5mPa·s以下的剥离溶液也 可以使用。
在利用上述细胞分离方法而被回收的白细胞中，优选含有造血干细 胞、间充质干细胞、CD34阳性细胞。
另外，本发明涉及一种冷冻保存方法，其特征在于，将利用上述细 胞分离方法得到的细胞置于液氮环境下。上述细胞分离方法与以往的离 心分离法相比，赋予细胞的应力非常低，所以利用该细胞分离方法得到 的细胞的冷冻保存后的活性非常高。
将细胞冷冻保存时，出于保护冷冻时的细胞的目的，可添加冷冻保 护剂。添加的冷冻保护剂的种类没有特别限制，可以使用二甲基亚砜、 右旋糖酐、白蛋白、羟乙基淀粉等。上述冷冻保护剂可以单独使用，也 可以组合多种使用。
对于冷冻保存方法而言，细胞只要在液氮环境下保存即可，可以在 浸渍于液氮的状态下保存，也可以在液氮的气体下保存。保存时的温度 没有特别限定，但为了防止细胞的活性降低，优选为-196℃～-30℃。更 优选为-196℃～-50℃，进一步优选为-196℃～-70℃。
本发明还涉及利用上述冷冻保存方法得到的白细胞、单核细胞、干 细胞。作为利用上述冷冻保存方法得到的干细胞，只要是体液中含有的 具有自我复制能力且具有分化能力的细胞，无论是何种干细胞均可。具 体而言，可举出造血干细胞、间充质干细胞、胚胎样干细胞 （Embryonic-like Stem Cell）、血管内皮前体细胞等。
作为造血干细胞的例子，可举出CD34阳性细胞、CD133阳性细胞、 CD34阴性且CD133阳性细胞、CD34阳性且CD133阳性细胞、CD34 阳性且CD133阴性细胞、CD45阳性且CD133阳性且CD117阳性细胞、 CD45阳性且CD133阴性且CD117阳性细胞、CD45阳性且CD133阳 性且CD164阳性细胞、CD45阳性且CD133阴性且CD164阳性细胞。
作为通常的造血干细胞，可举出CD34阳性细胞或CD133阳性细胞， 但在脐带血中，认为造血干细胞会分化成CD34阴性且CD133阳性细 胞、CD34阳性且CD133阳性细胞、CD34阳性且CD133阴性细胞。如 果使用本发明的分离材，则能够也分离这些造血干细胞，并且，分离后 的细胞即使进行冷冻，活性的降低也少。另外，对于造血干细胞中，特 别是可以说与移植时的植入相关的作为造血生长因子（Stem Cell Factor）受体的CD117阳性细胞、与细胞粘附相关的CD164阳性细胞 而言，用本发明的分离材分离后，即使进行冷冻，活性的降低也少。
另外，利用本发明的分离材将被认为是脐带血中间充质干细胞的 CD45阴性且CD44阳性且CD73阳性且CD90阳性细胞分离后，即使 进行冷冻，活性的降低也少。脐带血中仅存在少数间充质干细胞，用离 心分离时，存在损失大且不易分离的问题，但用本发明的分离材时，能 够有效率地进行分离。
脐带血中存在谱系阴性造血干细胞（Lineage Negative Stem Cell） 这样的具有多分化能力的有趣的干细胞，被称为胚胎样干细胞 （Embryonic-like Stem Cell）。用本发明的分离材时，能够有效率地分 离该CD45阴性且CD235a阴性且CD33阴性且CD7阴性细胞，即使进 行冷冻，活性的降低也少。
对于血管内皮前体细胞的CD45阴性且CD309阳性细胞，用本发明 的分离材分离后，即使进行冷冻，活性的降低也少。
另外，对于白细胞中的CD45阳性且CD164阳性细胞、CD45阳性 且CD117阳性细胞而言，用本发明的分离材分离后，即使进行冷冻， 活性的降低也少。
冷冻保存后的细胞的成活率优选为80%以上，更优选为85%以上。
实施例
以下，在实施例中对本发明进行详细叙述，但本发明不限于以下的 实施例的方式。以下的实施例和比较例所示的无纺布以非压缩时的厚度 均为恒定的范围的方式调整片数，进行填充。另外实施例和比较例中的 填充有分离材的容器为如图7所示的柱型，液的入口和出口相对于过滤 器的面位于中心，液的入口和出口位于与过滤器表面垂直的位置。
（实施例1）
将28片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布（平均纤维直径2.0μm、透 气性系数M=7.0）在层叠状态下以图7所示的方式填充厚度6mm且直 径18mm的由聚碳酸酯形成的柱状容器中。首先，从入口侧使用注射器 用手按压而通入45mL的生理盐水。接着，以2.5mL/min的速度通入 20mL的CPD抗凝固的新鲜牛血液（以CPD：血液=200：28混合而成 的含有12%CPD的牛外周血），接着，从相同方向通入10mL的生理盐 水。其后，通过使用注射器用手按压而从相反方向通入30mL的添加 10%FBS的αMEM培养液（粘度2.9mPa·s），由此回收白细胞。剥离 溶液能够顺利地导入。利用血细胞计数器（Sysmex公司制，K-4500） 测定处理前血液的血细胞计数、回收的溶液的血细胞计数，算出白细胞 的回收率。结果示于表1、图1以及图4。
（实施例2）
将28片聚丙烯制无纺布（平均纤维直径3.5μm、透气性系数M=9.6） 以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。结果示于表 1、图1以及图4。
（实施例3）
将28片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布（平均纤维直径2.9μm、透 气性系数M=10.0）以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同 的操作。结果示于表1、图1以及图4。
（实施例4）
将32片尼龙制无纺布（平均纤维直径5.0μm、透气性系数M=9.2） 以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。结果示于表 1、图1以及图4。
（比较例1）
将84片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布（平均纤维直径1.7μm、透 气性系数M=5.9）以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的 操作。回收操作时受到少许阻力，所以柱内压高而堵塞。结果示于表1、 图1以及图4。
（比较例2）
将30片聚丙烯制无纺布（平均纤维直径2.1μm、透气性系数M=6.0） 以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。结果示于表 1、图1以及图4。
（比较例3）
将24片聚丙烯制无纺布（平均纤维直径4.9μm、透气性系数M=39.6） 以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例1相同的操作。结果示于表 1、图1以及图4。
表1
表1
（实施例5）
使用10mL的CPD抗凝固的新鲜人血液来代替20mL的CPD抗 凝固的新鲜牛血液，除此之外，使用与实施例1相同的分离材，实施相 同的操作。进而，用FACS溶血素（FACS Lysing Solution）将处理前 的血液、回收的分离溶液溶血后，利用流式细胞仪（BD FACSCanto） 求出单核细胞阳性率，将白细胞数与单核细胞阳性率相乘，算出总单核 细胞数。将用处理前的总单核细胞数去除回收的溶液中的总单核细胞数 而得的比例作为单核细胞回收率。结果示于表2、图2以及图5。
（实施例6）
使用10mL的CPD抗凝固的新鲜人血液来代替20mL的CPD抗 凝固的新鲜牛血液，除此之外，使用与实施例2相同的分离材，实施相 同的操作。结果示于表2、图2以及图5。
（实施例7）
使用10mL的CPD抗凝固的新鲜人血液来代替20mL的CPD抗凝 固的新鲜牛血液，除此之外，使用与实施例3相同的分离材，实施相同 的操作。进而，用FACS溶血素（FACS Lysing Solution）将处理前的 血液、回收的分离溶液溶血后，利用流式细胞仪（BD FACSCanto）求 出单核细胞阳性率，将白细胞数与单核细胞阳性率相乘，算出总单核细 胞数。将用处理前的总单核细胞数去除回收的溶液中的总单核细胞数而 得的比例作为单核细胞回收率。结果示于表2、图2以及图5。
（实施例8）
代替聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布（平均纤维直径2.9μm、透气 性系数M=10.0），将40片聚丙烯制无纺布（纤维直径5.7μm、透气性 系数M=14.2）以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例7同样的操 作。结果示于表2、图2以及图5。
（比较例4）
使用10mL的CPD抗凝固的新鲜人血液来代替20mL的CPD抗凝 固的新鲜牛血液，除此之外，使用与比较例1相同的分离材，实施相同 的操作。回收操作时受到少许阻力，所以柱内压高而堵塞。结果示于表 2、图2以及图5。
（比较例5）
使用10mL的CPD抗凝固的新鲜人血液来代替20mL的CPD抗凝 固的新鲜牛血液，除此之外，使用与比较例2相同的分离材，实施相同 的操作。结果示于表2、图2以及图5。
表2
表2
（实施例9）
使用用肝素（最终浓度50单位/mL）和CPD（最终浓度12%）进 行了抗凝固的10mL新鲜猪骨髓来代替20mL的CPD抗凝固的新鲜牛 血液，除此之外，使用与实施例3相同的分离材，实施相同的操作。结 果示于表3、图3以及图6。
（实施例10）
将24片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布（平均纤维直径5.3μm、透 气性系数M=20.0）以层叠状态填充，除此之外，实施与实施例9相同 的操作。结果示于表3、图3以及图6。
（比较例6）
使用比较例2的分离材，除此之外，实施与实施例9相同的操作。 回收操作时用注射器推出时有非常大的阻力，无法顺利地推出，所以柱 内压高而堵塞。结果示于表3、图3以及图6。
表3
表3
（实施例11）
使用实施例3的分离材、25mL的含12%CPD的新鲜牛血液，在 30mL的含10%ACD-A、10%FBS的αMEM培养液（粘度2.9mPa·s） 中进行回收操作。结果示于表4。
（实施例12）
使用含10%ACD-A、4%人血清白蛋白的低分子右旋糖酐葡萄糖注 射液（大塚制药公司制）（粘度7.3mPa·s），除此之外，用与实施例11 相同的分离材、相同的方法实施实验。结果示于表4。
（实施例13）
使用6%的含10%ACD-A的SALINHES输液（Fresenius Kabi Japan公司制）（粘度2.3mPa·s），除此之外，用与实施例11相同的分 离材、相同的方法实施实验。结果示于表4。
（实施例14）
使用6%的含10%ACD-A、4%人血清白蛋白的Salinhes输液 （Fresenius Kabi Japan公司制）（粘度4.3mPa·s），除此之外，用与 实施例11相同的分离材、相同的方法实施实验。结果示于表4。
（实施例15）
使用含10%ACD-A的20%蔗糖，除此之外，用与实施例11相同的 分离材、相同的方法实施实验。结果示于表4。
（实施例16）
使用含10%ACD-A的生理盐水（大塚制药公司制）（粘度 1.1mPa·s），除此之外，用与实施例11相同的分离材、相同的方法实 施实验。结果示于表4。
表4
表4
如实施例11～16的结果所示，如果使用本发明的分离材，则无论使 用何种回收液，均能以高的回收率回收白细胞。
（实施例17）
以白细胞浓度成为2×106的方式调制实施例8中被回收的细胞，在 3mL的甲基纤维素培养液MethoCult H4034（StemCell Technologies公 司制）中添加0.3mL后，将1.1mL的混合液分注于培养皿中，在37℃、 5%CO2下培养。14天后用显微镜观测，其结果是，确认了形成由红细 胞系前体细胞、白细胞前体细胞等造血系干细胞构成的各种集落，被回 收的细胞包含CD34阳性细胞、造血干细胞。将由造血系干细胞构成的 集落的照片示于图8。
（实施例18）
将3mL的实施例9、实施例10中被回收的细胞溶液用含10%FBS 的αMEM培养液制成合计10mL，接种于10cm的培养皿，在37℃、 5%CO2下培养。每3天进行1次培养液交换，培养9天，结果是，确 认了粘附于培养皿的间充质干细胞的集落，确认了被回收的细胞包含间 充质干细胞。
（实施例19）
在厚度12mm且直径44mm的由聚碳酸酯形成的柱状容器中，将112 片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布（平均纤维直径3.5μm、透气性系数 M=8.9）以层叠状态以图7所示的方式填充。如图10所示，以入口比出 口低的方式设置细胞分离容器。首先，将约50mL的生理盐水以从体液 的入口流向出口的方式通入。接着，沿相同方向通入80mL的CPD抗 凝固人外周血，将白细胞捕集到细胞分离容器。最后切换线路，以与通 入相反的方向，即以从体液的出口流向入口的方式，使用注射器用手按 压导入6%的含4%人血清白蛋白的Salinhes输液（Fresenius Kabi Japan公司制）（粘度4.3mPa·s），将细胞回收于细胞回收袋。结果示 于表5。
（实施例20）
使用生理盐水（粘度1.1mPa·s）来代替6%的含4%人血清白蛋白 的Salinhes输液（Fresenius Kabi Japan公司制）（粘度4.3mPa·s）， 除此之外，进行与实施例19相同的操作。结果示于表5。
（实施例21）
使用CPD抗凝固人脐带血来代替CPD抗凝固人外周血，除此之外， 进行与实施例19相同的操作。结果示于表5。
（实施例22）
在厚度12mm且直径44mm的由聚碳酸酯形成的柱状容器中，将112 片聚对苯二甲酸丁二醇酯制无纺布（平均纤维直径3.5μm、透气性系数 M=8.9）以层叠状态以成为图7所示的方式填充。如图9所示，以入口 高于出口的方式设置细胞分离容器。首先，将约50mL的生理盐水以从 体液的入口流向出口的方式通入。接着，向相同方向通入80mL的CPD 抗凝固人脐带血，将白细胞捕集到细胞分离容器捕集。最后切换线路， 以与通入相反的方向，即以从体液的出口流向入口的方式，使用注射器 用手按压导入6%的含4%人血清白蛋白的Salinhes输液（Fresenius Kabi Japan公司制）（粘度4.3mPa·s），将细胞回收于细胞回收袋。 结果示于表5。
（实施例23）
使用150mL的CPD抗凝固牛外周血来代替80mL的CPD抗凝固 人外周血，除此之外，进行与实施例19相同的操作。结果示于表5。
（实施例24）
使用150mL的CPD抗凝固牛外周血来代替80mL的CPD抗凝固 人脐带血，除此之外，进行与实施例22相同的操作。结果示于表5。
表5
表5
由以上结果可知，通过使用本发明的分离材和分离方法，从而在不 易引起压力上升且不依赖于剥离溶液的种类的情况下，能够效率良好地 分离白细胞或单核细胞。通过以入口低于出口的方式设置细胞分离容 器，从而能够进一步提高白细胞回收率。另一方面，如比较例所示，如 果使用纤维直径、透气性系数M小的无纺布，则有压力上升的趋势， 总体上有白细胞回收率降低的趋势。
（实施例25）
将实施例21和实施例22中分离的细胞冷冻保存，评价冷冻保存后 的细胞的活性。将分离的细胞转移至Cryobag（Macopharma公司制）， 冷冻至4℃后，以DMSO的最终浓度成为10%的方式添加DMSO和右 旋糖酐40的混合液作为冷冻保护剂。其后，用程序冰箱一点一点地阶 段性地降低温度，在液氮罐中（负196℃）以冷冻状态保存。14天后， 将冷冻保存的细胞在37℃的温浴中解冻，转移至右旋糖酐和白蛋白的混 合液。将该混合液离心除去上清液后，使细胞再次悬浮于右旋糖酐和白 蛋白的混合液，进行细胞的计数。算出分离后的处理液中含有的细胞数 相对于分离前的细胞数的比例来作为分离后回收率。另外，算出冷冻后 的处理液中含有的细胞数相对于冷冻前的细胞数的比例来作为冷冻后 回收率。
对于实施例21中得到的细胞，算出白细胞、单核细胞、CD34阳性 细胞、CD133阳性细胞、CD34阴性且CD133阳性细胞、CD34阳性且 CD133阳性细胞、CD45阳性且CD133阳性且CD117阳性细胞、CD45 阳性且CD133阴性且CD164阳性细胞、以及CD45阳性且CD117阳 性细胞的分离后的回收率、冷冻保存后的回收率、冷冻保存后的成活率。 结果示于表6。
表6
表6
对于实施例22中的得到的细胞，算出白细胞、单核细胞、CD34阳 性细胞、CD133阳性细胞、CD34阴性且CD133阳性细胞、CD34阳性 且CD133阳性细胞、CD34阳性且CD133阴性细胞、CD45阴性且CD44 阳性且CD73阳性且CD90阳性细胞、CD45阴性且CD235a阴性且 CD33阴性且CD7阴性细胞、CD45阳性且CD133阳性且CD117阳性 细胞、CD45阳性且CD133阴性且CD117阳性细胞、CD45阳性且CD133 阳性且CD164阳性细胞、CD45阳性且CD133阴性且CD164阳性细胞、 CD45阴性且CD309阳性细胞、CD45阳性且CD164阳性细胞、CD45 阳性且CD117阳性细胞的分离后的回收率、冷冻保存后的回收率、冷 冻保存后的成活率。结果示于表7。
表7
表7
如上所述，就本发明的细胞分离方法而言，赋予细胞的应力非常低， 所以用该细胞分离方法得到的细胞即使冷冻保存后，也维持高的活性。 符号说明
1 体液的入口
2 体液的出口
3 分离材
4、5 用于压缩分离材的垫圈
6 容器
7 血细胞分离柱
8 腔室
9 填充有血细胞分离材的容器
10 体液袋
11 预充液袋（兼清洗液袋）
12 红细胞回收袋
13 白细胞回收袋（单核细胞回收袋）
14 回收端口
15、16、17 三路活塞
18～24 线路