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酵母菌株及其使用方法
    技术领域 本发明涉及酵母菌株， 特别是用于发酵工艺的酵母菌株。本发明还涉及用本发明 所述的酵母菌株单独或结合其他菌株进行发酵的方法。 本发明进一步涉及通过筛选多种代 谢产物以及使用特定营养源来挑选适于发酵培养物的酵母菌株的方法。
     本发明的开发主要用于葡萄汁的发酵以及果酒酿制方法， 下文会参照本申请进行 说明。然而， 本发明并不限于该特定的使用领域， 也可用于其它发酵工艺。
     背景技术 说明书全文对于现有技术的任何讨论， 都不应被认为是承认所述现有技术广为人 知或构成了本领域公知常识的一部分。
     发酵是一种工艺， 所述工艺中， 酵母将水果或蔬菜中的单糖主要代谢为乙醇和二 氧化碳。 该工艺与很多食品 ( 如面包、 啤酒、 果酒、 烈酒、 表面成熟奶酪和醋 ) 以及生物燃料、 维生素和酶的生产相关。
     果酒是部分由酵母对葡萄汁进行酒精发酵制成的产物。 发酵工艺中存在的酵母菌 株将葡萄汁碳水化合物代谢为乙醇和二氧化碳。然而， 这些成分对果酒的整体风味影响甚 微。 果酒的香气和风味特征来自于大量化合物， 包括挥发性酸和羰基化合物， 作为在发酵工
     艺中由酵母生成的化合物， 其中有 400 种已经被鉴定 (
     1986)。发酵可自发进行， 其中， 天然存在的微生物组进行所述发酵 ； 或者， 酿酒商也可人 为地将已知的、 可商购的果酒酵母的大量培养物接种到葡萄汁中。用于接种葡萄汁的酵母 主要为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 的各种菌株。
     自发的果酒发酵的起始阶段通常与非酿酒酵母 (non-Saccharomyces) 的生长相 关， 所述酵母显示出低的发酵能力， 且在低乙醇环境下生长旺盛。这些酵母包括有孢汉生 酵母 (Hanseniaspora)( 克勒克酵母属 (Kloeckera)) 和假丝酵母 (Candida)( 如星形假 丝酵母 (Candida stellata) 和铁红假丝酵母 (Candida pulcherrima))(Heard 和 Fleet， 1986) 以及其它种的酵母。在自发的情况下， 发酵与多种酵母属和酵母种的顺序相互作用 (sequential interaction) 相关 (Heard 和 Fleet， 1988)。
     非酿酒酵母的酵母对乙醇含量超过 5％的环境的敏感性意味着它们只能在果酒发 酵最初的 2-3 天内生长， 随后， 乙醇耐受的酿酒酵母占据优势地位。重要地， 由于非酿酒酵 6 7 母菌株的种群数量能达到 10 -10 个细胞 /ml， 其能显著影响发酵 (Lema 等， 1996)。所述影 响包括由于多种挥发性及非挥发性产物 ( 如有机酸、 高级醇和酯 ) 的生成对果酒的风味和 香气特征的实质性影响 (Rapp 和 Versini， 1991 ； Esteve-Zarzoso 等， 1998)。这些 “风味化 合物” 的性质和浓度由发酵中存在的酵母属和酵母种决定 (Houtman 等， 1980 ； Lambrechts 和 Pretorius， 2000 ； Brandolini 等， 2002 ； Ramano 等， 2003)。 考察非酿酒酵母种对果酒风味 和香气影响的工作日益增多 (Esteve-Zarzoso 等， 1998)。其中一些工作显示混合种的发酵 物 (ferment) 能够出乎意料地产生高水平的某些风味 - 活性化合物， 如酯类 (Garde-Cerdan 和 Ancin-Azpilicueta， 2006 ； Rojas 等， 2003) 和 2， 3- 丁二醇 (Clemente-Jiminez 等， 2004)等。 挥发性硫醇是果酒中发现的一个风味化合物家族 (Gachons 等， 2000)， 其包括 4- 巯基 -4- 甲基 -2- 戊酮 (4MMP)、 4- 巯基 -4- 甲基 -2- 戊醇 (4MMPOH)、 3- 巯基 -1- 己醇 (3MH) 和 3- 巯基己基乙酸酯 (3MHA)。其中一些硫醇， 如 3MH 和 3MHA， 具有独特的类似葡萄 柚和西番莲果的香气和风味 (Tominaga 等， 1998a)。
     常常发现 3MH 和 3MHA 以高于人类感觉阈限的浓度存在于白苏维翁 (Sauvignon Blanc， SB) 酒中。 在 SB 葡萄汁之中， 发现了一种结合半胱氨酸的、 非挥发性的、 无风味的 3MH 前体， 硫 -(3- 己烯 -1- 醇 )- 半胱氨酸， 发酵中， 该前体可能被切割而释放出 3MH， 3MH 随后 转化为 3MHA(Gachons 等， 2000)。处理所述前体所需的酶被认为是来自于酵母， 而转化需要 活性酵母生长 (Tominaga 等， 1998b)。相关的酶可能分别是 β- 裂解酶和乙酰转移酶的某 种形式。某出版物暗示有多个酵母基因编码的 β- 裂解酶 (Howell 等， 2005)。然而， 两个 实验室的科学家， 包括本发明人等无法重复其实验结果。迄今为止， 我们认为， 在酵母释放 硫醇时起作用的前体、 酶或通路方面还没有强有力的数据发表。
     Chr Hansen( 科 - 汉 森 )( 丹 麦 ) 制 造 了 四 种 可 商 购 的 酵 母 发 酵 剂 (yeast starter culture)， 所 述 发 酵 剂 包 括 不 同 酵 母 种 的 混 合 物， 称 为 Harmony、 Symphony、 Rhythm 及 Melody。所述混合物中的酵母种是酿酒酵母、 德尔布有孢圆酵母 (Torulaspora delbrueckii) 和耐热克鲁维酵母 (Kluyveromyces thermotolerans)。已有报道表明这些 混合物可制造具有改变的风味概况 (profile) 的果酒， 但其并未暗示所述风味概况与硫醇 的存在、 混合或浓度相关。
     目前还没有研究检测非酿酒酵母种对果酒中挥发性硫醇水平的影响或酵母种的 混合物对硫醇产量或果酒风味的影响。 我们了解仅有一项检测酿酒酵母种对果酒中挥发性 硫醇水平影响的研究。 所述研究涉及果酒中酿酒酵母生产的 4MMP 的测定 (Howell 等 2004)。
     急需了解发酵工艺中控制化合物存在及含量的生物工艺。具体地说， 对酿酒商而 言， 能调节果酒中的硫醇含量及种类十分有用。
     调节果酒中的硫醇含量， 特别是 3MH 和 3MHA 的含量， 能够带动新工艺的发展， 使得 酿酒商能够更精确地改变其产品中这些独特的风味化合物的含量。因此， 所述工艺将具有 重大的商业价值。
     本发明的一个目的是克服或改善现有技术的至少一个缺陷， 或提供一种有用的备 选方案。
     发明内容 已意外地发现特定酵母菌株具备在发酵工艺中有用的有利性质。具体地说， 所述 酵母菌株在发酵工艺中可与其它酵母联合产生协同效应， 即增加发酵产物中硫醇的产量。 更具体地说， 所述酵母能用于提高果酒中 3MH 和 3MHA 的产量。此外， 在发酵工艺中提高硫 醇产量的特定新菌株能利用发酵中该种的酵母通常无法利用的氮源和碳源， 即脯氨酸。
     本 发 明 人 等 意 外 地 发 现， 如 称 作 PK-KR1 及 PK-KR2( 克 鲁 维 毕 赤 酵 母 (Pichia kluyveri) 的两种新菌株 ) 与可商购的酵母菌株协同作用， 提高了果酒发酵培养物中挥发 性硫醇的水平。 在发酵中， 酵母可利用的氮含量相对有限， 会严重影响发酵进程及酵母生成 的副产物。进一步意外地发现， 特定酵母菌株能够利用发酵培养物中商业化的酿酒酵母制
     品所无法利用的营养源。举例来说， 相比于酿酒酵母， 所述 PK-KR1 菌株更倾向于利用 L- 脯 氨酸作为氮源和碳源。 脯氨酸是葡萄汁中最丰富的氨基酸之一， 但酿酒酵母却无法利用。 因 此， PK-PR1 的使用不仅可以出人意料地改变果酒最终的风味和香气， 还可以减轻发酵工艺 中 PK-KR1 与商业化的酿酒酵母制品对相对有限的营养素 ( 氮 ) 的竞争。
     如上所述， 本发明涉及酵母菌株、 酵母发酵的发酵剂及发酵方法， 其使得硫醇产量 的提高及新型营养素的利用成为可能。
     相应地， 就第一方面而言， 本发明提供了一种分离的酵母菌株， 该菌株保藏于 澳 大 利 亚 国 家 计 量 院 (National Measurement Institute)， 保 藏 号 为 V06/022711 或 V06/022712 或本文定义的其功能等同物。所述分离株的保藏名称对于 PK-KR1 为 JT1.28， 对于 PK-KR2 为 JT3.71。
     就第二方面而言， 本发明提供了一种分离的酵母菌株， 所述菌株包括核核糖体内 转录间隔区 (internal transcribed spacer(ITS))1-5.8S-ITS2 的核苷酸序列， 所述核苷 酸序列如序列编号 5 或序列编号 6 的任一序列所示。
     就第三方面而言， 本发明提供了一种分离的酵母菌株， 所述菌株包括 26S rDNA 变 异区 (divergent domain)1 和变异区 2(D1/D2) 的核苷酸序列， 所述核苷酸序列如序列编号 7 或序列编号 8 所示。 就第四方面而言， 本发明提供了一种发酵方法， 所述方法包括使用所述第一、 第二 或第三方面中的酵母菌株。
     本发明的酵母菌株可在发酵工艺中与一种或多种其它酵母菌株一起使用， 以协同 增加硫醇的产量。
     就第五方面而言， 本发明提供了一种发酵方法， 所述方法包括使用第二酵母菌株 以及所述第一、 第二或第三方面中的第一酵母菌株， 其中， 所述方法包括下述步骤 ： 将所述 第一酵母菌株和所述第二酵母菌株加入发酵培养物中， 从而引起由所述方法产生的发酵产 物中硫醇产量的协同增加。
     优选地， 所述发酵产物是酒精饮料。更优选地， 所述酒精饮料是果酒。最优选地， 所述果酒是白葡萄酒。在一个特别优选的实施方式中， 所述白葡萄酒由品种为白苏维翁的 葡萄制成。
     优选地， 其中一种酵母菌株为非酿酒酵母菌株。更优选地， 所述非酿酒酵母菌株 属于毕赤酵母属， 更优选所述非酿酒酵母菌株是克鲁维毕赤酵母菌种中的成员。在一个特 别优选的实施方式中， 所述非酿酒酵母的酵母菌株保藏于澳大利亚国家计量院， 保藏号为 V06/022711 或 V06/022712 或其功能等同物。
     优选地， 其中一种酵母菌株为酿酒酵母菌株。 更优选地， 所述酿酒酵母菌株选自本 文所述的、 通常可得的 VL3、 VIN 7、 X5 或 “Merit” 。
     本领域技术人员很清楚所述硫醇可以是任意硫醇或任意硫醇的组合。 所述硫醇优 选为挥发性的。在一个优选的实施方式中， 所述硫醇是 3- 巯基己基乙酸酯 (3MHA)， 在另一 个优选的实施方式中， 所述硫醇是 3- 巯基 -1- 己醇 (3MH)。
     本领域技术人员同样很清楚所述第一酵母菌株和所述第二酵母菌株可以同时或 相继加入发酵物中。
     就第六方面而言， 本发明提供了一种发酵酵母发酵剂， 所述发酵剂包括使发酵产
     物中的硫醇协同增加的至少两种酵母菌株。
     优选地， 其中一种酵母菌株是非酿酒酵母菌株。
     在一个实施方式中， 所述非酿酒酵母菌株占存在于发酵剂中总酵母浓度的比例超 过 10％。 优选地， 存在于发酵剂中总酵母浓度为 2.5×106 细胞 ml-1。 在另一个实施方式中， 所述非酿酒酵母菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 20％。在另一个实施方式中， 所 述非酿酒酵母菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 30％。在另一个实施方式中， 所述 非酿酒酵母菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 40％。在另一个实施方式中， 所述非 酿酒酵母菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 50％。在另一个实施方式中， 所述非酿 酒酵母菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 60％。在另一个实施方式中， 所述非酿酒 酵母菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 70％。在另一个实施方式中， 所述非酿酒酵 母菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 80％。在另一个实施方式中， 所述非酿酒酵母 菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例约为 90％。在另一个实施方式中， 所述非酿酒酵母菌 株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 90％。
     在 另 一 个 实 施 方 式 中， 发 酵 剂 中 存 在 的 总 酵 母 浓 度 超 过 2.5×106 细 胞 ml-1。 优 选 地， 所 述 非 酿 酒 酵 母 菌 株 保 藏 于 澳 大 利 亚 国 家 计 量 院， 保 藏 号 为 V06/022711 或 V06/022712。 在一个实施方式中， 发酵产物中协同增加的硫醇是 3MHA， 而在另一个可选择的 实施方式中， 发酵产物中协同增加的硫醇是 3MH。 本领域技术人员当然很清楚可以有多于一 种硫醇的协同增加。 就第七方面而言， 本发明提供了一种制备发酵产物的方法， 所述方法包括使用本 发明的发酵剂， 其中， 所述方法包括将所述发酵剂加入发酵培养物的步骤。优选地， 所述发 酵产物为酒精饮料， 最优选地， 所述酒精饮料是果酒。
     就第八方面而言， 本发明提供了一种依照本发明的方法制备的饮料。 优选地， 所述 饮料是酒精饮料， 更优选地， 所述饮料是果酒。最优选地， 所述果酒是白葡萄酒。在一个特 别优选的实施方式中， 所述白葡萄酒由品种为白苏维翁的葡萄制成。
     同样出人意料地发现， 新型酵母分离株， 例如 PK-KR1， 能够利用发酵培养物中的新 型氮源和碳源。
     就第九方面而言， 本发明提供了一种包括使用酵母菌株的发酵方法， 其中， 所述方 法包括将所述酵母菌株加入发酵培养物中的步骤， 所述酵母菌株在发酵条件下能从氨基酸 中获得氮和 / 或碳。优选地， 所述氨基酸是脯氨酸。
     就第十方面而言， 本发明提供了一种包括将脯氨酸加入发酵培养物中的步骤的发 酵方法， 其中， 所述脯氨酸在所述发酵培养物中是酵母菌株的氮源和 / 或碳源。
     就第十一方面而言， 本发明提供了一种包括使用两种酵母菌株的发酵方法， 其中， 所述方法包括将所述菌株加入发酵培养物中的步骤， 所述菌株的每一种均能从不同的来源 获得氮和 / 或碳。
     就第十二方面而言， 本发明提供了一种为发酵培养物挑选酵母的方法， 所述方法 包括将酵母菌株加入含有作为其几乎唯一氮源的脯氨酸的发酵培养物中以及从所述培养 物中分离出能从脯氨酸中获得氮的酵母菌株的步骤。
     就第十三方面而言， 本发明提供了一种包括使用酵母菌株的发酵方法， 所述方法 包括将所述酵母菌株加入发酵培养物的步骤， 其中， 所述酵母菌株不以葡萄糖或果糖作为
     其唯一或几乎唯一的碳源。
     就第十四方面而言， 本发明提供了一种增强发酵产物风味的方法， 所述方法包括 在发酵培养物中使用如权利要求 1-3 中任一项所述的酵母菌株或如权利要求 13-20 中任一 项所述的酵母发酵剂， 所述方法包括将所述酵母菌株或所述发酵剂加入发酵培养物中的步 骤。
     在本发明的上下文中， 只要是术语 “其功能等同物” ， 均涉及本申请所说明或定义 的酵母菌株的功能等同物， 在一个实施方式中， 它指的是所述酵母菌株与至少一种其它酵 母菌株相互作用以协同增加发酵产物中硫醇含量的能力。在另一个可选实施方式中， 术语 “其功能等同物” 指的是能利用发酵培养物中该种的酵母通常无法利用的氮源和碳源的酵 母菌株。
     在本发明的上下文中， 只要是 “协同增加” ， 均涉及发酵产物中硫醇的含量， 它指的 是由两种酵母菌株产生的发酵产物中硫醇含量的增加， 所述硫醇含量大于任一种的酵母菌 株单独在发酵产物中产生的硫醇含量的总和。
     在本发明的上下文中， 术语 “发酵产物” 包括发酵工艺中的任何产物， 包括固体、 液 体或气体产物。 在本发明的上下文中， 只要是术语 “菌株” 涉及酵母， 它指的是种内潜在的遗传性 变体或亚型 ； 例如， 从特定地点及时采集的菌种分离株， 或确证在核苷酸水平上与同种其他 成员不一致的分离株。
     在本发明的上下文中， 术语 “发酵” 指的是酵母将水果或蔬菜中的单糖主要代谢为 乙醇和二氧化碳的工艺。
     在本发明的上下文中， 术语 “包含” 、 “包括” 等应解释为其包含的含义， 即 “包括但 不限于” ， 而不是其排他的含义。
     附图说明 图1： PK-KR1 的 26S 核糖体基因的 D1/D2 区与模式菌株 (type strain) 克鲁维毕 赤酵母的核苷酸序列同源性比对。
     上部序列＝克鲁维毕赤酵母模式菌株 (CBS188)， 登录号 U75727
     下部序列＝ PK-KR1
     图2： PK-KR1 的 ITS 区与模式菌株克鲁维毕赤酵母同一区域的核苷酸序列同源性 比对。
     上部序列＝克鲁维毕赤酵母模式菌株 (CBS188)， 登录号 DQ104711
     下部序列＝ PK-KR1
     图3： PK-KR2 的 26S 核糖体基因的 D1/D2 区与模式菌株克鲁维毕赤酵母同一区域 的核苷酸序列同源性比对。
     上部序列＝克鲁维毕赤酵母模式菌株 (CBS188)， 登录号 U75727
     下部序列＝ PK-KR2
     图4： PK-KR2 的 ITS 区与模式菌株克鲁维毕赤酵母同一区域的核苷酸序列同源性 比对。
     上部序列＝克鲁维毕赤酵母模式菌株 (CBS188)， 登录号 DQ104711
     下部序列＝ PK-KR2
     图5 ： 显示含有酵母菌株 VL3 和 PK-KR1 的单一发酵物和混合发酵物中产生的 3MHA 浓度的柱状图， 所述酵母菌株 VL3 和 PK-KR1 的混合比例为 10 ∶ 90、 50 ∶ 50 及 90 ∶ 10。
     图6 ： 显示含有酵母菌株 VL3 和 PK-KR2 的单一发酵物和混合发酵物中产生的 3MHA 浓度的柱状图， 所述酵母菌株 VL3 和 PK-KR2 的混合比例为 10 ∶ 90、 50 ∶ 50 及 90 ∶ 10。
     图7： 显示含有酵母菌株 VL3 和 PK-KR1 的单一发酵物和混合发酵物中产生的 3MH 浓度的柱状图， 所述酵母菌株 VL3 和 PK-KR1 的混合比例为 10 ∶ 90、 50 ∶ 50 及 90 ∶ 10。
     图8： 显示含有酵母菌株 VL3 和 PK-KR2 的单一发酵物和混合发酵物中产生的 3MH 浓度的柱状图， 所述酵母菌株 VL3 和 PK-KR2 的混合比例为 10 ∶ 90、 50 ∶ 50 及 90 ∶ 10。
     图9： 综 合 图 3 及 图 4 中 的 数 据， 显 示 含 有 酵 母 菌 株 VL3、 PK-KR1 及 PK-KR2 的 单 一 发 酵 物 和 混 合 发 酵 物 中 产 生 的 3MHA 浓 度 的 柱 状 图， 组合如下 ： VL3 ∶ PK-KR1、 VL3 ∶ PK-KR2， 组合比例为 10 ∶ 90、 50 ∶ 50 及 90 ∶ 10。
     图 10 ： 综合图 5 及图 6 中的数据， 显示含有酵母菌株 VL3、 PK-KR1 及 PK-KR2 的单一 发酵物和混合发酵物中产生的 3MH 浓度的柱状图， 组合如下 ： VL3 ∶ PK-KR1、 VL3 ∶ PK-KR2， 组合比例为 10 ∶ 90、 50 ∶ 50 及 90 ∶ 10。
     图 11 ： 显示 PK-KR1 及 VL3 的单一发酵物和混合发酵物中 3MHA 浓度 ( 采用氘代标 准 ) 的柱状图。
     图 12 ： 显示 PK-KR1 及 VL3 的单一发酵物和混合发酵物中 3MH 浓度 ( 采用氘代标 准 ) 的柱状图。
     图 13a ： 显示 PK-KR1 与多种商业化的果酒菌株 VL3、 EC1118、 VIN7、 X5、 QA23 及 SVG 的单一发酵物和混合发酵物 ( 发酵温度 14℃ ) 中产生的 3MHA 浓度的柱状图。
     在 14℃下， 一组商业化的果酒酵母的单一发酵物以及它们与 PK-KR1 的共同发酵 物产生的 3MHA(a) 和 3MH(b) 的含量 ( 平均值 ± 平均值的标准误差 ； n ＝ 3)。所有共同发 酵物均在酿酒酵母∶ PK-KR1 为 10 ∶ 90 时起始。相比于 VL3、 VIN7 及 X5 的单一发酵物各 自的 3MHA 水平， PK-KR1 与 VL3、 VIN7 及 X5 的共同发酵物中 3MHA 的水平均有显著性提高 (P ＜ 0.01)。
     图 13b ： 显示 PK-KR1 与多种商业化的果酒菌株 VL3、 EC1118、 VIN7、 X5、 QA23 及 SVG 的单一发酵物和混合发酵物 ( 发酵温度 14℃ ) 中产生的 3MH 浓度的柱状图。
     图 14 ： 显示在 5 升的体积中， PK-KR1、 PK-KR2 和 VIN7 的混合发酵物 ( 发酵温度 14℃ ) 中产生的 3MHA 及 3MH 浓度的柱状图。3MHA 及 3MH 的水平以 ng l-1 表示 ； 未用相同 字母表示的水平在 t- 检验下具有显著性差异 (P ＞ 0.05)。
     在 5 升的混合发酵物实验中， 3MHA 及 3MH 的水平以 ng l-1 表示 ； 未用相同字母表 示的水平在 t- 检验下具有显著性差异 (P ＞ 0.05)。
     图 15 ： 通过白苏维翁葡萄汁中 VL3 及 PK-KR1 的单一发酵物和共同发酵物的菌落 形成单位估定的细胞数。
     通过在 14℃的条件下， VL3 及 PK-KR1 的单一发酵物 ( 分别为实心三角和实心圆 ) 和共同发酵物 ( 分别为空心三角和空心圆 ) 的菌落形成单位估定的细胞数。所述共同发酵 物以 VL3 ∶ PK-KR1 ＝ 10 ∶ 90 的比例接种。平均值 ± 平均值的标准误差 ； n ＝ 6。
     图 16 ： 单 一 发 酵 和 混 合 发 酵 期 间 营 养 素 的 利 用， 单 一 发 酵 和 混 合 发 酵 期 间，PK-KR1 及 VL3 对 (a) 酵母可用氮 (YAN) 的利用 ； 以及 (b) 葡萄糖和果糖的利用。
     a) 在 14℃的条件下， VL3 单一发酵 ( 实心三角 ) 和共同发酵 ( 空心三角 ) 及 PK-KR1 单一发酵 ( 实心圆 ) 期间， 酵母可用氮 (YAN) 含量的变化。所述共同发酵在 VL3 ∶ PK-KR1 为 10 ∶ 90 时起始。对照 ： 未接种的无菌葡萄汁 ( 空心方块 )。平均值 ± 平均值的标准误 差； n ＝ 3。
     b) 在 14℃的条件下， VL3 单一发酵 ( 实心三角 ) 和共同发酵 ( 空心三角 ) 及 PK-KR1 单一发酵 ( 实心圆 ) 期间， 葡萄糖和果糖总量的变化。所述共同发酵在 VL3 ∶ PK-KR1 为 10 ∶ 90 时起始。对照 ： 未接种的无菌葡萄汁 ( 空心方块 )。平均值 ± 平均值的标准误差 ； n ＝ 3。
     图 17 ： 发酵条件下， PK-KR1 及 VL3 在含有脯氨酸作为唯一氮源的培养基中的生长。
     14℃时， 在发酵条件下， VL3( 三角 ) 及 PK-KR1( 圆 ) 在合成酵母氮源培养基中的 生长， 所述培养基中， 脯氨酸是唯一的氮源。平均值 ± 平均值的标准误差 ； n ＝ 6。
     图 18 ： 经碳和氮饥饿后， 在发酵条件下， PK-KR1 在含有脯氨酸作为唯一氮源的培 养基中的生长。
     PK-KR1( 经碳和氮饥饿 ) 在单独的 YNB( 即无碳源及氮源补给 ) 和加入有脯氨酸的 相同培养基中的生长。 具体实施方式 本发明涉及酵母菌株， 特别是用于发酵工艺的酵母菌株。
     本发明还涉及酵母菌株 PK-KR1 和 PK-KR2， 所述菌株保藏名称分别为 JT1.28 和 JT 3.71， 保藏于澳大利亚国家计量院 ( 克拉尔克大街 51-65， 南墨尔本， VIC 3205)， 保藏号分 别为 V06/022711 和 V06/022712。
     例如， 产于新西兰南岛马尔堡区的白苏维翁酒具有非常独特的风味概况。这一独 特的风格使得该果酒在国际果酒市场上占据重要的地位。相应地， 与加强这些果酒的香气 和 / 或风味相关的酵母也极具商业价值。
     本发明还涉及用酵母菌株单独或结合其他菌株进行发酵的方法。
     本发明进一步涉及筛选和分离适于发酵培养物的酵母菌株、 特别是加强果酒的一 种或多种特征 ( 如风味和 / 或香气 ) 的酵母的方法。
     优选地， 所述筛选方法包括在一种或多种发酵培养物或培养基中接种一种或多种 酵母菌株。 优选地， 所述培养物或培养基含有几乎单一的预先选定的碳源和 / 或氮源。 优选 地， 所述碳源和 / 或氮源为脯氨酸。所述方法进一步包括在适合酵母生长的温度下， 孵育所 述经接种的发酵物或培养物， 并在一段时间内监测酵母的生长。所述方法进一步包括鉴定 和分离一种或多种能利用几乎单一的预先选定的碳源和 / 或氮源作为营养源的酵母菌株。
     通常情况下， 对酵母而言， 葡萄汁中的氮是有限的必需资源， 较低的氮水平会减缓 酵母生长及发酵， 很可能导致发酵出现问题 ( 如发酵停滞 )(Ribereau-Gayon 等 2006)。对 于存在于葡萄汁中的氮源， 酵母首先利用的是氨， 然后是氨基酸。 脯氨酸通常是葡萄汁中最 丰富的氨基酸之一 (Ough 和 Stashak 1974 ； Spayd 和 Andersen-Bagge 1996)。 然而， 酿酒酵 母在厌氧条件下无法利用脯氨酸 ( 处于酿酒酵母降解通路的 PutI 酶需要 O2， Ingledew 等 1987)。在这点上， 酿酒酵母在发酵中无法利用重要的氮源， 如果酵母可以通过某些方式利
     用脯氨酸作为氮源和 / 或碳源， 就能够减少发酵中产生的问题， 如酿酒商便无需人为添加 氮源。此外， 从非酿酒酵母共同发酵的角度看， 不会直接竞争有限的氮源 ( 例如， 通过利用 脯氨酸 ) 共同发酵的酵母在商业应用中是十分理想的， 因为这不仅减少了与酿酒酵母的竞 争， 同时也释放出隐藏于脯氨酸中的氮以供酿酒酵母随后利用。
     相应地， 本发明进一步涉及能利用发酵培养物中的新型氮源和 / 或碳源的酵母菌 株。
     本发明进一步由以下非限制性的实施例进行说明。
     实施例
     实施例 1 酵母分离
     称为 PK-KR1 和 PK-KR2 的两种酵母菌株是按照以下记载从奥克兰西区的库妙河果 酒公司 (Kumeu River Wines) 的 Mate 葡萄园得到的 2005 霞多丽 (Chardonnay) 葡萄汁的 天然发酵物中分离而得。图 1- 图 16 显示了用所述菌株所做实验的实验数据， 并在以下详 细说明。
     在发酵工艺的不同时期采集葡萄汁样品， 并将其接种至经酸化的麦芽培养基以挑 选酵母和抗细菌 (Johnson 等， 2004)。采用本领域众所周知的方案， 用 Chelex-100 螯合 树脂从分离的酵母样菌落中提取 DNA(Walsh 等 1991)。采用本领域众所周知的方法， 用聚 合酶链式反应， 使用对真菌特异的引物扩增每种菌株的核核糖体内转录间隔区 (internal transcribed spacer(ITS))1、 5.8S、 ITS2 及 26S 变异区 1 和变异区 2(D1/D2)(White 等， 1990， Kurtzman 和 Robnett 1998))。本领域技术人员应当了解通常对所述酵母基因组的 这些区域进行分析以在种的水平上鉴定生物 (Leaw 等 2006 ； White 等， 1990 ； Kurtzman 和 Robnett 1998)。具体地， 用序列编号 1 和序列编号 2 表示的引物扩增核核糖体内转录间隔 区 (internal transcribed spacer(ITS))1、 5.8S 及 ITS2， 用序列编号 3 和序列编号 4 表示 的引物扩增 26S 变异区 1 和变异区 2(D1/D2)。用本领域中众所周知的方法对所得 DNA 产物 的两条链都进行测序。酵母 PK-KR1 和 PK-KR2 的 ITS1-5.8S-ITS2 的 DNA 序列分别表示为 序列编号 5 和序列编号 6。酵母 PK-KR1 和 PK-KR2 的 26S D1/D2 的 DNA 序列分别表示为序 列编号 7 和序列编号 8。
     用标准 BLAST 搜索工具 ( 可在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ 上获得 ) 对 来自所述菌株的 ITS1-5.8S-ITS2DNA 和 26S D1/D2 序列进行分析 ( 依照 Kurtzman & Fell， (2006))。相关的序列同源性比对分析如图 1-4 所示。如下所述， 分析表明分离的酵母是克 鲁维毕赤酵母的新型菌株。
     PK-KR1
     PK-KR1 ITS 区的比对显示出与 DQ674358( 发酵毕赤酵母 (Pichia fermentans)) 和 DQ104711( 克鲁维毕赤酵母 ) 具有 99％的同一性
     PK-KR1 26S 区的比对显示出与 EF564382.1( 克鲁维毕赤酵母 ) 具有 100％的同一 性
     上述指出的 PK-KR1 序列也与克鲁维毕赤酵母 U75727 和 DQ104711 的相应序列进 行了比对。比对结果分别如图 1 和图 2 所示。
     PK-KR2
     PK-KR2 ITS 区的比对显示出与 AY027508.1/DQ104711.1( 发酵毕赤酵母 / 克鲁维毕赤酵母 ) 具有 98％的同一性
     PK-KR2 26S 区的比对显示出与 AJ746339.1( 克鲁维毕赤酵母 ) 具有 99％的同一 性
     上述指出的 PK-KR2 序列也与克鲁维毕赤酵母 U75727 和 DQ104711 的相应序列进 行了比对。比对结果如图 3 和图 4 所示。
     结论 ： PK-KR1 和 PK-KR2 是两种不同的新型克鲁维毕赤酵母菌株。
     鉴定物 最优匹配种
     PK-KR1 克鲁维毕赤酵母
     PK-KR2 克鲁维毕赤酵母
     实施例 2 分离的酵母在单一培养物和混合培养物中的微发酵
     用实施例 1 中制备的酵母分离株及 Zymaflore VL3(Laffort) 酵母菌株进行发酵。 VL3 是一种可商购的酿酒酵母菌株， 在波尔多 (Bordeaux) 分离得到并出售专门用于果酒发 酵。
     用 200mL 无菌 2005 白苏维翁葡萄汁 ( 产自马尔堡的拉保拉 (Rapaura)) 进行发 酵。首先用 DMDC( 焦碳酸二甲酯， C4H6O5， MW ： 134.09gmol-1， CAS ： 4525-33-1) 对葡萄汁进行 灭菌。 如下表 1 所示， 用单一菌株及多种成对比例的菌株进行发酵。对葡萄汁进行接种 前， 在标准酵母实验室培养基中于 28℃对各酵母种进行 48h 的培养。 与果酒产业协定一致， 6 -1 以 2.5×10 酵母细胞 mL 的起始浓度对葡萄汁进行接种。所记载的接种以百分比表示， 即 6 -1 100％对应于 2.5×10 酵母细胞 mL 。
     研究了两组独立的发酵物， 设计第一组发酵物用于研究混合种发酵物对硫醇浓度 的影响。上述发酵物中使用的酵母比例总结于表 1 中。
     表1： 混合发酵物酵母接种比例 ( 相对于 2.5×106 细胞 ml-1 的百分比 )
     商业化的酵母菌株 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3
     接种量 10％ 50％ 90％ 10％ 50％ 90％酵母分离株 PK-KR1 PK-KR1 PK-KR1 PK-KR2 PK-KR2 PK-KR2接种量 90％ 50％ 10％ 90％ 50％ 10％研究第二组发酵物是为了研究接种量对硫醇最终浓度的影响， 同时为了确证关于 VL3 和 PK-KR1 混合发酵物初始发酵的结果。酵母接种物的接种量及接种比例如表 2 和表 3所示。
     表2： 接种量 ( 相对于 2.5×106 细胞 ml-1 的百分比 ) 酵母菌株 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3 PK-KR1 接种量 100％ 50％ 10％ 5％ 1％ 0.5％ 0.1％ 90％
     表3： 混合发酵物酵母接种比例 ( 相对于 2.5×106 细胞 ml-1 的百分比 )商业化的酵母菌株 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3 接种量 100％ 50％ 10％ 5％ 1％ 0.5％ 0.1％ 酵母分离株 PK-KR1 PK-KR1 PK-KR1 PK-KR1 PK-KR1 PK-KR1 PK-KR1 接种量 90％ 90％ 90％ 90％ 90％ 90％ 90％在 25℃下， 于带气阀的 250mL 锥形烧瓶中进行发酵。 用重量损失监测发酵进展， 这 是由于重量损失近似对应于葡萄汁中糖被代谢为乙醇及 CO2 的程度。 经过七天的发酵后， 在 6000×g 下， 对烧瓶中的内容物离心 10min 以使固体沉积。随后将上清转移至 70mL 样品容 器中， 保存于 -20℃。所有发酵都重复进行三次。
     硫醇提取及定量
     基于 Tominaga 等 (Tominaga 等， 1998c) 的方法， 对发酵液体 ( 果酒 ) 中的硫醇浓 度进行分析， 该方法需要根据标准步骤， 用色谱法从果酒中分离硫醇， 随后用气相色谱 - 质 谱联用法 (GC-MS) 进行分析。该定量方法依赖于与处理前加入到果酒中的已知量的内标物 进行比较。
     从果酒中分离硫醇
     在每个 50mL 的果酒样品中， 加入 5mL 1mM 的 4-( 羟基汞 ) 苯甲酸钠 (pHMB)、 0.5mL 2mM 0.1M 的醋酸钠 (pH 6) 及 0.02mM 的丁基羟基茴香醚 (BHA)， 将其混合后， 加入氘代形式 的 3MH 及 3MHA 的混合物。然后， 将 pH 值调至 7。
     随后， 使样品通过 Dowex 树脂柱， 所有存在的硫醇都结合到柱子的基质上。然后用 50mL BHA 洗柱子。再用 50mL 半胱氨酸洗脱缓冲液 (0.1M 醋酸钠、 0.02mM BHA、 400mg 半胱 氨酸 -HCl， pH 值调为 6) 对结合的硫醇进行洗脱。
     用二氯甲烷提取洗脱液中的硫醇。回收下层含硫醇的有机相， 然后用无水 Na2SO4 干燥， 随后过滤， 并在 N2 气流中将终体积浓缩至约 25μL。
     GC-MS 分析
     将 3μL 提 取 物 注 入 带 有 Agilent 5973 惰 性 质 量 选 择 性 检 测 器 及 BP20 柱 的 Agilent 6890N 气相色谱仪。进样器在 240 ℃下、 氦载气以 1ml min-1 的流速增量 (ramp flow) 运行 52 分钟， 然后提高至 2.4ml min-1 运行 12 分钟。柱温以 3℃ min-1 的速率从 40℃ 程序升温至 166℃， 随后以 40℃ min-1 的速率程序升温至 270℃。将质谱仪接口温度条件设 定为 250℃。
     在选择性离子监测模式下， 用表 4 所示的离子检测所述硫醇。
     表4： SIM 模式下的化合物及其选择性离子
     化合物 3- 巯基己基乙酸酯 (3MHA) 3MHA-D 3- 巯基 -1- 己醇 (3MH) 3MH-D
     定量离子 116 118 134 102定性离子 101 103 100 136通过将适宜化合物的峰面积与已知浓度的各标准物的峰面积进行比较来完成化 合物的定量。
     结果
     图 3- 图 12 显示了进行的三次重复发酵中 3MH 及 3MHA 水平的平均值和平均值的 标准误差。所有值都以 ng l-1 表示。
     用简单 t- 检验 ( 单尾 ) 进行计算后， 图中的所有 P 值都表明了所研究的两次处理 的硫醇含量相同的可能性。
     第一组发酵物图 3- 图 8 显示了从第一组发酵物中收集的数据， 对应于指定菌株的单一 100％接 种及如表 1 详细记载的混合发酵酵母接种比例。用苯甲硫醇 (benzenemethanthiol) 作为 内标物， 对上述数据进行分析和定量。
     图 3- 图 6 显示了各种菌种中硫醇含量的比较。图 7 和图 8 绘制了所有菌种的 3MH 或 3MHA 含量， 并重绘了图 3- 图 6 中的数据。
     包含 PK-KR1 的混合发酵物中的 3MHA 产量
     图 3 显示了与仅接种单一菌种的发酵物相比， 接种 VL3(10％ ) 和 PK-KR1(90％ ) 的混合发酵物中 3MHA 产量显著提高。所述 VL3(10％ ) 和 PK-KR1(90％ ) 的混合发酵物生 产的 3MHA 量高出接种单一菌种的各自发酵物产生 3MHA 量的三倍。确定所述 3MHA 在混合 发酵物中产量的提高在统计上是具有显著性的 (P ＝ 0.005)。
     图 3 还显示了在接种量相反 (90％的 VL3+10％的 PK-KR1) 的混合发酵物中， 3MHA 量也有提高， 虽不如上述显著， 但也具显著性意义 (P ＝ 0.01)。
     包含 PK-KR2 的混合发酵物中的 3MHA 产量
     图 4 显示了相比两种菌种的单一发酵物， 所有比例的 VL3 和 PK-KR2 混合发酵物 中， 3MHA 的产量都有所提高。 包含 PK-KR1 的混合发酵物中的 3MH 产量
     图 5 显示了相比于仅接种单一菌种的发酵物， 接种 VL3 和 PK-KR1 的混合发酵物 中， 3MH 的水平都有所提高。
     包含 PK-KR2 的混合发酵中的 3MH 产量
     图 6 显示了相比于两种菌种的单一发酵物， 所有比例的 VL3 和 PK-KR2 混合发酵物 中， 3MH 的产量都有所提高。
     第一组发酵的结果综述
     总的来说， 相比于单一菌株的发酵物， 本发明的酵母菌株和酿酒酵母菌株的特定 混合发酵物似乎都能提高 3MHA 和 / 或 3MH 的产量。VL3 与 PK-KR1 和 PK-KR2 的特定混合物 提高了 3MHA 和 3MH 的产量。
     第二组发酵物
     为了确定第一组发酵物中观察到的硫醇水平提高是否是源于在接种物中采用了 不同量的 VL3， 故研究了第二组发酵物， 检测 VL3 单一发酵物及 VL3 与 PK-KR1 的混合发酵物 中 VL3 不同含量对硫醇产量的影响。
     图 9 和图 10 显示了第二组发酵物的数据， 对应于如表 2 详细记载的接种量及如表 3 详细记载的混合发酵物接种比例。采用氘代标准测定上述实验中的硫醇含量。
     接种不同量 VL3 的发酵物中的 3MHA 产量
     图 9 显示了尽管 VL3 的接种量对单一发酵物中的硫醇产量有统计上的显著性影 响， 但用单因素方差分析 (one way ANOVA)(P ＝ 0.003) 判定后， 并没有明显的趋势。其它 含量 (50％、 5％、 1％、 0.5％和 0.1％ ) 的值基本相同， 与这些含量的值相比， 100％和 10％的 值有轻微下降。因此， 即使 VL3 接种量对所得 3MHA 的含量有任何影响， 该影响也很小。
     图 9 还显示了相比单一接种发酵物， 以 100 ∶ 90、 50 ∶ 90 及 10 ∶ 90 的比例接种 VL3 和 PK-KR1 的发酵物中， 3MHA 的水平有显著性提高。相比于接种 100％ VL3 或 0.1％ VL3 的发酵物中 3MHA 的产量， 用 t- 检验确定有显著性差异。
     重要地， 相比于单一菌种发酵物， 接种特别是具有商业用途的 VL3 和 PK-KR1 接种 量的混合发酵物显示出 3MHA 水平的提高。上述数据确证了第一组发酵物的结果。具有商 业用途的 VL3 和 PK-KR1 接种量适用于 VL3 大于 5％ ( 大于 0.25×106 细胞 ml-1) 的发酵物。
     接种不同量 VL3 的发酵物中的 3MH 产量
     图 10 显示了不同的 VL3 接种量对 3MH 水平的影响与 3MHA 的情况相似。尽管接种 量具有显著性影响， 但用单因素方差分析 (P ＝ 0.03) 判定后， 并没有明显的趋势。 从 100％ VL3 发酵中得到的 3MH 水平比其它接种量的 3MH 水平低， 该结果也是相对恒定的。
     图 10 还显示了相比于仅接种单一菌种的发酵物， 接种 VL3 和 PK-KR1 的混合发酵 物中 3MH 的水平没有提高。
     第二组发酵物的结果综述
     VL3 接种量的所有影响都非常小， 很可能在分离中对于 3MHA 和 3MH 的水平总体上 没有影响。
     结果总结
     用 VL3 和两种从库妙河 (Kumeu River) 分离的克鲁维毕赤酵母菌株的混合物进行 的发酵显示了 3MHA 和 / 或 3MH 量的提高， 提高的幅度取决于采用的菌种及接种的比例。 用于接种发酵物的可商购的果酒酿酒酵母菌株 (VL3) 的量与组合酵母菌株的发 酵物中 3MHA 和 3MH 的产量无关。
     实施例 3 PK-KR1 与一系列可商购的果酒酵母菌株的单一和混合培养物的微发酵
     用实施例 1 中制备的 PK-KR1 及一系列可商购的果酒菌株 (VL3、 VIN7、 X5、 SVG、 QA23 及 EC118) 进行发酵。依照实施例 2 中详细记载的方案进行发酵， 区别在于将发酵温度由 25℃改为 14℃ ( 该温度处于商业上 SB 发酵的温度内 )。依照实施例 2 中详细记载的方案 进行硫醇提取和定量。
     图 11a 显示了相比于单一菌种发酵物， 10％ VL3 和 90％ PK-KR1、 10％ VIN7 和 90％ PK-KR1 以及 10％ X5 和 90％ PK-KR1 的混合发酵物中 3MHA 产量提高。附加的实验显示 ： 尽 管单独的 PK-KR1 产生了相当含量的 3MHA， 发酵物中糖的减少却是最小的， 表明所述产物可 能没有很让人满意的风味。
     图 11b 显示了 PK-KR1 与一系列可商购的果酒酵母菌株的混合发酵物中 3MH 的产 量没有提高。
     PK-KR1 和 PK-KR2 与 VIN7 的共同发酵以 5 升的体积重复 4 次 (n ＝ 4)。接种步骤、 比例和硫醇分析如上所述， 结果如图 12 所示。方差分析显示该处理 ( 采用的菌株 / 混合菌 株 ) 对 3MHA(F ＝ 4.02 ； P ＝ 0.02) 及 3MH(F ＝ 4.28 ； P ＝ 0.02) 水平均有影响。相比于其 它的混合物， 只要包括 PK-KR1 和 / 或 PK-KR2 的混合物中， 3MH 和 3MHA 水平显著更高 (P ＞ 0.05)。
     种群动态
     为了更好地了解这些 PK-KR1 的共同发酵物， 我们监测了发酵全程中， 各个共同发 酵物的菌株的频率变化。
     方法
     每天在无菌条件下从发酵瓶侧壁 (sideport) 取 1mL 样品。以合适的稀释度将样 品铺于 YPD(1％酵母提取物、 2％蛋白胨、 2％葡萄糖 ) 琼脂板上， 30℃孵育 24h， 然后进行菌
     落计数 (n ～ 200)。 对于含 PK-KR1 的混合物， 由于两种酵母的菌落形态都很独特， 因而无需 选择性培养基来区分， 即可在 YPD 琼脂板上进行区分。
     为了监测酵母可用氮 (YAN)、 葡萄糖及果糖的利用， 每两天在无菌条件下从发酵中 取 1mL 样品。用两种检测试剂盒来确定 YAN 的量 ： 1° 氨基氮 -B1(Unitech Scientific， California) 和氨 (Unitech Scientific， California)。两项测试的总和即为 YAN 的总量。 用 D- 葡萄糖 / 果糖试剂盒 (Unitech Scientific， California) 来确定样品中 D- 葡萄糖和 果糖的量。所有检测试剂盒均基于简单的酶促反应， 所述酶促反应由 UV- 分光光度仪进行 监测。
     用合成培养基 (synthetic defined medium) 进行脯氨酸分析， 所述培养基由 1.7g/l 酵母氮源 ( 不含氮、 氨基酸及碳源 )(YNB)、 200g/l 葡萄糖及 0.45g/l L- 脯氨酸 ( ≥ 99％ ； Sigma 试剂 P0380) 组成， 所述脯氨酸的量与典型的葡萄汁中测得的量类似。按 6 2.5×10 酵母细胞 /ml 的量接种该培养基， 在 14 ℃下， 用带气阀的容器以 100rpm 的摇速 使样品进行发酵。按照下述改善的方式重复上述实验 ： 将酵母细胞置于限制性培养基中 48h， 使其经受碳及氮饥饿， 确保细胞内储存的碳和氮被耗尽 ； 用可在培养基中升华的固体 CO2( 干冰 ) 清除烧瓶中过量的 O2 ； 还进行了不在 YNB 中加入葡萄糖或脯氨酸的处理。
     结果
     发酵物中营养素的利用
     种群动态实验的结果如图 13 所示， 显示共同发酵物中的 PK-KR1 存留下来， 并达到 了很高的种群数量。鉴于已知氮是果汁中一种有限的必需资源， 我们探索了监测单一发酵 物和共同发酵物中营养素的变化， 以查明哪些菌种在什么时候利用哪些资源。正如所预料 的那样， 在 VL3 单一发酵物中， YAN 在发酵开始的四天内减少 ( 图 14a)， 而由于葡萄糖 / 果 糖含量被利用， 在整个发酵过程中都减少 ( 图 14b)。含 PK-KR1 的共同发酵物显示了对 YAN 及葡萄糖 / 果糖的利用存在两天的迟滞。有趣的是， VL3 单独存在时利用的 YAN 和葡萄糖 / 果糖在共同发酵物中似乎并不都会被利用。然而， 在 PK-KR1 单一发酵物中观察到一个有趣 的结果。尽管 PK-KR1 达到了如此高的种群数量 (3.5×107cfu/ml)， 这些数据显示葡萄汁中 的主要氮源和碳源并未利用。仅消耗了 16％的 YAN 和 11％的葡萄糖 / 果糖， 而 PK-KR1 却 达到了很高的存活种群数量。
     营养源
     酿酒酵母在厌氧条件下无法利用脯氨酸 ( 处于酿酒酵母降解通路的 PutI 酶需要 O2， Ingledew 等 1987)， 且用于一级氨基氮的检测试剂盒无法检测脯氨酸。然而， 脯氨酸是 葡萄中最丰富的氨基酸之一 (Ough 和 Stashak 1974 ； Spayd 和 Andersen-Bagge 1996)。为 了验证 PK-KR1 可在发酵条件下利用脯氨酸的假设， 我们在含脯氨酸作为唯一氮源的合成 培养基中对 VL3 和 PK-KR1 进行发酵。图 15 显示了上述发酵物中的种群动态。出乎意料 地， PK-KR1 显示出与之前在葡萄汁中进行的实验相同的生长速率， 并达到了类似的种群数 7 7 量 (3.5×10 cfu/ml 及 2.48×10 cfu/ml)。形成鲜明对比的是， 在整个发酵中， VL3 种群数 量显著降低， 甚至无法达到两次种群倍增 (two population doublings)。上述数据与之前 关于酿酒酵母无法在厌氧条件下利用脯氨酸的报道一致 (Ingledew 等 1987)。
     鉴于仅有 PK-KR1 存在时， 葡萄汁中葡萄糖和果糖的量几乎没有变化， 然而却达到 了很高的种群数量， 我们推测该生物可同化其它可能供选择的碳源。我们进行了第二个营养素利用实验。这里， 我们使细胞饥饿以耗尽它们储存的碳和氮， 然后将 PK-KR1 的复制培 养物加入到相同的 YNB 合成培养基 ( 有脯氨酸或无脯氨酸 ) 中。这次， 为了确保接种后氧 气量尽可能少， 加入了少许固体 CO2( 干冰 )， 它的升华可清除烧瓶中的空气。将其在 28℃ 孵育 8 天， 经样品抽出 ( 大气中的空气不让进入 ) 进行种群数量检测， 估算每毫升的菌落形 成单位数。上述数据如图 16 所示。由于没有氮源或碳源， 预期 PK-KR1 在单独的 YNB 中不 会生长 ； 然而， 在培养基中加入脯氨酸， 使得第四天时种群从起始接种的 1.5×106ml-1 增长 到 2.2×107ml-1。这大约是种群数量的 14 倍。推论是， 生物质的增加通过脯氨酸的同化而 实现， 其既可作为能量源来进行分解代谢的活动 ( 碳源 )， 又可作为氮源来进行合成代谢的 生物质构建。
     尽管以上说明的本发明的实施方式是采用特定酵母菌株及酿酒商发酵工艺完成， 本领域技术人员应当了解本发明可采用其他多种形式完成。
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     本发明的开发主要用于葡萄汁的发酵以及果酒酿制方法， 下文会参照本申请进行 说明。然而， 本发明并不限于该特定的使用领域， 也可用于其它发酵工艺。
    背景技术 说明书全文对于现有技术的任何讨论， 都不应被认为是承认所述现有技术广为人 知或构成了本领域公知常识的一部分。
     发酵是一种工艺， 所述工艺中， 酵母将水果或蔬菜中的单糖主要代谢为乙醇和二 氧化碳。 该工艺与很多食品 ( 如面包、 啤酒、 果酒、 烈酒、 表面成熟奶酪和醋 ) 以及生物燃料、 维生素和酶的生产相关。
    果酒是部分由酵母对葡萄汁进行酒精发酵制成的产物。 发酵工艺中存在的酵母菌 株将葡萄汁碳水化合物代谢为乙醇和二氧化碳。然而， 这些成分对果酒的整体风味影响甚 微。 果酒的香气和风味特征来自于大量化合物， 包括挥发性酸和羰基化合物， 作为在发酵工
    艺中由酵母生成的化合物， 其中有 400 种已经被鉴定 (
    1986)。发酵可自发进行， 其中， 天然存在的微生物组进行所述发酵 ； 或者， 酿酒商也可人 为地将已知的、 可商购的果酒酵母的大量培养物接种到葡萄汁中。用于接种葡萄汁的酵母 主要为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 的各种菌株。
     自发的果酒发酵的起始阶段通常与非酿酒酵母 (non-Saccharomyces) 的生长相 关， 所述酵母显示出低的发酵能力， 且在低乙醇环境下生长旺盛。这些酵母包括有孢汉生 酵母 (Hanseniaspora)( 克勒克酵母属 (Kloeckera)) 和假丝酵母 (Candida)( 如星形假 丝酵母 (Candida stellata) 和铁红假丝酵母 (Candida pulcherrima))(Heard 和 Fleet， 1986) 以及其它种的酵母。在自发的情况下， 发酵与多种酵母属和酵母种的顺序相互作用 (sequential interaction) 相关 (Heard 和 Fleet， 1988)。
     非酿酒酵母的酵母对乙醇含量超过 5％的环境的敏感性意味着它们只能在果酒发 酵最初的 2-3 天内生长， 随后， 乙醇耐受的酿酒酵母占据优势地位。重要地， 由于非酿酒酵 6 7 母菌株的种群数量能达到 10 -10 个细胞 /ml， 其能显著影响发酵 (Lema 等， 1996)。所述影 响包括由于多种挥发性及非挥发性产物 ( 如有机酸、 高级醇和酯 ) 的生成对果酒的风味和 香气特征的实质性影响 (Rapp 和 Versini， 1991 ； Esteve-Zarzoso 等， 1998)。这些 “风味化 合物” 的性质和浓度由发酵中存在的酵母属和酵母种决定 (Houtman 等， 1980 ； Lambrechts 和 Pretorius， 2000 ； Brandolini 等， 2002 ； Ramano 等， 2003)。 考察非酿酒酵母种对果酒风味 和香气影响的工作日益增多 (Esteve-Zarzoso 等， 1998)。其中一些工作显示混合种的发酵 物 (ferment) 能够出乎意料地产生高水平的某些风味 - 活性化合物， 如酯类 (Garde-Cerdan 和 Ancin-Azpilicueta， 2006 ； Rojas 等， 2003) 和 2， 3- 丁二醇 (Clemente-Jiminez 等， 2004)等。 挥发性硫醇是果酒中发现的一个风味化合物家族 (Gachons 等， 2000)， 其包括 4- 巯基 -4- 甲基 -2- 戊酮 (4MMP)、 4- 巯基 -4- 甲基 -2- 戊醇 (4MMPOH)、 3- 巯基 -1- 己醇 (3MH) 和 3- 巯基己基乙酸酯 (3MHA)。其中一些硫醇， 如 3MH 和 3MHA， 具有独特的类似葡萄 柚和西番莲果的香气和风味 (Tominaga 等， 1998a)。
     常常发现 3MH 和 3MHA 以高于人类感觉阈限的浓度存在于白苏维翁 (Sauvignon Blanc， SB) 酒中。 在 SB 葡萄汁之中， 发现了一种结合半胱氨酸的、 非挥发性的、 无风味的 3MH 前体， 硫 -(3- 己烯 -1- 醇 )- 半胱氨酸， 发酵中， 该前体可能被切割而释放出 3MH， 3MH 随后 转化为 3MHA(Gachons 等， 2000)。处理所述前体所需的酶被认为是来自于酵母， 而转化需要 活性酵母生长 (Tominaga 等， 1998b)。相关的酶可能分别是 β- 裂解酶和乙酰转移酶的某 种形式。某出版物暗示有多个酵母基因编码的 β- 裂解酶 (Howell 等， 2005)。然而， 两个 实验室的科学家， 包括本发明人等无法重复其实验结果。迄今为止， 我们认为， 在酵母释放 硫醇时起作用的前体、 酶或通路方面还没有强有力的数据发表。
     Chr Hansen( 科 - 汉 森 )( 丹 麦 ) 制 造 了 四 种 可 商 购 的 酵 母 发 酵 剂 (yeast starter culture)， 所 述 发 酵 剂 包 括 不 同 酵 母 种 的 混 合 物， 称 为 Harmony、 Symphony、 Rhythm 及 Melody。所述混合物中的酵母种是酿酒酵母、 德尔布有孢圆酵母 (Torulaspora delbrueckii) 和耐热克鲁维酵母 (Kluyveromyces thermotolerans)。已有报道表明这些 混合物可制造具有改变的风味概况 (profile) 的果酒， 但其并未暗示所述风味概况与硫醇 的存在、 混合或浓度相关。
     目前还没有研究检测非酿酒酵母种对果酒中挥发性硫醇水平的影响或酵母种的 混合物对硫醇产量或果酒风味的影响。 我们了解仅有一项检测酿酒酵母种对果酒中挥发性 硫醇水平影响的研究。 所述研究涉及果酒中酿酒酵母生产的 4MMP 的测定 (Howell 等 2004)。
     急需了解发酵工艺中控制化合物存在及含量的生物工艺。具体地说， 对酿酒商而 言， 能调节果酒中的硫醇含量及种类十分有用。
     调节果酒中的硫醇含量， 特别是 3MH 和 3MHA 的含量， 能够带动新工艺的发展， 使得 酿酒商能够更精确地改变其产品中这些独特的风味化合物的含量。因此， 所述工艺将具有 重大的商业价值。
     本发明的一个目的是克服或改善现有技术的至少一个缺陷， 或提供一种有用的备 选方案。
    发明内容 已意外地发现特定酵母菌株具备在发酵工艺中有用的有利性质。具体地说， 所述 酵母菌株在发酵工艺中可与其它酵母联合产生协同效应， 即增加发酵产物中硫醇的产量。 更具体地说， 所述酵母能用于提高果酒中 3MH 和 3MHA 的产量。此外， 在发酵工艺中提高硫 醇产量的特定新菌株能利用发酵中该种的酵母通常无法利用的氮源和碳源， 即脯氨酸。
     本 发 明 人 等 意 外 地 发 现， 如 称 作 PK-KR1 及 PK-KR2( 克 鲁 维 毕 赤 酵 母 (Pichia kluyveri) 的两种新菌株 ) 与可商购的酵母菌株协同作用， 提高了果酒发酵培养物中挥发 性硫醇的水平。 在发酵中， 酵母可利用的氮含量相对有限， 会严重影响发酵进程及酵母生成 的副产物。进一步意外地发现， 特定酵母菌株能够利用发酵培养物中商业化的酿酒酵母制
     品所无法利用的营养源。举例来说， 相比于酿酒酵母， 所述 PK-KR1 菌株更倾向于利用 L- 脯 氨酸作为氮源和碳源。 脯氨酸是葡萄汁中最丰富的氨基酸之一， 但酿酒酵母却无法利用。 因 此， PK-PR1 的使用不仅可以出人意料地改变果酒最终的风味和香气， 还可以减轻发酵工艺 中 PK-KR1 与商业化的酿酒酵母制品对相对有限的营养素 ( 氮 ) 的竞争。
     如上所述， 本发明涉及酵母菌株、 酵母发酵的发酵剂及发酵方法， 其使得硫醇产量 的提高及新型营养素的利用成为可能。
     相应地， 就第一方面而言， 本发明提供了一种分离的酵母菌株， 该菌株保藏于 澳 大 利 亚 国 家 计 量 院 (National Measurement Institute)， 保 藏 号 为 V06/022711 或 V06/022712 或本文定义的其功能等同物。所述分离株的保藏名称对于 PK-KR1 为 JT1.28， 对于 PK-KR2 为 JT3.71。
     就第二方面而言， 本发明提供了一种分离的酵母菌株， 所述菌株包括核核糖体内 转录间隔区 (internal transcribed spacer(ITS))1-5.8S-ITS2 的核苷酸序列， 所述核苷 酸序列如序列编号 5 或序列编号 6 的任一序列所示。
     就第三方面而言， 本发明提供了一种分离的酵母菌株， 所述菌株包括 26S rDNA 变 异区 (divergent domain)1 和变异区 2(D1/D2) 的核苷酸序列， 所述核苷酸序列如序列编号 7 或序列编号 8 所示。 就第四方面而言， 本发明提供了一种发酵方法， 所述方法包括使用所述第一、 第二 或第三方面中的酵母菌株。
     本发明的酵母菌株可在发酵工艺中与一种或多种其它酵母菌株一起使用， 以协同 增加硫醇的产量。
     就第五方面而言， 本发明提供了一种发酵方法， 所述方法包括使用第二酵母菌株 以及所述第一、 第二或第三方面中的第一酵母菌株， 其中， 所述方法包括下述步骤 ： 将所述 第一酵母菌株和所述第二酵母菌株加入发酵培养物中， 从而引起由所述方法产生的发酵产 物中硫醇产量的协同增加。
     优选地， 所述发酵产物是酒精饮料。更优选地， 所述酒精饮料是果酒。最优选地， 所述果酒是白葡萄酒。在一个特别优选的实施方式中， 所述白葡萄酒由品种为白苏维翁的 葡萄制成。
     优选地， 其中一种酵母菌株为非酿酒酵母菌株。更优选地， 所述非酿酒酵母菌株 属于毕赤酵母属， 更优选所述非酿酒酵母菌株是克鲁维毕赤酵母菌种中的成员。在一个特 别优选的实施方式中， 所述非酿酒酵母的酵母菌株保藏于澳大利亚国家计量院， 保藏号为 V06/022711 或 V06/022712 或其功能等同物。
     优选地， 其中一种酵母菌株为酿酒酵母菌株。 更优选地， 所述酿酒酵母菌株选自本 文所述的、 通常可得的 VL3、 VIN 7、 X5 或 “Merit” 。
     本领域技术人员很清楚所述硫醇可以是任意硫醇或任意硫醇的组合。 所述硫醇优 选为挥发性的。在一个优选的实施方式中， 所述硫醇是 3- 巯基己基乙酸酯 (3MHA)， 在另一 个优选的实施方式中， 所述硫醇是 3- 巯基 -1- 己醇 (3MH)。
     本领域技术人员同样很清楚所述第一酵母菌株和所述第二酵母菌株可以同时或 相继加入发酵物中。
     就第六方面而言， 本发明提供了一种发酵酵母发酵剂， 所述发酵剂包括使发酵产
     物中的硫醇协同增加的至少两种酵母菌株。
     优选地， 其中一种酵母菌株是非酿酒酵母菌株。
     在一个实施方式中， 所述非酿酒酵母菌株占存在于发酵剂中总酵母浓度的比例超 过 10％。 优选地， 存在于发酵剂中总酵母浓度为 2.5×106 细胞 ml-1。 在另一个实施方式中， 所述非酿酒酵母菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 20％。在另一个实施方式中， 所 述非酿酒酵母菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 30％。在另一个实施方式中， 所述 非酿酒酵母菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 40％。在另一个实施方式中， 所述非 酿酒酵母菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 50％。在另一个实施方式中， 所述非酿 酒酵母菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 60％。在另一个实施方式中， 所述非酿酒 酵母菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 70％。在另一个实施方式中， 所述非酿酒酵 母菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 80％。在另一个实施方式中， 所述非酿酒酵母 菌株占存在于发酵剂中总酵母的比例约为 90％。在另一个实施方式中， 所述非酿酒酵母菌 株占存在于发酵剂中总酵母的比例超过 90％。
     在 另 一 个 实 施 方 式 中， 发 酵 剂 中 存 在 的 总 酵 母 浓 度 超 过 2.5×106 细 胞 ml-1。 优 选 地， 所 述 非 酿 酒 酵 母 菌 株 保 藏 于 澳 大 利 亚 国 家 计 量 院， 保 藏 号 为 V06/022711 或 V06/022712。 在一个实施方式中， 发酵产物中协同增加的硫醇是 3MHA， 而在另一个可选择的 实施方式中， 发酵产物中协同增加的硫醇是 3MH。 本领域技术人员当然很清楚可以有多于一 种硫醇的协同增加。 就第七方面而言， 本发明提供了一种制备发酵产物的方法， 所述方法包括使用本 发明的发酵剂， 其中， 所述方法包括将所述发酵剂加入发酵培养物的步骤。优选地， 所述发 酵产物为酒精饮料， 最优选地， 所述酒精饮料是果酒。
     就第八方面而言， 本发明提供了一种依照本发明的方法制备的饮料。 优选地， 所述 饮料是酒精饮料， 更优选地， 所述饮料是果酒。最优选地， 所述果酒是白葡萄酒。在一个特 别优选的实施方式中， 所述白葡萄酒由品种为白苏维翁的葡萄制成。
     同样出人意料地发现， 新型酵母分离株， 例如 PK-KR1， 能够利用发酵培养物中的新 型氮源和碳源。
     就第九方面而言， 本发明提供了一种包括使用酵母菌株的发酵方法， 其中， 所述方 法包括将所述酵母菌株加入发酵培养物中的步骤， 所述酵母菌株在发酵条件下能从氨基酸 中获得氮和 / 或碳。优选地， 所述氨基酸是脯氨酸。
     就第十方面而言， 本发明提供了一种包括将脯氨酸加入发酵培养物中的步骤的发 酵方法， 其中， 所述脯氨酸在所述发酵培养物中是酵母菌株的氮源和 / 或碳源。
     就第十一方面而言， 本发明提供了一种包括使用两种酵母菌株的发酵方法， 其中， 所述方法包括将所述菌株加入发酵培养物中的步骤， 所述菌株的每一种均能从不同的来源 获得氮和 / 或碳。
     就第十二方面而言， 本发明提供了一种为发酵培养物挑选酵母的方法， 所述方法 包括将酵母菌株加入含有作为其几乎唯一氮源的脯氨酸的发酵培养物中以及从所述培养 物中分离出能从脯氨酸中获得氮的酵母菌株的步骤。
     就第十三方面而言， 本发明提供了一种包括使用酵母菌株的发酵方法， 所述方法 包括将所述酵母菌株加入发酵培养物的步骤， 其中， 所述酵母菌株不以葡萄糖或果糖作为
     其唯一或几乎唯一的碳源。
     就第十四方面而言， 本发明提供了一种增强发酵产物风味的方法， 所述方法包括 在发酵培养物中使用如权利要求 1-3 中任一项所述的酵母菌株或如权利要求 13-20 中任一 项所述的酵母发酵剂， 所述方法包括将所述酵母菌株或所述发酵剂加入发酵培养物中的步 骤。
     在本发明的上下文中， 只要是术语 “其功能等同物” ， 均涉及本申请所说明或定义 的酵母菌株的功能等同物， 在一个实施方式中， 它指的是所述酵母菌株与至少一种其它酵 母菌株相互作用以协同增加发酵产物中硫醇含量的能力。在另一个可选实施方式中， 术语 “其功能等同物” 指的是能利用发酵培养物中该种的酵母通常无法利用的氮源和碳源的酵 母菌株。
     在本发明的上下文中， 只要是 “协同增加” ， 均涉及发酵产物中硫醇的含量， 它指的 是由两种酵母菌株产生的发酵产物中硫醇含量的增加， 所述硫醇含量大于任一种的酵母菌 株单独在发酵产物中产生的硫醇含量的总和。
     在本发明的上下文中， 术语 “发酵产物” 包括发酵工艺中的任何产物， 包括固体、 液 体或气体产物。 在本发明的上下文中， 只要是术语 “菌株” 涉及酵母， 它指的是种内潜在的遗传性 变体或亚型 ； 例如， 从特定地点及时采集的菌种分离株， 或确证在核苷酸水平上与同种其他 成员不一致的分离株。
     在本发明的上下文中， 术语 “发酵” 指的是酵母将水果或蔬菜中的单糖主要代谢为 乙醇和二氧化碳的工艺。
     在本发明的上下文中， 术语 “包含” 、 “包括” 等应解释为其包含的含义， 即 “包括但 不限于” ， 而不是其排他的含义。
    附图说明 图1： PK-KR1 的 26S 核糖体基因的 D1/D2 区与模式菌株 (type strain) 克鲁维毕 赤酵母的核苷酸序列同源性比对。
     上部序列＝克鲁维毕赤酵母模式菌株 (CBS188)， 登录号 U75727
     下部序列＝ PK-KR1
     图2： PK-KR1 的 ITS 区与模式菌株克鲁维毕赤酵母同一区域的核苷酸序列同源性 比对。
     上部序列＝克鲁维毕赤酵母模式菌株 (CBS188)， 登录号 DQ104711
     下部序列＝ PK-KR1
     图3： PK-KR2 的 26S 核糖体基因的 D1/D2 区与模式菌株克鲁维毕赤酵母同一区域 的核苷酸序列同源性比对。
     上部序列＝克鲁维毕赤酵母模式菌株 (CBS188)， 登录号 U75727
     下部序列＝ PK-KR2
     图4： PK-KR2 的 ITS 区与模式菌株克鲁维毕赤酵母同一区域的核苷酸序列同源性 比对。
     上部序列＝克鲁维毕赤酵母模式菌株 (CBS188)， 登录号 DQ104711
     下部序列＝ PK-KR2
     图5 ： 显示含有酵母菌株 VL3 和 PK-KR1 的单一发酵物和混合发酵物中产生的 3MHA 浓度的柱状图， 所述酵母菌株 VL3 和 PK-KR1 的混合比例为 10 ∶ 90、 50 ∶ 50 及 90 ∶ 10。
     图6 ： 显示含有酵母菌株 VL3 和 PK-KR2 的单一发酵物和混合发酵物中产生的 3MHA 浓度的柱状图， 所述酵母菌株 VL3 和 PK-KR2 的混合比例为 10 ∶ 90、 50 ∶ 50 及 90 ∶ 10。
     图7： 显示含有酵母菌株 VL3 和 PK-KR1 的单一发酵物和混合发酵物中产生的 3MH 浓度的柱状图， 所述酵母菌株 VL3 和 PK-KR1 的混合比例为 10 ∶ 90、 50 ∶ 50 及 90 ∶ 10。
     图8： 显示含有酵母菌株 VL3 和 PK-KR2 的单一发酵物和混合发酵物中产生的 3MH 浓度的柱状图， 所述酵母菌株 VL3 和 PK-KR2 的混合比例为 10 ∶ 90、 50 ∶ 50 及 90 ∶ 10。
     图9： 综 合 图 3 及 图 4 中 的 数 据， 显 示 含 有 酵 母 菌 株 VL3、 PK-KR1 及 PK-KR2 的 单 一 发 酵 物 和 混 合 发 酵 物 中 产 生 的 3MHA 浓 度 的 柱 状 图， 组合如下 ： VL3 ∶ PK-KR1、 VL3 ∶ PK-KR2， 组合比例为 10 ∶ 90、 50 ∶ 50 及 90 ∶ 10。
     图 10 ： 综合图 5 及图 6 中的数据， 显示含有酵母菌株 VL3、 PK-KR1 及 PK-KR2 的单一 发酵物和混合发酵物中产生的 3MH 浓度的柱状图， 组合如下 ： VL3 ∶ PK-KR1、 VL3 ∶ PK-KR2， 组合比例为 10 ∶ 90、 50 ∶ 50 及 90 ∶ 10。
     图 11 ： 显示 PK-KR1 及 VL3 的单一发酵物和混合发酵物中 3MHA 浓度 ( 采用氘代标 准 ) 的柱状图。
     图 12 ： 显示 PK-KR1 及 VL3 的单一发酵物和混合发酵物中 3MH 浓度 ( 采用氘代标 准 ) 的柱状图。
     图 13a ： 显示 PK-KR1 与多种商业化的果酒菌株 VL3、 EC1118、 VIN7、 X5、 QA23 及 SVG 的单一发酵物和混合发酵物 ( 发酵温度 14℃ ) 中产生的 3MHA 浓度的柱状图。
     在 14℃下， 一组商业化的果酒酵母的单一发酵物以及它们与 PK-KR1 的共同发酵 物产生的 3MHA(a) 和 3MH(b) 的含量 ( 平均值 ± 平均值的标准误差 ； n ＝ 3)。所有共同发 酵物均在酿酒酵母∶ PK-KR1 为 10 ∶ 90 时起始。相比于 VL3、 VIN7 及 X5 的单一发酵物各 自的 3MHA 水平， PK-KR1 与 VL3、 VIN7 及 X5 的共同发酵物中 3MHA 的水平均有显著性提高 (P ＜ 0.01)。
     图 13b ： 显示 PK-KR1 与多种商业化的果酒菌株 VL3、 EC1118、 VIN7、 X5、 QA23 及 SVG 的单一发酵物和混合发酵物 ( 发酵温度 14℃ ) 中产生的 3MH 浓度的柱状图。
     图 14 ： 显示在 5 升的体积中， PK-KR1、 PK-KR2 和 VIN7 的混合发酵物 ( 发酵温度 14℃ ) 中产生的 3MHA 及 3MH 浓度的柱状图。3MHA 及 3MH 的水平以 ng l-1 表示 ； 未用相同 字母表示的水平在 t- 检验下具有显著性差异 (P ＞ 0.05)。
     在 5 升的混合发酵物实验中， 3MHA 及 3MH 的水平以 ng l-1 表示 ； 未用相同字母表 示的水平在 t- 检验下具有显著性差异 (P ＞ 0.05)。
     图 15 ： 通过白苏维翁葡萄汁中 VL3 及 PK-KR1 的单一发酵物和共同发酵物的菌落 形成单位估定的细胞数。
     通过在 14℃的条件下， VL3 及 PK-KR1 的单一发酵物 ( 分别为实心三角和实心圆 ) 和共同发酵物 ( 分别为空心三角和空心圆 ) 的菌落形成单位估定的细胞数。所述共同发酵 物以 VL3 ∶ PK-KR1 ＝ 10 ∶ 90 的比例接种。平均值 ± 平均值的标准误差 ； n ＝ 6。
     图 16 ： 单 一 发 酵 和 混 合 发 酵 期 间 营 养 素 的 利 用， 单 一 发 酵 和 混 合 发 酵 期 间，PK-KR1 及 VL3 对 (a) 酵母可用氮 (YAN) 的利用 ； 以及 (b) 葡萄糖和果糖的利用。
     a) 在 14℃的条件下， VL3 单一发酵 ( 实心三角 ) 和共同发酵 ( 空心三角 ) 及 PK-KR1 单一发酵 ( 实心圆 ) 期间， 酵母可用氮 (YAN) 含量的变化。所述共同发酵在 VL3 ∶ PK-KR1 为 10 ∶ 90 时起始。对照 ： 未接种的无菌葡萄汁 ( 空心方块 )。平均值 ± 平均值的标准误 差； n ＝ 3。
     b) 在 14℃的条件下， VL3 单一发酵 ( 实心三角 ) 和共同发酵 ( 空心三角 ) 及 PK-KR1 单一发酵 ( 实心圆 ) 期间， 葡萄糖和果糖总量的变化。所述共同发酵在 VL3 ∶ PK-KR1 为 10 ∶ 90 时起始。对照 ： 未接种的无菌葡萄汁 ( 空心方块 )。平均值 ± 平均值的标准误差 ； n ＝ 3。
     图 17 ： 发酵条件下， PK-KR1 及 VL3 在含有脯氨酸作为唯一氮源的培养基中的生长。
     14℃时， 在发酵条件下， VL3( 三角 ) 及 PK-KR1( 圆 ) 在合成酵母氮源培养基中的 生长， 所述培养基中， 脯氨酸是唯一的氮源。平均值 ± 平均值的标准误差 ； n ＝ 6。
     图 18 ： 经碳和氮饥饿后， 在发酵条件下， PK-KR1 在含有脯氨酸作为唯一氮源的培 养基中的生长。
     PK-KR1( 经碳和氮饥饿 ) 在单独的 YNB( 即无碳源及氮源补给 ) 和加入有脯氨酸的 相同培养基中的生长。 具体实施方式 本发明涉及酵母菌株， 特别是用于发酵工艺的酵母菌株。
     本发明还涉及酵母菌株 PK-KR1 和 PK-KR2， 所述菌株保藏名称分别为 JT1.28 和 JT 3.71， 保藏于澳大利亚国家计量院 ( 克拉尔克大街 51-65， 南墨尔本， VIC 3205)， 保藏号分 别为 V06/022711 和 V06/022712。
     例如， 产于新西兰南岛马尔堡区的白苏维翁酒具有非常独特的风味概况。这一独 特的风格使得该果酒在国际果酒市场上占据重要的地位。相应地， 与加强这些果酒的香气 和 / 或风味相关的酵母也极具商业价值。
     本发明还涉及用酵母菌株单独或结合其他菌株进行发酵的方法。
     本发明进一步涉及筛选和分离适于发酵培养物的酵母菌株、 特别是加强果酒的一 种或多种特征 ( 如风味和 / 或香气 ) 的酵母的方法。
     优选地， 所述筛选方法包括在一种或多种发酵培养物或培养基中接种一种或多种 酵母菌株。 优选地， 所述培养物或培养基含有几乎单一的预先选定的碳源和 / 或氮源。 优选 地， 所述碳源和 / 或氮源为脯氨酸。所述方法进一步包括在适合酵母生长的温度下， 孵育所 述经接种的发酵物或培养物， 并在一段时间内监测酵母的生长。所述方法进一步包括鉴定 和分离一种或多种能利用几乎单一的预先选定的碳源和 / 或氮源作为营养源的酵母菌株。
     通常情况下， 对酵母而言， 葡萄汁中的氮是有限的必需资源， 较低的氮水平会减缓 酵母生长及发酵， 很可能导致发酵出现问题 ( 如发酵停滞 )(Ribereau-Gayon 等 2006)。对 于存在于葡萄汁中的氮源， 酵母首先利用的是氨， 然后是氨基酸。 脯氨酸通常是葡萄汁中最 丰富的氨基酸之一 (Ough 和 Stashak 1974 ； Spayd 和 Andersen-Bagge 1996)。 然而， 酿酒酵 母在厌氧条件下无法利用脯氨酸 ( 处于酿酒酵母降解通路的 PutI 酶需要 O2， Ingledew 等 1987)。在这点上， 酿酒酵母在发酵中无法利用重要的氮源， 如果酵母可以通过某些方式利
     用脯氨酸作为氮源和 / 或碳源， 就能够减少发酵中产生的问题， 如酿酒商便无需人为添加 氮源。此外， 从非酿酒酵母共同发酵的角度看， 不会直接竞争有限的氮源 ( 例如， 通过利用 脯氨酸 ) 共同发酵的酵母在商业应用中是十分理想的， 因为这不仅减少了与酿酒酵母的竞 争， 同时也释放出隐藏于脯氨酸中的氮以供酿酒酵母随后利用。
     相应地， 本发明进一步涉及能利用发酵培养物中的新型氮源和 / 或碳源的酵母菌 株。
     本发明进一步由以下非限制性的实施例进行说明。
     实施例
     实施例 1 酵母分离
     称为 PK-KR1 和 PK-KR2 的两种酵母菌株是按照以下记载从奥克兰西区的库妙河果 酒公司 (Kumeu River Wines) 的 Mate 葡萄园得到的 2005 霞多丽 (Chardonnay) 葡萄汁的 天然发酵物中分离而得。图 1- 图 16 显示了用所述菌株所做实验的实验数据， 并在以下详 细说明。
     在发酵工艺的不同时期采集葡萄汁样品， 并将其接种至经酸化的麦芽培养基以挑 选酵母和抗细菌 (Johnson 等， 2004)。采用本领域众所周知的方案， 用 Chelex-100 螯合 树脂从分离的酵母样菌落中提取 DNA(Walsh 等 1991)。采用本领域众所周知的方法， 用聚 合酶链式反应， 使用对真菌特异的引物扩增每种菌株的核核糖体内转录间隔区 (internal transcribed spacer(ITS))1、 5.8S、 ITS2 及 26S 变异区 1 和变异区 2(D1/D2)(White 等， 1990， Kurtzman 和 Robnett 1998))。本领域技术人员应当了解通常对所述酵母基因组的 这些区域进行分析以在种的水平上鉴定生物 (Leaw 等 2006 ； White 等， 1990 ； Kurtzman 和 Robnett 1998)。具体地， 用序列编号 1 和序列编号 2 表示的引物扩增核核糖体内转录间隔 区 (internal transcribed spacer(ITS))1、 5.8S 及 ITS2， 用序列编号 3 和序列编号 4 表示 的引物扩增 26S 变异区 1 和变异区 2(D1/D2)。用本领域中众所周知的方法对所得 DNA 产物 的两条链都进行测序。酵母 PK-KR1 和 PK-KR2 的 ITS1-5.8S-ITS2 的 DNA 序列分别表示为 序列编号 5 和序列编号 6。酵母 PK-KR1 和 PK-KR2 的 26S D1/D2 的 DNA 序列分别表示为序 列编号 7 和序列编号 8。
     用标准 BLAST 搜索工具 ( 可在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ 上获得 ) 对 来自所述菌株的 ITS1-5.8S-ITS2DNA 和 26S D1/D2 序列进行分析 ( 依照 Kurtzman & Fell， (2006))。相关的序列同源性比对分析如图 1-4 所示。如下所述， 分析表明分离的酵母是克 鲁维毕赤酵母的新型菌株。
     PK-KR1
     PK-KR1 ITS 区的比对显示出与 DQ674358( 发酵毕赤酵母 (Pichia fermentans)) 和 DQ104711( 克鲁维毕赤酵母 ) 具有 99％的同一性
     PK-KR1 26S 区的比对显示出与 EF564382.1( 克鲁维毕赤酵母 ) 具有 100％的同一 性
     上述指出的 PK-KR1 序列也与克鲁维毕赤酵母 U75727 和 DQ104711 的相应序列进 行了比对。比对结果分别如图 1 和图 2 所示。
     PK-KR2
     PK-KR2 ITS 区的比对显示出与 AY027508.1/DQ104711.1( 发酵毕赤酵母 / 克鲁维毕赤酵母 ) 具有 98％的同一性
     PK-KR2 26S 区的比对显示出与 AJ746339.1( 克鲁维毕赤酵母 ) 具有 99％的同一 性
     上述指出的 PK-KR2 序列也与克鲁维毕赤酵母 U75727 和 DQ104711 的相应序列进 行了比对。比对结果如图 3 和图 4 所示。
     结论 ： PK-KR1 和 PK-KR2 是两种不同的新型克鲁维毕赤酵母菌株。
     鉴定物 最优匹配种
     PK-KR1 克鲁维毕赤酵母
     PK-KR2 克鲁维毕赤酵母
     实施例 2 分离的酵母在单一培养物和混合培养物中的微发酵
     用实施例 1 中制备的酵母分离株及 Zymaflore VL3(Laffort) 酵母菌株进行发酵。 VL3 是一种可商购的酿酒酵母菌株， 在波尔多 (Bordeaux) 分离得到并出售专门用于果酒发 酵。
     用 200mL 无菌 2005 白苏维翁葡萄汁 ( 产自马尔堡的拉保拉 (Rapaura)) 进行发 酵。首先用 DMDC( 焦碳酸二甲酯， C4H6O5， MW ： 134.09gmol-1， CAS ： 4525-33-1) 对葡萄汁进行 灭菌。 如下表 1 所示， 用单一菌株及多种成对比例的菌株进行发酵。对葡萄汁进行接种 前， 在标准酵母实验室培养基中于 28℃对各酵母种进行 48h 的培养。 与果酒产业协定一致， 6 -1 以 2.5×10 酵母细胞 mL 的起始浓度对葡萄汁进行接种。所记载的接种以百分比表示， 即 6 -1 100％对应于 2.5×10 酵母细胞 mL 。
     研究了两组独立的发酵物， 设计第一组发酵物用于研究混合种发酵物对硫醇浓度 的影响。上述发酵物中使用的酵母比例总结于表 1 中。
     表1： 混合发酵物酵母接种比例 ( 相对于 2.5×106 细胞 ml-1 的百分比 )
    
    商业化的酵母菌株 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3
    接种量 10％ 50％ 90％ 10％ 50％ 90％酵母分离株 PK-KR1 PK-KR1 PK-KR1 PK-KR2 PK-KR2 PK-KR2接种量 90％ 50％ 10％ 90％ 50％ 10％研究第二组发酵物是为了研究接种量对硫醇最终浓度的影响， 同时为了确证关于 VL3 和 PK-KR1 混合发酵物初始发酵的结果。酵母接种物的接种量及接种比例如表 2 和表 3所示。
    
    表2： 接种量 ( 相对于 2.5×106 细胞 ml-1 的百分比 ) 酵母菌株 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3 PK-KR1 接种量 100％ 50％ 10％ 5％ 1％ 0.5％ 0.1％ 90％
    
    表3： 混合发酵物酵母接种比例 ( 相对于 2.5×106 细胞 ml-1 的百分比 )商业化的酵母菌株 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3 VL3 接种量 100％ 50％ 10％ 5％ 1％ 0.5％ 0.1％ 酵母分离株 PK-KR1 PK-KR1 PK-KR1 PK-KR1 PK-KR1 PK-KR1 PK-KR1 接种量 90％ 90％ 90％ 90％ 90％ 90％ 90％在 25℃下， 于带气阀的 250mL 锥形烧瓶中进行发酵。 用重量损失监测发酵进展， 这 是由于重量损失近似对应于葡萄汁中糖被代谢为乙醇及 CO2 的程度。 经过七天的发酵后， 在 6000×g 下， 对烧瓶中的内容物离心 10min 以使固体沉积。随后将上清转移至 70mL 样品容 器中， 保存于 -20℃。所有发酵都重复进行三次。
     硫醇提取及定量
     基于 Tominaga 等 (Tominaga 等， 1998c) 的方法， 对发酵液体 ( 果酒 ) 中的硫醇浓 度进行分析， 该方法需要根据标准步骤， 用色谱法从果酒中分离硫醇， 随后用气相色谱 - 质 谱联用法 (GC-MS) 进行分析。该定量方法依赖于与处理前加入到果酒中的已知量的内标物 进行比较。
     从果酒中分离硫醇
     在每个 50mL 的果酒样品中， 加入 5mL 1mM 的 4-( 羟基汞 ) 苯甲酸钠 (pHMB)、 0.5mL 2mM 0.1M 的醋酸钠 (pH 6) 及 0.02mM 的丁基羟基茴香醚 (BHA)， 将其混合后， 加入氘代形式 的 3MH 及 3MHA 的混合物。然后， 将 pH 值调至 7。
     随后， 使样品通过 Dowex 树脂柱， 所有存在的硫醇都结合到柱子的基质上。然后用 50mL BHA 洗柱子。再用 50mL 半胱氨酸洗脱缓冲液 (0.1M 醋酸钠、 0.02mM BHA、 400mg 半胱 氨酸 -HCl， pH 值调为 6) 对结合的硫醇进行洗脱。
     用二氯甲烷提取洗脱液中的硫醇。回收下层含硫醇的有机相， 然后用无水 Na2SO4 干燥， 随后过滤， 并在 N2 气流中将终体积浓缩至约 25μL。
     GC-MS 分析
     将 3μL 提 取 物 注 入 带 有 Agilent 5973 惰 性 质 量 选 择 性 检 测 器 及 BP20 柱 的 Agilent 6890N 气相色谱仪。进样器在 240 ℃下、 氦载气以 1ml min-1 的流速增量 (ramp flow) 运行 52 分钟， 然后提高至 2.4ml min-1 运行 12 分钟。柱温以 3℃ min-1 的速率从 40℃ 程序升温至 166℃， 随后以 40℃ min-1 的速率程序升温至 270℃。将质谱仪接口温度条件设 定为 250℃。
     在选择性离子监测模式下， 用表 4 所示的离子检测所述硫醇。
     表4： SIM 模式下的化合物及其选择性离子
    化合物 3- 巯基己基乙酸酯 (3MHA) 3MHA-D 3- 巯基 -1- 己醇 (3MH) 3MH-D
    定量离子 116 118 134 102定性离子 101 103 100 136通过将适宜化合物的峰面积与已知浓度的各标准物的峰面积进行比较来完成化 合物的定量。
     结果
     图 3- 图 12 显示了进行的三次重复发酵中 3MH 及 3MHA 水平的平均值和平均值的 标准误差。所有值都以 ng l-1 表示。
     用简单 t- 检验 ( 单尾 ) 进行计算后， 图中的所有 P 值都表明了所研究的两次处理 的硫醇含量相同的可能性。
     第一组发酵物图 3- 图 8 显示了从第一组发酵物中收集的数据， 对应于指定菌株的单一 100％接 种及如表 1 详细记载的混合发酵酵母接种比例。用苯甲硫醇 (benzenemethanthiol) 作为 内标物， 对上述数据进行分析和定量。
     图 3- 图 6 显示了各种菌种中硫醇含量的比较。图 7 和图 8 绘制了所有菌种的 3MH 或 3MHA 含量， 并重绘了图 3- 图 6 中的数据。
     包含 PK-KR1 的混合发酵物中的 3MHA 产量
     图 3 显示了与仅接种单一菌种的发酵物相比， 接种 VL3(10％ ) 和 PK-KR1(90％ ) 的混合发酵物中 3MHA 产量显著提高。所述 VL3(10％ ) 和 PK-KR1(90％ ) 的混合发酵物生 产的 3MHA 量高出接种单一菌种的各自发酵物产生 3MHA 量的三倍。确定所述 3MHA 在混合 发酵物中产量的提高在统计上是具有显著性的 (P ＝ 0.005)。
     图 3 还显示了在接种量相反 (90％的 VL3+10％的 PK-KR1) 的混合发酵物中， 3MHA 量也有提高， 虽不如上述显著， 但也具显著性意义 (P ＝ 0.01)。
     包含 PK-KR2 的混合发酵物中的 3MHA 产量
     图 4 显示了相比两种菌种的单一发酵物， 所有比例的 VL3 和 PK-KR2 混合发酵物 中， 3MHA 的产量都有所提高。 包含 PK-KR1 的混合发酵物中的 3MH 产量
     图 5 显示了相比于仅接种单一菌种的发酵物， 接种 VL3 和 PK-KR1 的混合发酵物 中， 3MH 的水平都有所提高。
     包含 PK-KR2 的混合发酵中的 3MH 产量
     图 6 显示了相比于两种菌种的单一发酵物， 所有比例的 VL3 和 PK-KR2 混合发酵物 中， 3MH 的产量都有所提高。
     第一组发酵的结果综述
     总的来说， 相比于单一菌株的发酵物， 本发明的酵母菌株和酿酒酵母菌株的特定 混合发酵物似乎都能提高 3MHA 和 / 或 3MH 的产量。VL3 与 PK-KR1 和 PK-KR2 的特定混合物 提高了 3MHA 和 3MH 的产量。
     第二组发酵物
     为了确定第一组发酵物中观察到的硫醇水平提高是否是源于在接种物中采用了 不同量的 VL3， 故研究了第二组发酵物， 检测 VL3 单一发酵物及 VL3 与 PK-KR1 的混合发酵物 中 VL3 不同含量对硫醇产量的影响。
     图 9 和图 10 显示了第二组发酵物的数据， 对应于如表 2 详细记载的接种量及如表 3 详细记载的混合发酵物接种比例。采用氘代标准测定上述实验中的硫醇含量。
     接种不同量 VL3 的发酵物中的 3MHA 产量
     图 9 显示了尽管 VL3 的接种量对单一发酵物中的硫醇产量有统计上的显著性影 响， 但用单因素方差分析 (one way ANOVA)(P ＝ 0.003) 判定后， 并没有明显的趋势。其它 含量 (50％、 5％、 1％、 0.5％和 0.1％ ) 的值基本相同， 与这些含量的值相比， 100％和 10％的 值有轻微下降。因此， 即使 VL3 接种量对所得 3MHA 的含量有任何影响， 该影响也很小。
     图 9 还显示了相比单一接种发酵物， 以 100 ∶ 90、 50 ∶ 90 及 10 ∶ 90 的比例接种 VL3 和 PK-KR1 的发酵物中， 3MHA 的水平有显著性提高。相比于接种 100％ VL3 或 0.1％ VL3 的发酵物中 3MHA 的产量， 用 t- 检验确定有显著性差异。
     重要地， 相比于单一菌种发酵物， 接种特别是具有商业用途的 VL3 和 PK-KR1 接种 量的混合发酵物显示出 3MHA 水平的提高。上述数据确证了第一组发酵物的结果。具有商 业用途的 VL3 和 PK-KR1 接种量适用于 VL3 大于 5％ ( 大于 0.25×106 细胞 ml-1) 的发酵物。
     接种不同量 VL3 的发酵物中的 3MH 产量
     图 10 显示了不同的 VL3 接种量对 3MH 水平的影响与 3MHA 的情况相似。尽管接种 量具有显著性影响， 但用单因素方差分析 (P ＝ 0.03) 判定后， 并没有明显的趋势。 从 100％ VL3 发酵中得到的 3MH 水平比其它接种量的 3MH 水平低， 该结果也是相对恒定的。
     图 10 还显示了相比于仅接种单一菌种的发酵物， 接种 VL3 和 PK-KR1 的混合发酵 物中 3MH 的水平没有提高。
     第二组发酵物的结果综述
     VL3 接种量的所有影响都非常小， 很可能在分离中对于 3MHA 和 3MH 的水平总体上 没有影响。
     结果总结
     用 VL3 和两种从库妙河 (Kumeu River) 分离的克鲁维毕赤酵母菌株的混合物进行 的发酵显示了 3MHA 和 / 或 3MH 量的提高， 提高的幅度取决于采用的菌种及接种的比例。 用于接种发酵物的可商购的果酒酿酒酵母菌株 (VL3) 的量与组合酵母菌株的发 酵物中 3MHA 和 3MH 的产量无关。
     实施例 3 PK-KR1 与一系列可商购的果酒酵母菌株的单一和混合培养物的微发酵
     用实施例 1 中制备的 PK-KR1 及一系列可商购的果酒菌株 (VL3、 VIN7、 X5、 SVG、 QA23 及 EC118) 进行发酵。依照实施例 2 中详细记载的方案进行发酵， 区别在于将发酵温度由 25℃改为 14℃ ( 该温度处于商业上 SB 发酵的温度内 )。依照实施例 2 中详细记载的方案 进行硫醇提取和定量。
     图 11a 显示了相比于单一菌种发酵物， 10％ VL3 和 90％ PK-KR1、 10％ VIN7 和 90％ PK-KR1 以及 10％ X5 和 90％ PK-KR1 的混合发酵物中 3MHA 产量提高。附加的实验显示 ： 尽 管单独的 PK-KR1 产生了相当含量的 3MHA， 发酵物中糖的减少却是最小的， 表明所述产物可 能没有很让人满意的风味。
     图 11b 显示了 PK-KR1 与一系列可商购的果酒酵母菌株的混合发酵物中 3MH 的产 量没有提高。
     PK-KR1 和 PK-KR2 与 VIN7 的共同发酵以 5 升的体积重复 4 次 (n ＝ 4)。接种步骤、 比例和硫醇分析如上所述， 结果如图 12 所示。方差分析显示该处理 ( 采用的菌株 / 混合菌 株 ) 对 3MHA(F ＝ 4.02 ； P ＝ 0.02) 及 3MH(F ＝ 4.28 ； P ＝ 0.02) 水平均有影响。相比于其 它的混合物， 只要包括 PK-KR1 和 / 或 PK-KR2 的混合物中， 3MH 和 3MHA 水平显著更高 (P ＞ 0.05)。
     种群动态
     为了更好地了解这些 PK-KR1 的共同发酵物， 我们监测了发酵全程中， 各个共同发 酵物的菌株的频率变化。
     方法
     每天在无菌条件下从发酵瓶侧壁 (sideport) 取 1mL 样品。以合适的稀释度将样 品铺于 YPD(1％酵母提取物、 2％蛋白胨、 2％葡萄糖 ) 琼脂板上， 30℃孵育 24h， 然后进行菌
     落计数 (n ～ 200)。 对于含 PK-KR1 的混合物， 由于两种酵母的菌落形态都很独特， 因而无需 选择性培养基来区分， 即可在 YPD 琼脂板上进行区分。
     为了监测酵母可用氮 (YAN)、 葡萄糖及果糖的利用， 每两天在无菌条件下从发酵中 取 1mL 样品。用两种检测试剂盒来确定 YAN 的量 ： 1° 氨基氮 -B1(Unitech Scientific， California) 和氨 (Unitech Scientific， California)。两项测试的总和即为 YAN 的总量。 用 D- 葡萄糖 / 果糖试剂盒 (Unitech Scientific， California) 来确定样品中 D- 葡萄糖和 果糖的量。所有检测试剂盒均基于简单的酶促反应， 所述酶促反应由 UV- 分光光度仪进行 监测。
     用合成培养基 (synthetic defined medium) 进行脯氨酸分析， 所述培养基由 1.7g/l 酵母氮源 ( 不含氮、 氨基酸及碳源 )(YNB)、 200g/l 葡萄糖及 0.45g/l L- 脯氨酸 ( ≥ 99％ ； Sigma 试剂 P0380) 组成， 所述脯氨酸的量与典型的葡萄汁中测得的量类似。按 6 2.5×10 酵母细胞 /ml 的量接种该培养基， 在 14 ℃下， 用带气阀的容器以 100rpm 的摇速 使样品进行发酵。按照下述改善的方式重复上述实验 ： 将酵母细胞置于限制性培养基中 48h， 使其经受碳及氮饥饿， 确保细胞内储存的碳和氮被耗尽 ； 用可在培养基中升华的固体 CO2( 干冰 ) 清除烧瓶中过量的 O2 ； 还进行了不在 YNB 中加入葡萄糖或脯氨酸的处理。
     结果
     发酵物中营养素的利用
     种群动态实验的结果如图 13 所示， 显示共同发酵物中的 PK-KR1 存留下来， 并达到 了很高的种群数量。鉴于已知氮是果汁中一种有限的必需资源， 我们探索了监测单一发酵 物和共同发酵物中营养素的变化， 以查明哪些菌种在什么时候利用哪些资源。正如所预料 的那样， 在 VL3 单一发酵物中， YAN 在发酵开始的四天内减少 ( 图 14a)， 而由于葡萄糖 / 果 糖含量被利用， 在整个发酵过程中都减少 ( 图 14b)。含 PK-KR1 的共同发酵物显示了对 YAN 及葡萄糖 / 果糖的利用存在两天的迟滞。有趣的是， VL3 单独存在时利用的 YAN 和葡萄糖 / 果糖在共同发酵物中似乎并不都会被利用。然而， 在 PK-KR1 单一发酵物中观察到一个有趣 的结果。尽管 PK-KR1 达到了如此高的种群数量 (3.5×107cfu/ml)， 这些数据显示葡萄汁中 的主要氮源和碳源并未利用。仅消耗了 16％的 YAN 和 11％的葡萄糖 / 果糖， 而 PK-KR1 却 达到了很高的存活种群数量。
     营养源
     酿酒酵母在厌氧条件下无法利用脯氨酸 ( 处于酿酒酵母降解通路的 PutI 酶需要 O2， Ingledew 等 1987)， 且用于一级氨基氮的检测试剂盒无法检测脯氨酸。然而， 脯氨酸是 葡萄中最丰富的氨基酸之一 (Ough 和 Stashak 1974 ； Spayd 和 Andersen-Bagge 1996)。为 了验证 PK-KR1 可在发酵条件下利用脯氨酸的假设， 我们在含脯氨酸作为唯一氮源的合成 培养基中对 VL3 和 PK-KR1 进行发酵。图 15 显示了上述发酵物中的种群动态。出乎意料 地， PK-KR1 显示出与之前在葡萄汁中进行的实验相同的生长速率， 并达到了类似的种群数 7 7 量 (3.5×10 cfu/ml 及 2.48×10 cfu/ml)。形成鲜明对比的是， 在整个发酵中， VL3 种群数 量显著降低， 甚至无法达到两次种群倍增 (two population doublings)。上述数据与之前 关于酿酒酵母无法在厌氧条件下利用脯氨酸的报道一致 (Ingledew 等 1987)。
     鉴于仅有 PK-KR1 存在时， 葡萄汁中葡萄糖和果糖的量几乎没有变化， 然而却达到 了很高的种群数量， 我们推测该生物可同化其它可能供选择的碳源。我们进行了第二个营养素利用实验。这里， 我们使细胞饥饿以耗尽它们储存的碳和氮， 然后将 PK-KR1 的复制培 养物加入到相同的 YNB 合成培养基 ( 有脯氨酸或无脯氨酸 ) 中。这次， 为了确保接种后氧 气量尽可能少， 加入了少许固体 CO2( 干冰 )， 它的升华可清除烧瓶中的空气。将其在 28℃ 孵育 8 天， 经样品抽出 ( 大气中的空气不让进入 ) 进行种群数量检测， 估算每毫升的菌落形 成单位数。上述数据如图 16 所示。由于没有氮源或碳源， 预期 PK-KR1 在单独的 YNB 中不 会生长 ； 然而， 在培养基中加入脯氨酸， 使得第四天时种群从起始接种的 1.5×106ml-1 增长 到 2.2×107ml-1。这大约是种群数量的 14 倍。推论是， 生物质的增加通过脯氨酸的同化而 实现， 其既可作为能量源来进行分解代谢的活动 ( 碳源 )， 又可作为氮源来进行合成代谢的 生物质构建。
     尽管以上说明的本发明的实施方式是采用特定酵母菌株及酿酒商发酵工艺完成， 本领域技术人员应当了解本发明可采用其他多种形式完成。
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