技术领域
本发明属于天然药物化学领域，具体涉及一种从苦丁茶十大功劳叶中快速分离纯化绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷的方法。
背景技术
十大功劳叶系小聚科植物阔叶十大功劳(Mahonia bealei (Fort.) Carr.)的干燥叶，具有清热解毒、消炎止痛、燥湿泻火、清肝明目之功效。在秦岭以南各省还被广泛应用为苦丁茶。民间广泛用其作为主治头晕耳鸣、腰膝酸软、湿热泻痢、胃火牙痛、黄疸性肝炎等疾病。现代药理研究发现十大功劳具有抑菌、消炎、抗病毒、抗肿瘤、抗增殖及降血压等活性，是一种有开发价值的药用植物。
对十大功劳化学成分的研究多集中在其生物碱上，现未有文献报道从十大功劳叶中分离出绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷化合物，现有文献报道从其它中草药中分离纯化绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷等的方法常采用柱层析方法。柴兴云等[山银花中酚酸类成分研究，中国天然药物，2004年第6期]用95 %, 90 %,85 %, 70 %乙醇回流，乙酸乙酯萃取及硅胶柱，SephadexLH –20柱纯化分离的方法分离纯化，根据化合物的理化特征和光谱数据鉴定其结构，从山银花中分离到绿原酸等化合物。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷为分布在大部分高等植物植物中，万春鹏[东方肉穗草黄酮类化学成分研究，中国中药杂志, 2009年第2期 ]以70% 乙醇室温提取，醋酸乙酯溶剂萃取和大孔吸附树脂、SephadexLH-20，ODS及正相硅胶柱等色谱手段进行分离，分离出槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷。赵小亮等 [荷叶化学成分研究，中国中药杂志，2013年第5期 ]利用硅胶柱、大孔吸附树脂柱、Sephadex LH-20柱和制备薄层色谱法等分离手段，经理化常数和光谱分析从荷叶正丁醇部分中分离得到异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷。
这些成分通常采用反复的柱层析，操作复杂，耗时长，溶剂消耗量大，而且样品损失大，重复效果不够理想。
高速逆流色谱（High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC）是Ito等发明的一种新型的、连续高效的液 - 液分配色谱，是建立在一种特殊的动力学平衡现象——单向性流体动力平衡（HDES）体系之上的一种分离方法。与常规固-液色谱分离方法相比较，由于采用液体作为固定相载体，目标化合物在互不相容的两相由于分配系数的不同而得以分离，解决了传统固体载体样品死吸附、变性、峰形拖尾等问题，用高速逆流色谱法不仅使分离速度大为提高，且根据紫外吸收色谱图可良好重复收集样品，具有制备效率高、制备量大、费用低等优点，因而近年来日益受到人们的关注，已经广泛应用于生物医药、天然产物、环境分析、食品和化妆品等领域，特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技术。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有技术的不足，提供一种操作简便、综合成本低、分离量大、产品纯度高、样品损失小的高效快速从十大功劳叶中分离纯化绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷的方法。
本发明的技术解决方案是：从十大功劳叶中分离纯化绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷的方法包括以下工艺步骤：
(1) 十大功劳叶提取物的制备：十大功劳叶阴干、粉碎，纯乙醇为溶剂超声提取，固液比为 1 ：20 ，提取时间 2 h，过滤，滤渣重复处理 2 次；合并滤液并真空减压浓缩得十大功劳叶粗提物；
(2) 将步骤1中粗提物用水打散，分别用正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液过滤，减压浓缩分别得到正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取段，4°C冰箱保存备用；
(3) 单体的分离：采用正己烷 - 甲醇–乙酸乙酯水为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，分离柱转速为700 - 900 rpm，对十大功劳叶乙酸乙酯萃取段进行 HSCCC 分离，紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷。
步骤（3）所述的正己烷-甲醇-乙酸乙酯-水的体积比为1:1:1:1-1:8:1:8，优选1:5:1:5。
步骤（3）所述的流动相流速为2 mL/min。
本发明的优点是：十大功劳叶提取物分离后各馏分经 HPLC 检测纯度可达 85%以上，各馏分进一步提纯可得到 95%以上的纯品绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷，该方法适用于从十大功劳叶中一步纯化制备高纯度的绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷。稳定性好，操作简便。
附图说明
图 1 是高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶的色谱图；
图 2 是分离纯化得到的绿原酸的高效液相色谱图；
图 3 是分离纯化得到的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱图；
图 4 是分离纯化得到的异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱图。
具体实施方式
取自然阴干的十大功劳叶5.0 kg，粉碎，纯乙醇为溶剂超声提取，固液比为 1 ：20 ，提取时间 2 h，过滤，滤渣重复处理 2 次；合并滤液并真空减压浓缩得十大功劳叶粗提物；粗提物用水打散，分别用正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液过滤，减压浓缩分别得到正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取段，4°C冰箱保存备用。采用体积比 1:5:1:5 的正己烷 - 甲醇–乙酸乙酯水为溶剂体系，流动相（下相）流速为 2 mL/min，分离柱转速为 900 rpm，上相为固定相，对十大功劳叶乙酸乙酯萃取段进行 HSCCC 分离，紫外检测器在线监测，检测波长为 254 nm ，收集目标成分，馏分经减压浓缩干燥，得到相应高纯度化合物，如图1所示。
经 1H-NMR、13C-NMR 鉴定化学结构如下，
即所得单体化合物分别为绿原酸18.32mg、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷20.46 mg、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷28.36 mg，以色谱峰面积归一化法计算，纯度均高于97%，如图2-图4所示。