一种快速鉴定黄瓜品系刺瘤稀密的分子标记、鉴定方法及应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201510261703.4	申请日：	20150521
公开号：	CN104805216A	公开日：	20150729
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C12Q1/68,C12N15/11	主分类号：	C12Q1/68,C12N15/11
申请人：	山东农业大学
发明人：	任仲海,张海洋,曹辰兴,王丽娜,李强
地址：	271018 山东省泰安市泰山区岱宗大街61号
优先权：	CN201510261703A
专利代理机构：	石家庄国域专利商标事务所有限公司	代理人：	白海静
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内容摘要

本发明公开了一种快速鉴定黄瓜品系刺瘤稀密的分子标记，该分子标记为分子标记MM3、分子标记MM1或分子标记MM2；所述分子标记MM3由SEQ?ID?NO:?9所示的核苷酸序列和SEQ?ID?NO:?10所示的核苷酸序列组成，其中SEQ?ID?NO:?9所示的核苷酸序列与黄瓜密刺基因FS1完全连锁，SEQ?ID?NO:?10所示的核苷酸序列与黄瓜稀刺基因fs1完全连锁；同时，本发明还提供了一种利用分子标记MM3快速鉴定黄瓜品种或品系刺瘤稀密的方法。本发明提供的分子标记及鉴定方法有助于建立稀/密刺瘤黄瓜的分子标记辅助育种体系；并将其应用于黄瓜育种实践中，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约生产成本，大大提高目标黄瓜品种或品系刺瘤类型的选择效率和质量，具有很高的社会经济价值。

权利要求书

1.一种快速鉴定黄瓜品系刺瘤稀密的分子标记，其特征在于，该分子标记为分子标记MM1、分子标记MM2或分子标记MM3中的一种；所述分子标记MM3由SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列组成，其中SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列与黄瓜密刺基因FS1完全连锁，SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列与黄瓜稀刺基因fs1完全连锁；所述分子标记MM2由SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列组成；其中SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列与黄瓜密刺基因FS1紧密连锁，SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列与黄瓜稀刺基因fs1紧密连锁；所述分子标记MM1由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列组成；其中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列与黄瓜密刺基因FS1紧密连锁，SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列与黄瓜稀刺基因fs1紧密连锁。 2.根据权利要求1所述的快速鉴定黄瓜品系刺瘤稀密的分子标记，其特征在于，所述分子标记MM1是由SEQ ID NO: 3所示的上游引物和SEQ ID NO: 4所示的下游引物扩增得到。 3.根据权利要求1所述的快速鉴定黄瓜品系刺瘤稀密的分子标记，其特征在于，所述分子标记MM2是由SEQ ID NO: 7所示的上游引物和SEQ ID NO: 8所示的下游引物扩增得到。 4.根据权利要求1所述的快速鉴定黄瓜品系刺瘤稀密的分子标记，其特征在于，所述分子标记MM3是由SEQ ID NO: 11所示的上游引物和SEQ ID NO: 12所示的下游引物扩增得到。 5.一种权利要求1所述的分子标记用于定位或检测黄瓜刺瘤密度基因在黄瓜育种中的用途。 6.一种快速鉴定黄瓜刺瘤稀密品种或品系的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）用分子标记MM3的标记引物对待测黄瓜品种或品系的DNA分别进行PCR扩增，其PCR扩增体系为：基因组DNA 50 ng，上、下游引物均为10 μmol/L，200 μmol/L dNTPs，1×EasyTaq Buffer缓冲液，1.5 U EasyTaqDNA聚合酶，总反应体系为10 μL；PCR扩增程序为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸2.5 min；35个循环，72℃后延伸10 min，得扩增产物；（2）将所述扩增产物电泳分离后，如获得的扩增产物中出现分子量为1475 bp的条带，则说明该品种为密刺瘤黄瓜的品种或品系，如获得的扩增产物中仅出现了分子量为2277 bp的一种条带，则说明该品种为稀刺瘤黄瓜的品种或品系。 7.根据权利要求6所述的快速鉴定黄瓜刺瘤稀密品种或品系的方法，其特征在于，步骤（1）所述分子标记MM3的标记引物的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO: 11所示、下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO: 12所示。 8.根据权利要求6所述的快速鉴定黄瓜刺瘤稀密品种或品系的方法，步骤（2）中所述的电泳分离是指在1.2%琼脂糖凝胶上电泳分离，所述1.2%琼脂糖凝胶是指100 ml的TBE缓冲液中含有1.2 g琼脂糖粉。

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体地说是一种快速鉴定黄瓜品系刺瘤稀密的分子标记、鉴定方法及应用。

背景技术

黄瓜是具有重要经济价值的园艺作物之一，在世界范围内广泛地栽培。由于黄瓜品质的高低直接关系着黄瓜种植的效益，因此，高品质育种一直是黄瓜育种工作中的重中之重。我国黄瓜品种的类型主要分为华北型和华南型，这两种类型的黄瓜各有优缺点，主要表现在华南型大多数为稀刺瘤品种，但黄瓜风味清淡；华北型黄瓜风味浓郁，但多为密刺瘤品种。对于密刺的华北型黄瓜来说，黄瓜在生产过程中，农药大量使用，与光滑型黄瓜相比，密刺瘤黄瓜不易清洗，造成农药残留较多，并且不利于包装和运输。因此，在黄瓜育种过程中，有目的地选育稀刺品种是提高黄瓜外观品质的一个重要研究方向。

现有技术中，已有一些科研人员对黄瓜的外观品质做了相关研究。如曹辰兴等研究了黄瓜果刺基因与果瘤基因相互作用，且证明果刺基因对果瘤基因存在隐性上位作用，使黄瓜果实表现为有瘤有刺、无瘤有刺、无瘤无刺三种表型（黄瓜茎叶无毛性状与果实瘤刺性状的遗传关系. 园艺学报, 2001,28(6): 565-566）。又如Yang等在《Tuberculate fruit gene Tu encodes a C2H2 zinc finger protein that is required for the warty fruit phenotype in cucumber (Cucumis sativus L.)》中报道了在黄瓜中控制果瘤性状的基因，并且该基因已被定位并克隆，且获知该基因位于5号染色体上，编码了一个C2H2锌指蛋白，控制着黄瓜果实表面果瘤的产生（《The Plant Journal》(植物学杂志). 2014年第78卷第3期1034–1046页）。此外，Li等在《The identification of Cucumis sativus Glabrous 1 (CsGL1) required for the formation of trichomes uncovers a novel function for the homeodomain-leucine zipper I gene》报道了位于3号染色体上的无果刺基因（CsGL1）也已被定位并克隆，编码了一个HD-Zip I类转录因子，控制着黄瓜地上部分表皮毛以及果实表面蜡粉的发育（《Journal of Experimental Botany》（实验植物学杂志）2015 年3月）。但是，迄今为止，还未见有与黄瓜刺瘤密度相关的基因被定位或克隆的相关报道。

图位克隆技术是通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域，进而定位并克隆该基因。DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映。DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异，包括单个核苷酸的变异。CAPS标记是特异引物PCR产物与限制性酶切相结合而产生的一种DNA标记，它实际上是一些特异引物PCR标记（如SCAR和STS）的一种延伸，它揭示的是特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变异的信息，也表现为限制性片段长度的多态性。SNP标记是基于单个核苷酸多态性的DNA标记，SNP数量丰富，可以进行自动化检测。

由于还未有黄瓜刺瘤密度基因被定位及克隆的报道，目前，与黄瓜刺瘤密度相关的育种工作，仍靠育种者在黄瓜结实后对果实刺瘤性状的观察来进行筛选，这样育种研究人员不但无法在苗期进行选择，而且也很难对刺瘤密度基因进行小片段的精确转移。因此，在黄瓜遗传育种中，非常有必要开发一种与刺瘤密度紧密连锁或完全连锁的分子标记，以便在苗期进行分子标记辅助选择，以加快黄瓜稀刺或密刺高品质类型的选育进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速鉴定黄瓜品系刺瘤稀密的分子标记、鉴定方法及应用，以利用该分子标记对黄瓜刺瘤密度基因进行定位和检测，在黄瓜品种选育中对其亲本进行有目的地选择，为选育目标刺瘤类型的黄瓜新品种提供指导依据。

本发明是通过以下方法实现的：一种快速鉴定黄瓜品系刺瘤稀密的分子标记，该分子标记为分子标记MM1、分子标记MM2或分子标记MM3中的一种；

所述分子标记MM3是与黄瓜刺瘤密度基因完全连锁的分子标记，所述分子标记MM3由SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列组成，其中SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列与黄瓜密刺基因FS1完全连锁，SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列与黄瓜稀刺基因fs1完全连锁；所述分子标记MM3是由SEQ ID NO: 11所示的上游引物和SEQ ID NO: 12所示的下游引物扩增得到；

所述分子标记MM2是与黄瓜刺瘤密度基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记MM2由SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 6 所示的核苷酸序列组成；其中SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列与黄瓜密刺基因FS1紧密连锁，SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列与黄瓜稀刺基因fs1紧密连锁；所述分子标记MM2是由SEQ ID NO: 7所示的上游引物和SEQ ID NO: 8所示的下游引物扩增得到；

所述分子标记MM1是与黄瓜刺瘤密度基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记MM1由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列组成；其中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列与黄瓜密刺基因FS1紧密连锁，SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列与黄瓜稀刺基因fs1紧密连锁；所述分子标记MM1是由SEQ ID NO: 3所示的上游引物和SEQ ID NO: 4所示的下游引物扩增得到。

本发明所述的分子标记在黄瓜育种中的用途是定位或检测待测黄瓜品种或品系中刺瘤密度基因。

一种快速鉴定黄瓜刺瘤稀密品种或品系的方法，包括以下步骤：

（1）用分子标记MM3的标记引物对待测黄瓜品种或品系的DNA分别进行PCR扩增，其PCR扩增体系包括：基因组DNA 50 ng，上、下游引物均为10 μmol/L，200 μmol/L dNTPs，1×EasyTaq Buffer缓冲液，1.5 U EasyTaqDNA聚合酶，总反应体系为10 μL，PCR扩增程序为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸2.5 min；35个循环，72℃后延伸10 min，得扩增产物；

（2）将所述扩增产物电泳分离后，如获得的扩增产物中出现分子量为1475 bp的条带，则说明该品种为密刺瘤黄瓜品种或品系，如获得的扩增产物中仅出现了分子量为2277 bp的一种条带，则说明该品种为稀刺瘤黄瓜品种或品系。

步骤（2）中所述的电泳分离是指在1.2%琼脂糖凝胶上电泳分离，所述1.2%琼脂糖凝胶是指100 ml的TBE缓冲液中含有1.2 g琼脂糖粉。

本发明提供三个分子标记：其中分子标记MM1和分子标记MM2与黄瓜刺瘤密度基因紧密连锁，MM1为SNP分子标记，MM2为CAPS分子标记，与黄瓜稀刺瘤基因fs1物理距离为110 Kb左右，其黄瓜的稀刺基因fs1在所述的两个分子标记之间（如图5所示）；且本发明还特别地在分子标记MM1和分子标记MM2区间找到了一个与黄瓜稀刺基因fs1完全连锁的分子标记MM3，并利用该分子标记开发了快速鉴定黄瓜品种或品系刺瘤稀密的方法，即利用开发的分子标记用于检测和定位待测黄瓜品种或品系中是否含有稀刺基因fs1和密刺瘤基因FS1的情况，进而鉴定不同黄瓜品种或品系的刺瘤密度。本发明提供的分子标记及鉴定方法不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约生产成本，大大提高目标黄瓜品种或品系刺瘤密度的选择效率和质量，将大大缩短稀刺或密刺高品质黄瓜的育种年限，具有很高的社会经济价值。同时，本发明提供的分子标记及鉴定方法能够在DNA水平上对目标性状进行选择，有助于建立稀/密刺瘤黄瓜的分子标记辅助育种体系，便于快速、高通量地应用于黄瓜育种实践中。

附图说明

图1是分子标记MM1对亲本及F2代交换个体的分析结果图。

图2是分子标记MM2对亲本及F2代交换个体部分随机植株的分析结果图。

图3是分子标记MM3对亲本及F2代交换个体的分析结果图。

图4是用分子标记MM3对现有24种不同地域代表性黄瓜稀、密刺瘤品系检测的PCR扩增结果图。

图5是与稀刺瘤基因fs1连锁的分子标记示意图。其中数字代表交换个体的个数，其中MM1和MM2是两个与稀刺基因fs1连锁非常紧密的标记，区间为110 kb；MM3是与稀刺瘤基因fs1完全连锁的分子标记。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 遗传分离群体的构建

以华北型黄瓜自交系9930为母本，以华北型黄瓜自交系山农CNS5为父本。其母本黄瓜自交系9930果实表型为密刺瘤；其父本黄瓜自交系山农CNS5，是从华北型黄瓜农城2号自交系山农CNS2中分离出来的自然突变体，其果实表型表现为稀刺瘤。

利用这两个亲本配制了杂交组合，得到F1果实的刺瘤密度介于两亲本之间，F1代自交产生F2代群体，随机选了78株用于进行遗传分离规律分析。

在78株F2的个体中，统计每个植株果实刺瘤密度，卡方分析法分析密刺/稀刺性状的分离比，最后确定了在这个群体中黄瓜果实稀刺瘤性状是单基因控制的隐性性状，且命名黄瓜刺瘤密度基因中控制稀刺瘤性状的基因为稀刺基因fs1，控制密刺瘤性状的基因为密刺基因FS1。

实施例2 黄瓜全基因组重测序

采用群体分离分析法（BSA）从F2分离群体中分别随机选取稀刺瘤和密刺瘤个体各20株，建立稀刺瘤黄瓜(fs1 fs1)和密刺瘤黄瓜(FS1_)的基因池。

将构建好的稀刺瘤黄瓜(fs1 fs1)和密刺瘤黄瓜(FS1_)基因池送至上海美吉生物医药科技有限公司进行黄瓜全基因组重测序。

将测序获得的SNP标记与刺瘤密度表型性状进行关联分析，将控制黄瓜稀刺表型的稀刺基因fs1定位到了6号染色体的长臂末端。

实施例3 分子标记的开发

分析黄瓜全基因组重测序得到的SNP标记结果，根据稀刺基因fs1的位置，设计标记引物，用设计的CAPS标记引物和SNP标记引物，对两个亲本进行PCR扩增，并使用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测（所述1.2%琼脂糖凝胶是指100 ml的TBE缓冲液中含有1.2 g琼脂糖粉）。

从设计的CAPS标记和SNP标记中筛选出以下6种标记对两个亲本间进行PCR扩增，其扩增引物、限制性内切酶以及扩增片段的结果见表1。

表1 6种分子标记的标记引物序列及扩增片段结果

实施例4 交换单株的筛选及与稀刺基因fs1连锁的分子标记的获得

（1）提取黄瓜基因组DNA

采用TPS法提取亲本及其F2代分离群体植株的叶片基因组DNA。

具体方法为：取黄瓜嫩叶（约1 cm2）于1.5 ml EP管中，加入两粒钢珠，采用液氮冷冻，在振荡器中剧烈震荡1-2 min，直至材料被研磨至粉碎，然后在每管中加入500 μl TPS；将粉碎的样品75℃温浴20 min；12000 rpm离心10 min，将上清液小心的转入另一支新的EP管中；加入等体积的异丙醇，上下吸打混匀，放置5-10 min，以沉淀DNA；12000 rpm，离心5 min，除去上清，小心不要把DNA倒出；沉淀用体积比浓度为75%的乙醇洗两次，12000 rpm离心1 min；倒掉上清液，晾干DNA，用ddH2O溶解，在-20℃保存备用。

（2）用实施例3所提供的6中分子标记扫描F2分离群体，即通过所述6个分子标记对稀刺基因fs1进行精细定位。

具体操作步骤如下：

以实施例1所述的两个亲本配制了杂交组合，得到F1果实的刺瘤密度介于两亲本之间，F1代自交产生F2代群体，从F2自交群体中随机筛选了5400棵F2分离群体作为精细定位群体。

首先，利用分子标记CAPS1和分子标记MM2扫描5400棵F2分离群体，筛选这两个标记间发生交换的单株，并且对交换单株进行表型观察分析，确定其果实刺瘤密度。

然后，同样再利用CAPS2、CAPS3、MM1、MM3筛选交换单株，缩小定位区间。其定位结果见图5，图5中数字代表交换个体的个数，从图中可以看出分子标记MM1（SNP分子标记）和分子标记MM2（CAPS分子标记）是两个与fs1基因位点连锁非常紧密的标记，稀刺基因fs1在这两个分子标记之间，物理距离为110 kb左右；且在分子标记MM1和分子标记MM2之间获得了一个与黄瓜稀刺基因fs1完全连锁的分子标记MM3。

其分子标记MM1的PCR扩增及筛选F2代交换单株的结果见图1，图中9930为密刺瘤母本；山农CNS5为稀刺瘤亲本。

其分子标记MM2的PCR扩增及进一步筛选F2代交换单株的结果见图2，其中9930为密刺瘤亲本；山农CNS5为稀刺瘤亲本；F1代表两亲本杂交一代；F2随机植株代表在F2代交换单株的群体中随机挑选的11个密刺瘤或稀刺瘤植株的PCR扩增结果，其分子量大小为739bp的条带代表与稀刺瘤基因FS1紧密连锁，下面517 bp和222 bp的两条带代表与密刺瘤基因FS1紧密连锁，即得到SEQ ID NO: 5所述的核苷酸序列与密刺瘤基因FS1紧密连锁，SEQ ID NO: 6所述的核苷酸序列与稀刺瘤基因fs1紧密连锁。

其分子标记MM3对亲本及F2代交换单株筛选的PCR扩增结果见图3，图3中9930为密刺瘤亲本；山农CNS5为稀刺瘤亲本；由于筛选到的交换单株为0株，所以其扩增的1475bp的条带代表与密刺瘤基因FS1完全连锁，2277bp的条带代表与稀刺瘤基因fs1完全连锁，即得到SEQ ID NO: 9所述的核苷酸序列与密刺瘤基因FS1紧密连锁，SEQ ID NO: 10所述的核苷酸序列与稀刺瘤基因fs1紧密连锁。

在此过程中所涉及的：

PCR体系均为：基因组DNA 50 ng、上、下引物均为10 μmol/L、200 μmol/L dNTPs、1×EasyTaq Buffer缓冲液、1.5 U EasyTaq DNA聚合酶，总反应体系为10 μL，其各物质的浓度为终浓度，其中EastTaq DNA聚合酶购于北京全式金生物技术（TransGen Biotech）有限公司；其上、下游引物如表1中所示。

PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸1 min；35个循环，72℃后延伸10 min。

CAPS分子标记所用的酶切体系为：PCR产物1-2 μl，FastDigest? 限制酶 0.3 μl，10×FastDigest? 缓冲液1 μl，ddH2O 7-8 μl，总反应体系为10 μL，其中FastDigest? 限制酶购于Fermentas公司。

酶切程序：37℃保温30 min。

扩增产物电泳分离均使用1.2％琼脂糖凝胶电泳显示结果。

实施例5 多态性片段的回收、克隆和测序

对于分子标记MM1，需要通过测序来确定SNP位点碱基。用所述MM1的上游引物（见SEQ ID NO: 3）和下游引物（见SEQ ID NO: 4）对从所述两个亲本提取的模板DNA进行PCR扩增，PCR 反应体系为：DNA 1 μl，上、下游引物各10 μmol/L，200 μmol/L dNTPs，1×EasyTaq Buffer，1.5U EasyTaq DNA聚合酶，总反应体系为25 ul，其中EasyTaq DNA聚合酶购于北京全式金生物技术（TransGen Biotech）有限公司。目标条带PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸1 min；35个循环，72℃后延伸10 min；吸取5 μl PCR产物于一新PCR管中，加入Loading Buffer 3 μl，混匀后通过1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，每个亲本确定只有一条490 bp的目的条带；将剩余的20 μl PCR产物直接送样测序。其测序得到SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的两个序列，同时，根据所得序列对应的亲本的刺瘤密度性状，得到SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列与密刺瘤基因FS1紧密连锁，SEQ ID NO: 2所述的核苷酸序列与稀刺瘤基因fs1紧密连锁。

实施例6 与黄瓜稀刺瘤/密刺瘤品系完全连锁的分子标记的应用

（1）收集了现有不同地域代表性黄瓜稀、密刺瘤品系，见表2。

表2不同地域代表性的黄瓜稀、密刺瘤品系

（2）对所述24个不同品系提取DNA

采用CTAB法提取每株叶片DNA：称取200 mg 新鲜的叶片，置于1.5 ml离心管中（管中加钢珠），在液氮中预冷，使用MM301细胞破碎仪研磨1 min，研磨频率30 Hz，研磨成粉末状。加入800 μL CTAB提取液（预热70℃），轻轻混匀（﹤15℃的CTAB析出）；混匀后置于65℃水浴锅中水浴30 min，每10 min上下左右颠倒混匀；在4℃条件下12000 rpm离心5min；冰浴，吸上清，加等体积氯仿/异戊醇混匀，4℃条件下10000 rpm离心10 min；冰浴，取上清，加等体积苯酚/氯仿/异戊醇混匀，4℃条件下12000 rpm离心10 min；冰浴，吸上清，加等体积氯仿/异戊醇混匀，4℃条件下10000 rpm离心10 min；冰上吸上清加2倍体积的预冷乙醇、1/10体积NaAc，-20℃静置1小时；4℃条件下12000 rpm离心15 min，70％乙醇洗沉淀2～3次，室温干燥30 min，溶于ddH2O（50～100 μL）中。琼脂糖凝胶进行检测；用NANODROP 2000微量紫外分光光度计测定提取DNA 的浓度和纯度，将DNA稀释到所需浓度，置于-20℃保存备用。

（3）用分子标记MM3快速鉴定现有不同地域代表性黄瓜品系的刺瘤稀密性状

用分子标记MM3的标记引物对所述品系的DNA进行PCR扩增，PCR体系为：基因组DNA 50 ng，上、下游引物各10 μmol/L，200 μmol/L dNTPs，1×EasyTaq Buffer缓冲液，1.5 U EasyTaqDNA聚合酶，总反应体系为10 μL，其中EastTaqDNA聚合酶购于北京全式金生物技术（TransGen Biotech）有限公司；所述分子标记MM3的标记引物为SEQ ID NO: 11所示的上游引物和SEQ ID NO: 12所示的下游引物。

PCR扩增程序为：94℃预变性2 min；35个循环：94℃变形30s；58℃退火30 s；72℃延伸2 min 30 s；72℃后延伸10 min，使用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，其结果见图4。由图4中的分子标记检测结果与表2的表型形状关联分析可知，分子标记MM3可非常精准地鉴定所检测黄瓜品系含有的刺瘤密度基因（密刺瘤基因FS1或稀刺瘤基因fs1），进而快速、准确地判断出该品种的刺瘤稀密性状。

以上三个新开发的分子标记经过分离群体验证，均与黄瓜果实稀刺瘤基因fs1位点紧密连锁(参见图5，图中数字表示交换单株的数目)。由于都是特异性PCR扩增，故这些标记具有高度的稳定性。利用这些标记构建的高密度遗传和物理图谱，不但可以用于稀、密刺瘤黄瓜的分子标记辅助育种，而且也将有助于黄瓜稀刺瘤基因fs1的最终克隆。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种快速鉴定不同黄瓜品系刺瘤稀密的分子标记及鉴定方法

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aaaacctcaa gattgaccat acccagtcaa attggggaat tcctagcctt gatccagtca 240

ggggccacta aacaaagcaa aaactaacct tatgcttgtg taaaaaacac tctatcttca 300

atatttttct acacttcacc acaacatttt tcttatgctt gtaatttttg caggaagcaa 360

gagaggcaaa ggcaaaacta ctgctatcat agtcataata gtgtcaattc tttcaatcgt 420

cattctttct attgctattt acttcgtctt gctaatgaaa agacgaaaaa aaataccatc 480

tgatgaaatt caaagtaagc ctcgatatat atattatatt cttgacaaaa atataataaa 540

taataaactg agcctggata tatatatgtg tgtgtgtgta attgaagtat ttgttattga 600

tttagtccct taaattgatt gaggtttcaa tttttaagtt gaatatgtaa acagttaaag 660

gtattgcctt ccaagaagca acaagtgaaa ttagcaacgt ggaggcaatt caatttgatt 720

tcgagacgat caaagtagc 739

<210> 6

<211> 739

<212> DNA

<213> 分子标记MM2

<400> 6

aggggtggtt gtgttttgcg atatgagaat tatatattct ttaaaccgac tgctaatgcc 60

tctccctcct catcgcctct accagggcca actcccggta ctccatttct aacttaacct 120

ccactttcat ataaggccaa ttataaattt ctcggtaagg gtcaaggacc agatttaatt 180

aaaacctcaa gattgaccat acccagtcaa attggggaat tactagcctt gatccagtca 240